Nghiên cứu tạo biofilm đa loài s aureus, e coli và c albicans trên đĩa 96 giếng khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN ĐẮC HÙNG NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM ĐA LOÀI S aureus, E coli VÀ C albicans TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THÂN ĐẮC HÙNG 1801277 NGHIÊN CỨU TẠO BIOFILM ĐA LOÀI S aureus, E coli VÀ C albicans TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Khắc Tiệp Nơi thực hiện: Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2023 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, người hướng dẫn em suốt trình làm nghiên cứu Thầy dẫn, định hướng cho em, động viên em để em hoàn thành tốt nhiệm vụ Một lần em xin chân thành cảm ơn thầy chúc thầy dồi sức khoẻ Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, HVCH Trần Thị Minh Thu, Đỗ Thị Huyền Thương quan tâm, giúp đỡ bảo em suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Khoa Công nghệ sinh học, môn Bào chế công nghiệp dược, Thực vật dược giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khoá luận Em xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Lan Anh, Khổng Thị Ngọc Anh, Vũ Thành Lập, Bùi Thị Mai Nhung, Bounthavy Phengsavatdy, Bùi Thị Phương Thanh, Mai Phương Thu, Nguyễn Thị Thu Trang bạn sinh viên nghiên cứu K74 môn Công nghệ sinh học dược đồng hành, hỗ trợ động viên em lúc khó khăn Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, nhà trường, thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội trang bị cho em kiến thức vô quý báu để giúp em tự tin vững bước tương lai Và cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người chỗ dựa tinh thần, động lực to lớn để em hồn thành tốt công việc Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Thân Đắc Hùng DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình trạng nhiễm khuẩn 1.2 Khái niệm biofilm Error! Bookmark not defined 1.3 Biofilm thất bại điều trị nhiễm khuẩn 1.4 Một số mơ hình biofilm ứng dụng nghiên cứu 1.4.1 Mơ hình biofilm in vitro 1.4.2 Mơ hình biofilm in vivo 1.4.3 Cách đánh giá tiêu thành phần biofilm 1.5 Tổng quan Staphylococcus aureus, Escherichia coli Candida albicans 1.5.1 Staphylococcus aureus 1.5.2 Escherichia coli 1.5.3 Candida albicans 10 1.6 Biofilm đa loài Staphylococcus aureus, Escherichia coli Candida albicans 11 1.6.1 Cơ chế hình thành biofilm đa loài 11 1.6.2 Biofilm đa loài Staphylococcuc aureus Candida albicans 13 1.6.3 Biofilm đa loài Staphylococcus aureus Escherichia coli 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù hợp để nuôi cấy tạo biofilm đa loài S aureus, C albicans 19 2.2.2 Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù hợp để ni cấy tạo biofilm đa lồi S aureus, E coli 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Chuẩn bị môi trường hoạt hóa chủng 19 2.3.2 Phương pháp cấy VSV thạch 20 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm đĩa 96 giếng 20 2.3.4 Phương pháp đánh giá tiêu biofilm 21 2.3.5 Phương pháp thống kê 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu tạo biofilm đa loài S aureus, C albicans 23 3.1.1 Lựa chọn môi trường phù hợp để tạo biofilm, đánh giá lượng VSV biofilm 23 3.1.1.1 Môi trường đánh giá lượng VSV biofilm đa loài S aureus, C albicans23 3.1.1.2 Môi trường phù hợp để tạo biofilm đa loài S aureus, C albicans 23 3.1.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy biofilm đa loài S aureus, C albicans 26 3.2 Biofilm đa loài S aureus, E coli 28 3.2.1 Lựa chọn môi trường phù hợp để tạo biofilm, đánh giá lượng VSV biofilm 28 3.2.1.1 Môi trường đánh giá lượng VSV biofilm đa loài S aureus, E coli 28 3.2.1.2 Lựa chọn số môi trường phù hợp cho ni cấy tạo biofilm đa lồi S aureus E coli 28 3.2.2 Lựa chọn thời gian điều kiện nuôi cấy tạo biofilm đa loài S aureus E coli 30 3.3 Bàn luận 33 KẾT LUẬN 36 KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT Môi trường antibiotic medium #3 Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ AM3 ATCC Antibiotic medium #3 American Type Culture Collection C albicans CFU Candida albicans Colony Forming Unit CV DMSO Crystal violet Dimethyl sulfoxide Tím tinh thể eDNA extracellular DNA ADN ngoại bào E coli Escherichia coli Đơn vị hình thành khuẩn lạc KS LBB Luria Bertani Broth MDK Minimum duration for killing Thời gian tối thiểu để kháng sinh tiêu diệt lượng xác định VSV MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 Polysaccharide intercellular adhesin Staphylococcus aureus kháng methicillin Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 Chất kết dính liên bào polysaccharide PBS PIA Kháng sinh Môi trường Luria Bertani Broth PNAG Poly-β-1,6-N-acetylDglucosamine RF Resorufin Resorufin S aureus Sab SDA TGN TSA TSB VRBA VSV Staphylococcus aureus Sabouraud Sabouraud dextrose agar Tụ cầu vàng Môi trường sabouraud Thạch Sabouraud dextrose TSB-glucose-NaCl Thạch Tryptic Soy Tryptic Soy lỏng Thạch Violet Red Bile Vi sinh vật Tryptic Soy Agar Tryptic Soy broth Violet Red Bile DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………… .15 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu …………………………………….