NGHIÊN cứu TỔNG hợp NANO CHITOSAN BẰNG sử DỤNG AXIT METHACRYLIC và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG nấm COLLETOTRICHUM MUSAE PHÂN lập từ QUẢ CHUỐI

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO CHITOSAN BẰNG SỬ DỤNG AXIT METHACRYLIC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM MUSAE PHÂN LẬP TỪ QUẢ CHUỐI Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, *, Nguyễn Thị Tố Quyê

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO CHITOSAN BẰNG SỬ DỤNG AXIT

METHACRYLIC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM

COLLETOTRICHUM MUSAE PHÂN LẬP TỪ QUẢ CHUỐI

Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, *, Nguyễn Thị Tố Quyên2, Trần Thị Mai1,

Nguyễn Duy Lâm1

1

Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch,

60 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội

2

Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

*

Email: minhnguyet.viaep@gmail.com

Đến Tòa soạn: 15/09/2015, Chấp nhận đăng: 5/11/2015

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu nhằm hoàn thiện quy trình tổng hợp nano chitosan bằng sử dụng

axit methacrylic và đánh giá hoạt tính kháng nấm Các hạt nano chitosan đã được xác định kích

thước, điện thế zeta, quang phổ hồng ngoại (FT-IR) và phổ TEM Kết quả nghiên cứu cho thấy

kích thước hạt và khối lượng sản phẩm tạo ra phụ thuộc nhiều vào nồng độ chất xúc tác tạo phản

ứng K2S2O8 Khi tăng lượng K2S2O8 bổ sung trong quy trình tổng hợp đến một lượng nhất định

sẽ tạo ra nano chitosan có kích thước đồng đều và làm tăng tỉ lệ thu hồi, nhưng khi tiếp tục tăng

lượng chất xúc tác sẽ làm tăng kích thước của hạt, đồng thời làm giảm độ phân tán của nano

chitosan Nano chitosan tổng hợp được có kích thước 63 nm, có dạng hình cầu và đồng nhất,

phân bố đồng đều Thử nghiệm đánh giá tác dụng kháng nấm của nano chitosan được tiến hành

để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho thấy bào tử nấm Colletotrichum musae

phân lập từ quả chuối tiêu bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ nano chitosan 1 %

Từ khóa: Colletotrichum musae, chuối, MIC, nano chitosan, tổng hợp

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong số các loại vật liệu nano có nguồn gốc sinh học, nhất là các loại polysachrit thì nano

chitosan được quan tâm nghiên cứu nhiều nhờ chúng có những tính chất nổi bật so với chitosan

thường Một số tính chất đặc trưng của nano chitosan đã được khẳng định như khả năng tan trong

nước, tính kháng vi sinh vật cao hơn, khả năng tạo màng, tính kết dính sinh học, tính thâm nhập, khả

năng gia cường khi phối chế trong vật liệu khác [1, 2] Chitosan nguyên dạng do tính chất của các

cation polymer nên có thể tương tác với các phân tử tích điện âm và polyme Tuy nhiên, các tính chất

này được quyết định chủ yếu bởi kích thước của hạt nano [2] Trong sản xuất bao bì thực phẩm, khi

bổ sung nano chitosan có kích thước hạt phù hợp cho phép thay đổi tính thấm hơi nước của màng

bao gói đáng kể [1] Cho đến nay, quy trình tổng hợp nano chitosan phổ biến vẫn là sử dụng tripolyphosphate (TTP) [2, 3] Tuy nhiên, với quy trình này khó thu được các hạt nano có kích thước dưới 100 nm, thường dao động trong khoảng 175 - 600 nm và hiệu suất thu hồi thấp [3] Để kiểm soát hạt nano chitosan có kích thước  100 nm, việc tổng hợp thông qua phản ứng trùng hợp với axit metacrylic (MAA) được đánh giá có nhiều ưu điểm hơn [3,4] Cho đến nay, việc sử dụng chất khơi mào phản ứng nhằm tạo ra khả năng đạt được kích thước hạt nano nhỏ nhưng vẫn có tỉ lệ thu hồi cao cũng như duy trì khả năng kháng vi sinh vật hiệu quả còn chưa được nghiên cứu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu này nhằm tổng hợp nano chitosan bằng sử dụng axit metacrylic dưới tác động của một số điều kiện chất xúc tác tạo phản ứng K2S2O8 đến kích thước hạt nano, hiệu quả thu hồi sản phẩm và đánh giá khả năng kháng nấm gây bệnh thán thư trên quả chuối của hạt nano CS-PMAA tổng hợp được

