Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 53B, 2021 TỔNG HỢP VẬT LIỆU COMPOSITE GIỮA CELLULOSE VI KHUẨN VÀ NANO BẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NGUYỄN THỊ KIM ANH, LÂM HOÀNG ANH THƯ, PHẠM THỊ VÂN, ĐỖ HUYỀN KHÁNH NGÂN Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh nguyenthikimanh@iuh.edu.vn Tóm tắt Vật liệu kết hợp cellulose vi khuẩn nano bạc (AgNPs) nghiên cứu tổng hợp phương pháp in situ với mục đích tạo vật liệu có khả kháng khuẩn Chất khử Natri Borohydrua (NaBH4) Ethylene Glycol (EG) sử dụng để khử trực tiếp ion Ag+ thành hạt nano bạc gắn sợi cellulose tạo composite Sau khả kháng khuẩn composite khảo sát vi khuẩn đại diện cho Gram âm E coli, P aeruginosa Gram dương S aureus S epidermidis Kết cho thấy vật liệu tổng hợp chất khử NaBH4 EG có khả kháng chủng vi khuẩn Vật liệu composite giữ cellulose vi khuẩn (BC) nano bạc (BC/AgNPs) khả ứng dụng việc hỗ trợ điều trị vết thương tránh nhiễm khuẩn Từ khóa Composite, cellulose vi khuẩn, hiệu suất diệt khuẩn, in situ, nano bạc SYNTHESIS OF BACTERIAL CELLULOSE AND SILVER NANOPARTICLES COMPOSITE AND INVESTIGATE ITS ANTIBACTERIAL ACTIVITY Abstracts Composite of bacterial cellulose and silver nanoparticles (BC/AgNPs) that synthesized by in situ method is aimed to produce an antibacterial material Reducing agents Natri Borohydrua (NaBH4) and Ethylene Glycol (EG) were used to synthesis composite by directly reducing ion Ag+ to silver nanoparticles that integrated to cellulose fibers The composites were then investigated for their bactericidal performance to two Gram negative bacteria (E coli and P aeruginosa) and two Gram positive bacteria (S aureus and S epidermidis) The results of this study demonstrated that both composites synthesized by NaBH4 and EG could eliminate all bacteria strains The composite BC/AgNPs has potential application for wound treatment and prevention from bacterial infection Keywords Composite, bacterial cellulose, bactericidal performance, in situ, silver nanoparticles GIỚI THIỆU Composite hay gọi vật liệu tổng hợp, tạo cách kết hợp hai nhiều vật liệu có tính chất khác nhau, nhằm mục đích tăng thuộc tính vật liệu tổng hợp Cellulose tạo trình lên men vi khuẩn Gram âm Acetobacter xylinum, tạo sợi nano tỷ lệ khung hình cao, với mạng lưới xốp ba chiều (3D) [1] Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) có tính tương thích sinh học, khơng gây dị ứng, khơng độc hại sản xuất kích cỡ hình dạng khác [2] Do cấu trúc mạng sợi nano 3D độc đáo nó, BC cho thấy tính chất học tuyệt vời khả tạo khn, đặc biệt dạng ướt, khiến phù hợp để sản xuất theo hình dạng mong muốn Hệ thống sợi màng BC hình thành từ sợi nano xếp chặt chẽ không gian ba chiều, tạo thành hydrogel có bề mặt độ xốp cao Do tính chất ưa nước (99% thành phần nước), tính linh hoạt, khơng độc hại, tính tương thích sinh học tốt tính sẵn có rộng rãi, sử dụng rộng rãi lĩnh vực khác từ ngành công nghiệp thực phẩm giấy [3], [4] đến ứng dụng y sinh, liệu pháp da, vận chuyển thuốc, thuốc tái tạo, mạch máu nhân tạo sản phẩm chăm sóc vết thương Cellulose tổng hợp có bề mặt chứa nhiều nhóm hydroxyl nên có đặc tính giữ nước, phân rã sinh học khả biến đổi hóa học Cellulose vi khuẩn giống ma trận nano tự nhiên, sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp chỗ hạt nano