………15 Bảng 2.3 Thành phần môi trường …………………………………………………… 18 Bảng 2.4 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu ……………………………………….19 Bảng 3.1 Lựa chọn môi trường chọn lọc VSV…………………………………………… 23 Bảng 3.2 Lựa chọn môi trường chọn lọc VSV…………………………………………… 29 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh biofilm [66], [5] Hình 1.2 Biofilm S aureus đĩa 96 giếng bề mặt miếng titan [50] Hình 1.3 Nhiễm khuẩn biofilm catheter cấy bụng chuột [55] Hình 1.4 Quá trình khử resazurin [17] Hình 1.5 Hình ảnh vi khuẩ n Staphylococcus aureus (CDC/Matthew J Arduino, DRPH) Hình 1.6 Hình ảnh vi khuẩn Escherichia coli [30] 10 Hình 1.7 Hình ảnh Candida albicans 11 Hình 1.8 Các trình giả thuyết hình thành biofilm đa lồi [3] 12 Hình 1.9 Các chế sơ để hình thành biofilm đa lồi 13 Hình Hình 2.1 Các VSV khác cấy khu vực tương ứng 20 Hình 2.2 Sự chuyển màu từ resazurin màu xanh sang resorufin màu hồng 22 Hình Hình 3.1 Giá trị đo quang chuyển hoá resaruzin biofilm 24h thực với môi trường 24 Hình 3.2 Tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường 24 Hình 3.3 Lượng VSV S aureus biofilm 24h (log10 CFU/ml) thực với mơi trường 25 Hình 3.4 Lượng VSV C albicans biofilm 24h (log10 CFU/ml) thực với môi trường 25 Hình 3.5 Giá trị đo quang chuyển hố resaruzin biofilm thời điểm điểu kiện khảo sát 26 Hình 3.6 Tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thực thời điểm điều kiện khảo sát 26 Hình 3.7 Lượng VSV S aureus biofilm (log10 CFU/ml) thời điểm điều kiện khải sát 27 Hình 3.8 Lượng VSV C albicans biofilm (log10 CFU/ml) thời điểm điều kiện khảo sát 27 Hình 3.9 Giá trị đo quang chuyển hố resaruzin biofilm thực với mơi trường 29 Hình 3.10 Tổng sinh khối biofilm 24h (độ hấp thụ với CV) thực với môi trường 29 Hình 3.11 Lượng VSV S aureus biofilm (log10 CFU/ml) môi trường khảo sát 29 Hình 3.12 Lượng VSV E coli biofilm (log10 CFU/ml) môi trường khảo sát 30 Hình 3.13 tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thừoi điểm điều kiện khảo sát 31 Hình 3.14 Lượng VSV S aureus biofilm (log10 CFU/ml) thời điểm điều kiện khảo sát 31 Hình 3.15 Lượng VSV E coli biofilm (log10 CFU/ml) thời điểm điều kiện khảo sát 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Biofilm cộng đồng vi sinh vật gồm vi khuẩn nằm chất bào chất cao phân tử ngoại bào chúng tạo ra, cấu tạo từ polycaccharid, DNA ngoại bào (eDNA) protein [19], [43] Cả vi khuẩn nấm có khả hình thành biofilm Tuy nhiên, các biofilm đa loài vi khuẩ n/nấ m đặc biệt khó kiể m soát và điều trị [25] Trong năm gần biofilm đa loài ngày ghi nhận nhiều trường hợp bệnh lý, vi khuẩn nấm phát đồng thời nhiều trường hợp nhiễm trùng [52] Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp Staphylococcus aureus Escherichia coli bám vào sợi nấm Candida albicans sử dụng chúng làm chất hỗ trợ phát triển [46], [65], [68] Sự tương tác giúp chúng tăng khả kháng kháng sinh đồng thời có khả gây độc tế bào làm tăng tỉ lệ tử vong [12], [71] Do mơ hình biofilm đa lồi thường tập trung chủ yếu việc tạo biofilm đơn loài, chưa thực phù hợp với thực tế nay, việc nghiên cứu tạo đánh giá biofilm đa loài cần thiết để áp dụng việc sàng lọc hoạt chất có hoạt tính kháng khuẩn để áp dụng vào thực tiễn Biofilm đa loài S aureus, E coli C albicans đĩa 96 giếng cơng cụ hiệu đại diện phần cho đa dạng mầm bệnh bệnh nhiễm trùng để sàng lọc nghiên cứu hoạt chất có khả kháng biofilm, với lợi vượt trội giá thành, tính đồng nhất, lượng mẫu, nhiều điều kiện thí nghiệm thực thời điểm Với mong muốn tạo biofilm đa loài vi sinh vật đĩa 96 giếng ứng dụng việc sàng lọc hoạt chất có hoạt tính kháng biofilm đa lồi vi khuẩn nấm điều kiện Việt Nam, thực đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tạo biofilm đa loài S aureus, E coli C albicans đĩa 96 giếng” với 02 mục tiêu sau: Lựa chọn môi trường, thời gian điều kiện phù hợp để nuôi cấy tạo biofilm đa lồi S aureus, C albicans Lựa chọn mơi trường, thời gian điều kiện phù hợp để nuôi cấy tạo biofilm đa loài S aureus, E coli So sánh mẫu có thay mơi trường hàng ngày khơng thay mơi trường hàng ngày, mẫu có thay mơi trường ngày có: Hình 3.13 tổng sinh khối biofilm (độ hấp thụ với CV) thừoi điểm điều kiện khảo sát Tổng sinh khối( CV) tốt thời điểm 48 72h, ngược lại với thời điểm thời điểm 96h có giá trị CV hơn, khác biệt thời điểm 48h 96h có ý nghĩa thống kê với p