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và tổng hợp nano chitosan

Chitosan (CS) có trọng lượng phân tử 70 kDa, độ đề axetyl hóa là 90 % được mua từ công

ty TNHH MTV Chitosan Việt Nam Kali persulfate (K2S2O8) (Trung Quốc) và axit methacrylic (MAA) (Merk, Đức) Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar, Thái Lan)

Nano CS-PMAA thu được bằng cách trùng hợp MAA trong dung dịch CS, theo đó CS được phân tán trong dung dịch axit MAA nồng độ 0,5 % trong 12 giờ với khuấy từ Nồng độ CS được

sử dụng trong tổng hợp là 0,8 % Sử dụng K2S2O8 ở 3 nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mmol bổ sung vào dung dịch CS-MAA tại 70 ◦C trong 1 giờ Khi hình thành nano CS-PMAA, hỗn hợp được làm lạnh trong nước đá Để thu hồi nano chitosan tiến hành ly tâm trong 30 phút ở 4000 rpm Hòa tan lại nano chitosan trong nước cất hai lần [3]

2.2 Xác định các đặc tính

Xác định phổ FT-IR của CS và nano CS-PMAA bằng máy quang phổ Perkin-Elmer (model Paragon 1000) trong khoảng bước sóng 4000 đến 400 cm-1 Các hạt nano CS-PMAA được đông khô trong nitơ lỏng và đông khô Đo kích thước hạt và điện thế zeta bằng thiết bị Malvern Xác định TEM bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Philips CM200

2.3 Hoạt tính kháng nấm C musae được phân lập từ quả chuối

Nấm C musae được phân lập từ mẫu quả chuối bị nhiễm bệnh thán thư Việc phân lập,

quan sát và xác định nấm được thực hiện bởi Viện 69 (Bộ Tư lệnh Lăng) Hoạt tính kháng nấm của PMAA được đánh giá dựa theo phương pháp của Guo cs., (2007) [5] Nồng độ NCS-PMAA được bổ sung vào trong môi trường PDA đã được thanh trùng tương ứng là 0,5; 0,75;

0,1; 1,25 và 1,5 % Dịch nấm C.musae được đặt vào giữa mỗi đĩa và được nuôi cấy trong điều

kiện nhiệt độ 30 oC Thời gian cách nhau giữa hai lần đo kích thước vòng phát triển của nấm là

24 giờ Các thí nghiệm được đánh giá khi nấm phát triển đến mép của đĩa Chỉ số kháng nấm (AI) được tính dựa trên phương trình AI (%) = (1- D1/D2) x 100, trong đó D1 là kích thước của khuẩn lạc trong đĩa thí nghiệm, D2 là kích thước của khuẩn lạc trong đĩa đối chứng [5] Kết quả thu được là trung bình cộng của 3 mẫu lặp lại

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp hạt nano CS-PMAA

Các phân tử CS trong dung dịch ở dạng các cation poly điện ly và có xu hướng giảm bớt sự hình thành các cấu trúc nhờ tương tác tĩnh điện với MAA dẫn đến sự hình thành của CS-PMAA hạt nano thông qua các phản ứng trùng hợp của MAA khi có mặt của CS Khi phản ứng trùng hợp MAA diễn ra, xuất hiện các liên kết nội phân tử và ngoại phân tử giữa các nhóm chức carboxyl PMAA và nhóm amin tích điện dương CS, hình thành nên các hạt nano CS-PMAA Kết quả thu được phù hợp với kết quả nghiên cứu tạo hạt nano CS-PMAA của Moura [3] Bên cạnh đó cũng xảy ra các liên kết khác góp phần tạo ra sự ổn định cấu trúc CS và PMAA, ví dụ như liên kết kỵ nước giữa các nhóm methyl của PMAA [6]

Hình 1 trình bày hình ảnh cấu trúc của các hạt nano CS-PMAA thu được Phức tỉ lệ phân

tử (trong đơn vị monomer) của nCOOH / nNH2 là 1,2:1 (0,8 % khối lượng) [3]

STT K 2 S 2 O 8 (mmol) Tỉ lệ thu hồi (%)

Hình 1 Sơ đồ hình thành hạt nano CS-PMAA.