bạc (AgNPs) cách khử hóa học [5] Nano bạc có đặc tính kháng khuẩn có khả bám vào thành tế bào vi khuẩn xâm nhập vào bên vi khuẩn Việc bám lên thành tế bào nano bạc gây thay đổi vật lý màng vi khuẩn, tổn thương màng, làm thủng màng dẫn đến chết vi khuẩn [6] Nano bạc có đặc tính kháng khuẩn © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 38 TỔNG HỢP VẬT LIỆU COMPOSITE GIỮA CELLULOSE VI KHUẨN VÀ NANO BẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU ngăn ngừa vi khuẩn phát sinh tới 99,99 %, lợi ích gấp nhiều lần so với sản phẩm kháng khuẩn khác [7] Nano bạc kết hợp với màng tế bào vi khuẩn gây bệnh, sau trực tiếp vào bên vi khuẩn nhanh chóng kết hợp với sulphydryl (-SH) enzyme chuyển hóa oxi để diệt chúng, để chặn đường hơ hấp q trình trao đổi chất vi khuẩn Ngoài ra, màng tế bào vi khuẩn có điện tích âm diện nhóm carboxyl, phosphate amino [8] Điện tích dương tạo lực hút tĩnh điện nano bạc màng tế bào tích điện âm vi sinh vật, tạo điều kiện gắn nano bạc vào màng tế bào [9] Composite kết hợp BC nano bạc (BC/AgNPs) tạo phương pháp khác Phương pháp vật lý hay gọi phương pháp ex situ phương pháp sử dụng vật liệu cellulose ngâm với nano bạc Trong đó, nano bạc chế tạo nhiều phương pháp khác (khử hóa học, quang hóa, điện hóa học [10],[11] Đây phương pháp khơng có phản ứng hóa học diễn vật liệu cellulose nano bạc Đối với phương pháp này, cellulose đóng vai trị chất mang Phương pháp vật lí tạo composite mà không cần sử dụng chất khử độc hại không mong muốn, thân thiện với môi trường, phù hợp với nhu cầu sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, liên kết hấp phụ tương đối yếu, nano bạc hấp phụ bề mặt vật liệu cellulose bị phần q trình sử dụng Nói cách khác, sản phẩm điều chế phương pháp có độ bền [12] Phương pháp khử hóa học hay biết tới phương pháp in situ Đây phương pháp mà hạt nano bạc tổng hợp trực tiếp BC phương pháp khử hóa học Phương pháp sử dụng muối kim loại hòa tan làm tiền chất, chất khử chất đồng ổn định để tránh kết tụ Tuy nhiên, phương pháp in situ sử dụng mà khơng cần thêm chất khử bên ngồi, hấp phụ ion kim loại bề mặt cellulose, sau khử thành nano bạc hợp chất hữu aldehyd nhóm carboxylic Cấu trúc độc đáo diện sợi cellulose ether hydroxyl nhóm tạo thành nanoreactor hiệu để tổng hợp nano bạc Các nhóm ether hydroxyl khơng có chức neo chặt ion kim loại vào sợi thông qua tương tác lưỡng cực ion, mà cịn khử muối bạc thơng qua tương tác tĩnh điện bề mặt [13], [14] Chuỗi polymer đóng vai trị quan trọng dẫn đến phân bố kích thước hẹp hình dạng xác định rõ cho cấu trúc nano kim loại Khả kháng khuẩn composite BC/AgNPs hình thành từ mối liên kết AgNPs BC báo cáo để tạo vật liệu tổng hợp từ tính kháng khuẩn Các ion bạc tương tác với nhóm thiol protein thành tế bào, phá vỡ hô hấp vi khuẩn ngăn cản trình vận chuyển chất qua màng tế bào [7] Composite BC/AgNPs chế tạo phương pháp in situ với chất khử triethanolamine (TEA) cho thấy khả ức chế mạnh mẽ vi khuẩn E coli, S aureus P aeruginosa [15] Nghiên cứu khác với mục tiêu tránh sử dụng chất khử độc hại mà thay D-gluconic acid cho thấy composite nano bạc kết hợp cellulose có khả ức chế S aureus E coli [16] Nghiên cứu sử dụng chất khử natri borohydrua (NaBH4) ethylene glycol để tổng hợp nano bạc in situ tạo composite khảo sát khả kháng khuẩn vật liệu tạo thành từ việc sử dụng chất khử NaBH4 chất có tính khử mạnh thường sử dụng Trong EG chất khử yếu lại độc tính, thân thiện với mơi trường so với NaBH4 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vi khuẩn Các chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu gồm chủng Gram âm Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Escherichia coli ATCC 25922 chủng Gram dương Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923 2.2 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn (BC) chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tổng hợp cung cấp từ Phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thuộc Trung tâm Nghiên cứu triển khai, Khu Công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh 2.3 Tổng hợp nano bạc (AgNPs) gắn với BC phương pháp in situ Phương pháp in situ chế tạo composite BC/AgNPs gồm giai đoạn: (1) Giai đoạn 1: Vật liệu cellulose ngâm dung dịch muối bạc để hấp thụ ion Ag+ sau ion Ag+ không gắn kết với sợi cellulose rửa trôi nước khử ion (2) Giai đoạn 2: Vật liệu Cellulose ngậm ion Ag+ cho vào dung dịch chất khử để khử Ag+ thành Ag © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP VẬT LIỆU COMPOSITE GIỮA CELLULOSE VI KHUẨN VÀ NANO BẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU 39 Hình Quá trình khử muối bạc tạo thành composite cellulose [17] 2.3.1 Chế tạo composite sử dụng chất khử EG/to Màng BC có kích thước 1x1cm ngâm dung dịch AgNO3 24 giờ, sau thả BC vào cốc có chứa EG chất bảo vệ polyvinyl pyrrolidone (PVP), gia nhiệt từ 150oC đến 200oC, khuấy từ 500-700vịng/phút 40 phút, sau tiến hành làm lạnh nhanh 20 phút Vớt màng bảo quản lạnh từ 2oC đến 4oC 2.3.2 Chế tạo composite sử dụng chất khử NaBH4 Màng BC có kích thước 1x1cm ngâm dung dịch AgNO3 24 giờ, sau thả BC vào cốc có chứa dung dịch NaBH4 (7 mL NaBH4 1% + 100ml H2O) làm lạnh Tiến hành khuấy từ 500-700v/p 60 phút Vớt màng bảo quản lạnh nhiệt độ từ 2oC đến 4oC 2.4 Kiểm tra đặc tính composite BC/AgNPs Tiến hành đông khô chân không mẫu màng BC mẫu màng BC/AgNPs nhiệt độ -50oC, sau khô trải mẫu nạp mẫu chụp SEM (F4800, Hitachi, Japan) tiến hành quan sát cấu trúc, hình dạng, phân bố hạt nano bạc sợi cellulose 4.1 Khảo sát khả kháng khuẩn composite BC/AgNPs phương pháp đặt màng đĩa thạch Vi khuẩn tăng sinh mơi trường lỏng thích hợp (P aeruginosa, S aureus sử dụng môi trường LB; C diptheria sử dụng môi trường BHI broth) đạt đến mật độ 105 CFU/ml nuôi cấy Hút 100ul cấy trải mơi trường thạch dinh dưỡng thích hợp Dùng kẹp gắp màng BC/AgNPs đặt màng lên bề mặt môi trường, mẫu đối chứng âm màng BC Ủ 37oC thời gian thích hợp Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cách đo bán kính vòng kháng khuẩn 2.4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn composite BC/AgNPs sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc Cho composite BC/AgNPs tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn mật độ 105 CFU/ml Sau mốc thời gian khảo sát, hút 100µl dịch khuẩn đem cấy trải mơi trường thạch dinh dưỡng thích hợp, ủ đĩa 37oC thời gian thích hợp từ 24-48 cho chủng vi khuẩn Với đối chứng âm màng BC Đánh giá hiệu suất diệt khuẩn composite cách đếm số khuẩn lạc đĩa Phương pháp đếm khuẩn lạc nhằm xác định số lượng khuẩn lạc lại mốc thời gian sau cho vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với composite BC/AgNPs Từ tính hiệu suất diệt khuẩn composite BC/AgNPs vi khuẩn dựa mật độ khuẩn mốc thời gian (CFU/ml) Cơng thức tính mật độ khuẩn (1): 𝐴 (1) 𝑁 (𝐶𝐹𝑈/𝑚𝑙) = 𝑉.