Bảng 1 thể hiện tỉ lệ thu hồi nano CS-PMAA khi thay đổi nồng độ chất khơi mào phản ứng trong phản ứng trùng hợp K2S2O8 có vai trò ảnh hưởng khá lớn đến hiệu suất thu hồi sản phẩm cũng như kích thước hạt CS-PMAA, tại nồng độ 0,2 mmol K2S2O8, tỉ lệ sản phẩm thu hồi rất thấp (12,45 %), tăng nồng độ K2S2O8 lên giá trị 0,4 và 0,6 mmol K2S2O8 đã làm tăng đáng kể tỉ lệ thu hồi sản phẩm lên tương ứng là 34 % và 42,53 %, kích thước không thay đổi ở giá trị 60 nm Khi tăng nồng độ K2S2O8 lên nồng độ 0,8 mmol thì tỉ lệ thu hồi tăng lên 44,45 % và kích thước hạt

đo được có giá trị là 140,8 nm Điều này chỉ ra việc khi điều chỉnh nồng độ K2S2O8 đã làm tăng tỉ

lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA mà không làm tăng kích thước Tuy nhiên tiếp tục tăng tỉ lệ bổ sung chất khơi mào lên quá giới hạn 0,8 mmol sẽ làm tăng kích thước của hạt nano CS-PMAA Kết quả nghiên cứu giúp việc sản xuất CS-PMAA sẽ thu hồi được tỉ lệ sản phẩm là 42,53 % cao hơn so với kết quả nghiên cứu đã công bố của Moura (2008) là 30,08 % [3]

3.2 Phân tích cấu trúc hóa học của hạt nano bằng phổ hồng ngoại FT-IR

Hình 2 và 3 trình bày phổ hồng ngoại của CS và CS-PMAA được chuẩn bị tại các nồng độ chất khơi mào phản ứng khác nhau Trên phổ hồng ngoại, mối liên kết giữa CS và PMAA đã được làm sáng tỏ Theo các nghiên cứu đã công bố, phổ CS đưa ra đặc điểm pick tại 3456 cm−1

có nghĩa chỉ ra các liên kết của nhóm NH2 và nhóm OH, tại pick 1654 là liên kết của nhóm C=O của amid I, pick 1081-1020 chỉ dao động của liên kết C-O, pick 619 chỉ các liên kết trong mạch vòng [2]

Trên Hình 2 biểu diễn phổ hồng ngoại của CS-PMAA có thể dễ dàng quan sát thấy sự vắng

Bảng 1 Tỉ lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA khi

thay đổi nồng độ chất khơi mào phản ứng

mặt của pick của nhóm 1657, thay vào đó là hai pick 1635 và 1518 tương ứng với nhóm COO

-và nhóm NH3

+, điều này thể hiện sự tương tác ion giữa PMAA và CS trong sự hình thành hạt nano CS-PMAA Pick 1748 và 1237 cm2 (C=O) chứng minh sự có mặt của PMAA trong thành phần của hạt nano CS-PMAA Khi nồng độ sinh tổng hợp của CS-PMAA tăng lên dẫn đến cấu trúc hóa học của CS-PMAA thay đổi cùng với việc giảm băng băng tần 1748 và 1237 cm2 đồng thời tăng băng tần tại 1635 và 1518, cũng có nghĩa nồng độ PMAA giảm xuống và tương tác ion giữa CS và PMAA tăng lên

Hình 2 Phổ hồng ngoại của CS-PMAA được tạo ở

nồng độ K2S2O8 0,6 mmol.