𝐷𝑓 Trong đó: N mật độ khuẩn mẫu đem phân tích (CFU/ml); A số khuẩn lạc đĩa petri độ pha lỗng định; V thể tích mẫu cấy đĩa petri (ml); Df độ pha lỗng mẫu [18] Cơng thức tính hiệu suất diệt khuẩn (2) sau: © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 40 TỔNG HỢP VẬT LIỆU COMPOSITE GIỮA CELLULOSE VI KHUẨN VÀ NANO BẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU 𝑁−𝑁 𝑛 𝐻𝑛 (%) = ∗ 100% (2) 𝑁 Trong đó: Hn hiệu suất diệt khuẩn theo thời gian n (%); N mật độ khuẩn mẫu đối chứng (CFU/ml); Nn mật độ khuẩn theo mốc thời gian n (CFU/ml) [19] 2.5 Phương pháp xử lí số liệu Kết phân tích phần mềm Statgraphics Số liệu bán kính vịng kháng khuẩn tính trung bình lần lặp lại ANOVA sử dụng để so sánh khác biệt nhóm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chế tạo nano bạc gắn màng BC phương pháp khử in situ Composite cellulse vi khuẩn nano bạc (BC/AgNPs) tổng hợp phương pháp in situ với hai chất khử EG NaBH4 nồng độ nano bạc 10 ppm 25 ppm thể hình Hình Vật liệu BC gắn nano bạc phương pháp tổng hợp trực tiếp in situ a) BC đối chứng, b,c) Composite BC/AgNPs sử dụng chất khử NaBH4, d,e) Composite BC/AgNPs sử dụng chất khử EG,to Màu sắc BC/AgNPs 10ppm, 25ppm sử dụng chất khử EG BC/AgNPs 10ppm sử dụng chất khử NaBH4 có màu trắng đục giống với màu BC đối chứng ban đầu Tuy nhiên BC/AgNPs 25ppm sử dụng chất khử NaBH4 có màu vàng nhạt Composite BC/AgNPs sau chế tạo kiểm tra hình thái kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM) (Hình 3) Hình thái bề mặt màng BC đặc trưng mạng lưới dày đặc, gồm sợi cellulose nằm liền kề, đan xen chồng lên Hình 3b 3c thể hình thái bề mặt BC/AgNPs 10 ppm 25 ppm sử dụng chất khử EG, hạt nano bạc hình cầu có kích (từ 40 đến 69 nm) ổn định, đồng đều, phân bố bám vào màng BC Hình 3d 3e thể hình thái bề mặt BC/AgNPs 10 ppm 25 ppm sử dụng chất khử NaBH4, hạt nano bạc hình cầu có kích thước ( từ 19 đến 25 nm) ổn định đồng Ở composite BC/AgNPs sử dụng chất khử NaBH4 cho kích thước hạt nano bạc nhỏ so với BC/AgNPs sử dụng chất khử EG Các Ag+ liên kết với nhóm -OH cấu mạng lưới BC, NaBH4 chất khử mạnh, khử Ag+ thành Ag0, tốc độ tạo thành hạt bạc nhanh tạo số lượng lớn hạt bạc giàu mật độ điện tích tự nên Ag0 liên kết chặt chẽ với cấu trúc BC bảo vệ không gian cấu trúc chiều sợi BC từ làm giảm kết tụ nano bạc Các hạt nano bạc phân bố bám vào màng BC thể mạnh lực nano bạc BC, màng BC cho phép phân tử khuếch tán vào, hình thành sợi nano BC có cấu trúc liên kết bền chặt [20] © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP VẬT LIỆU COMPOSITE GIỮA CELLULOSE VI KHUẨN VÀ NANO BẠC BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU 41 A B C D E Hình Kết mẫu chụp SEM a) BC; b, c) Composite BC/AgNPs 10 ppm, 25 ppm sử dụng chất khử EG; d, e) Compiste BC/AgNPs 10 ppm, 25ppm sử dụng chất khử NaBH4 3.2 Khả kháng khuẩn màng BC/AgNPs đĩa thạch Đặt composite BC/AgNPs sử dụng chất khử NaBH4 đĩa thạch cấy trải vi khuẩn khơng thấy xuất vịng ức chế vi khuẩn vi khuẩn Trong đó, composite BC/AgNPs sử dụng chất khử EG có khả ức chế vi khuẩn tạo vịng kháng khuẩn vi khuẩn Bán kính vịng ức chế vi khuẩn composite có khác biệt lồi vi khuẩn (