Hình 3 Phổ hồng ngoại của CS-PMAA được tạo ở

nồng độ K2S2O8 0,8 mmol

Tại Hình 3, khi bổ sung 0,8 mmol K2S2O8 vào phản ứng trùng hợp, phổ hồng ngoại của CS-PMAA vắng mặt băng tần 1748 và 1237, điều này chứng tỏ khi tăng nồng độ chất khơi mào phản ứng vượt quá ngưỡng đã khiến toàn bộ CS được đưa vào tổng hợp thành CS-PMAA trong

sự thiếu PMAA, đây là lý do cho kích thước hạt CS-PMAA tại nồng độ này cao hơn các nồng độ

từ 0,2 mmol ÷0,6 mmol (140 nm) [3]

3.3 Kích thước của hạt nano và thế zeta thu được

Kết quả trên Bảng 2 chứng minh rõ nét

việc tăng nồng độ chất khơi mào vượt quá

ngưỡng giới hạn thì sẽ làm tăng kích thước

hạt đồng thời cũng làm tăng thế zeta Kích

thước hạt không khác nhau tại nồng độ

K2S2O8 dao động từ 0,2 ÷0,4 mmol (60nm)

Tuy nhiên, khi tăng nồng độ K2S2O8 lên đến

0,8mmol thì kích thước hạt đã tăng đáng kể ở

mức 140nm Thế zeta tại các nồng độ 0,2;

0,4; 0,6 và 0,8 mmol thu được tương ứng là

42,4 mV; 42,4 mV; 40,4 mV; 47,5 mV Thế

zeta càng lớn thì hệ keo tụ càng bền, càng khó kết tủa Ở đây, các hạt CS-PMAA đều thu được điện tích dương và khá lớn ( 42 mV), vì vậy các hạt CS-PMAA bền vững trong dung dịch và không tạo tủa trong thời gian bảo quản Qua kết quả có thể thấy, tại nồng độ K2S2O8 là 0,6 mmol không chỉ làm tăng tỉ lệ thu hồi lên 30,08 % mà còn duy trì được kích thước và thế zeta của hạt CS-PMAA

Bảng 2 Tính chất hạt NS-PMAA tại các nồng độ

K2S2O8 khác nhau.

Nồng độ K2S2O8

(mmol)

Kích thước hạt (nm)

Thế zeta (mV)

3.4 Phân bố hạt trên kính điện tử truyền quang (TEM)

Hình 4 thể hiện sự phân bố và kích thước đo được của hạt CS-PMAA Việc đo TEM được

thực hiện trên các mẫu hạt nano được làm khô từ những hạt trong dung dịch đồng nhất ban đầu,

các hạt nano chitosan được tạo thành với nồng độ chất khơi mào phản ứng là 0,6 mmol Tất cả

các phân tích đều cho thấy kích thước và sự phân bố hạt nano CS-PMAA thu được khá đồng

nhất được thể hiện trên Hình 4

K 2 S 2 O 8 0,6 mmol

3.5 Hoạt tính kháng nấm C musae được phân lập từ quả chuối của NCS-PMAA trên môi

trường nuôi cấy PDA

Bảng 3 Chỉ số kháng nấm C musae gây bệnh thán thư trên quả chuối của nano CS-PMAA trên

môi trường thạch

Ghi chú: -: nấm phát triển mạnh mẽ

Đối chứng

0 % CS-PMAA

Công thức 1 0,5 % CS-PMAA

Công thức 1 0,75 % CS-PMAA

Công thức 1 1,0 % CS-PMAA

Công thức 1 1,25 % CS-PMAA

Hình 5 Hoạt tính kháng nấm C musae được phân lập từ quả chuối của NCS-PMAA trên

môi trường nuôi cấy PDA

Hình 4 Hình ảnh CS-PMAA bằng kính hiển vi điện tử tại các nồng độkhác nhau.

Kết quả Bảng 3, Hình 5 trình bày chỉ số AI (%) cho mỗi công thức tại thời điểm cuối cùng

của thí nghiệm (7 ngày) cho thấy khi tăng nồng nano CS-PMAA trong môi trường đĩa thạch là

0,0 %; 0,5 %; 0,75 %; 1 % và 1,25 % có vòng phát triển của nấm giảm dần tương ứng là 87 mm

(AI = 0 %); 55,2 mm (AI = 36,5 %); 29,7 mm (65,9 %); 0 mm (100 %) và 0 mm (100 %)

Như vậy tại nồng độ nano CS-PMAA là 1% đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm C musae

gây bệnh thán thư trên quả chuối

4 KẾT LUẬN

Đã hoàn thiện được quy trình tổng hợp nano chitosan bằng sử dụng axit methacrylic và

đánh giá hoạt tính kháng nấm Việc bổ sung nồng độ K2S2O8 từ 0,2 mmol lên 0,6 mmol đã làm

tăng tỉ lệ thu hồi sản phẩm CS-PMAA từ 12,45 % lên 42,53 % Các kết quả về cấu trúc hóa học,

kích thước hạt và thế zeta đã được xác định Kết quả chỉ ra rằng các hạt nano thu được là khá ổn

định Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thán thư của quả chuối C musae của NS-PMAA đạt

100 % khi bổ sung 1 % nồng độ NS-PMAA trong điều kiện môi trường thạch PDA

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Duy Lâm - Ứng dụng công nghệ nano trong chế biến, vật liệu bao bì và quản lý

chất lượng thực phẩm Tạp chí Khoa học và Công nghệ 52 (5C) (2014) 406-413

2 Weiss J., Takhistov P., McClements J - Functional materials in food

nanotechnology, J Food Science 71 (2006) 107-116

3 Moura M.R., Aouada F A., Mattoso L.H.C - Preparation of chitosan nanoparticles using

methacrylic acid, J Colloid Interface Sci 321 (2) (2008) 477-483

4 Janes K A., Alonso M J - Depolymerized chitosan nanoparticles for protein delivery:

Preparation and characterization, J Appl Polym Sci 88 (2003) 2769-2776

5 Guo Z., Xing R., Liu S., Zhong Z., Ji X., Wang L., Li P - The influence of the cationic of

quaternized chitosan on antifungal activity, Int J Food Microbiol 118 (2007) 214–217

6 de Vasconcelos C L., Bezerril P M., dos Santos D E S., Dantas T N C., Pereira M R.,

Fonseca J L C - Effect of molecular weight and ionic strength on the formation of

polyelectrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan,

Biomacromolecules 7 (2006) 1245-1252

ABSTRACT

SYNTHESIS OF NANO CHITOSAN BY USING METHACRYLIC AXIT AND

EVALUATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST COLLETOTRICHUM MUSAE

ASSOCIATED WITH BANANA ANTHRACNOSE Nguyen Thi Minh Nguyet1,*, Nguyen Thi To Quyen2, Tran Thi Mai1, Nguyen Duy Lam1

1

Vietnam Institute of Agricultural Engineering and Postharvet Technology,

60 Trung Kinh, Trung Hoa, Cau Giay, Hanoi

2

Hanoi Open University, 301 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi

Email: minhnguyet.viaep@gmail.com

Purpose of this work is to improve the preparation of chitosan nanoparticles by using methacrylic acid and to evaluate their antifungal activity Chitosan nanoparticles were characterized

by particle size analyzis, zeta-potential, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and transmission electron microscopy (TEM) Results showed the particle size and recovery rate were dependent on the K2S2O8 concentration used as catalyst Recovery rate increased when K2S2O8

concentration from 0.2 mmol to 0.6 mmol with nanoparticles sizes as small as 63 nm were achieved, that can be extremely important for several applications The nanoparticles obtained presented a very homogeneous morphology showing a quite uniform particles size distribution and a rather spherical

shape Antifungal activity was evaluated against C musae by determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) in vitro Results showed that the antifungal activity reached almost

100 % at concentration of nano CS-PMAA that is 1 % (w/w)

Keywords: banana, Colletotrichum musae, CS-PMAA, nanochitosan, synthesis