BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯƠNG LINH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI DẰU LÊN QUÁ TRÌNH TẠO CHÉ PHAM PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI 2022[.]
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯƠNG LINH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI DẰU LÊN QUÁ TRÌNH TẠO CHÉ PHAM PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯƠNG LINH 1701315 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI DẦU LÊN QUÁ TRÌNH TẠO CHÉ PHẨM probiotic chứa Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân HVCH Trần Hồng Việt Nơi thực hiện: Bộ mơn Cơng nghiệp Dược HÀ NỘI - 2022 LÒI CẢM ƠN Với kính trọng lịng biết on sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Đàm Thanh Xuân HVCH Trần Hồng Việt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Khắc Tiệp thầy Ths Lê Ngọc Khánh, giảng viên môn Công nghiệp Dược, thầy hỗ trợ giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin cảm ơn anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện, hồ trợ thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, người thân tất bạn bè đà động viên, khích lệ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Lê Thị Phương Linh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỪ VIẾT TẤT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIÊU ĐỒ Trang ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG I TÓNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic 1.1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật probiotic 1.1.3 Tác dụng probiotic 1.1.4 Phân loại probiotic 1.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điếm hình thái, sinh lí, điều kiện ni cấy 1.2.2 Vai trò Lactobacillus acidophilus sức khỏe người 1.3 Dạng bào chế hỗn dịch dầu chứa probiotic .6 1.3.1 Một số dạng bào chế chứa probiotic 1.3.2 Hỗn dịch dầu chứa vi sinh vật probiotic 1.3.3 Yêu cầu chất lượng hỗn dịch 13 CHƯƠNG II ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng 14 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 15 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cúu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu .16 2.2.1 Khảo sát số loại dầu sử dụng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus 16 2.2.2 Đánh giá số tiêu chất lượng chế phấm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus bào chế 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp tiệt khuân dụng cụ, thiết bị, môi trường nuôi cấy 17 2.3.2 Phương pháp tạo hỗn dịch dầu chứa VSV 17 2.3.3 Phương pháp pha loãng liên tục định lượng vi sinh vật chế phẩm 17 2.3.4 Phương pháp soi tiêu kính hiển vi 19 2.3.5 Phương pháp đánh giá kích thước tiều phân hỗn dịch 19 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KÉT QƯÃ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát số loại dầu sử dụng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus 20 3.1.1 Đánh giá độ lắng bột vsv phân tán vsv vào số loại dầu 20 3.1.2 Khảo sát tỷ lệ phối hợp loại dầu ảnh hưởng đến độ ốn định vật lý hỗn dịch dầu chứa vsv 21 3.1.3 Khảo sát thời gian nhỏ giọt chế phẩm hỗn dịch dầu chứa vsv 27 3.2 Đánh giá số tiêu chất lưọng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus bào chế 31 3.2.1 Đánh giá khả phân tán vsv chế phẩm hồn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus 31 3.2.2 Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót chế phẩm hỗn dịch dầu chứa vsv 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẤT BA (Biogenic amine) Amin sinh hoc • CFU (Colony- Forming Units) số đơn vị khuẩn lac FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức nông lưong giới GIT (Gastrointestinal tract) Đường tiêu hóa GRAS (Generally recognized as safe) Được cơng nhận chung an tồn HDL (High density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng cao IBS (Irritable bowel syndrome) Hội chứng ruột kích thích KTTP Kích thước tiểu phân L acidophilus Lactobacillus acidophilus LAB (Lactic acid bacteria) Vi khuẩn lactic LDL (Low density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng thấp MCT (Medium chain triglycerides) Chuỗi triglycerid trung bình MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuấn PBS (Phosphate buffered saline) Dung dịch đệm phosphat PDI (Polydispersity index) Chỉ số đa phân tán PG Propyl gallat TBHQ Tert-butylhydroquinon vsv Vi sinh vật • WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Trang STT Tên Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Thời gian lắng vi sinh vật số loại dầu 21 Bảng 3.2 Tỉ lệ phối hợp loại dầu mẫu hỗn dịch 23 Bảng 3.3 Kết đo mức độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch 23 với tỷ lệ phối hợp MCT khác theo thời gian Bảng 3.4 Kết thời gian nhỏ giọt mẫu hỗn dịch với tỷ lệ phối 28 hợp MCT khác Bảng 3.5 KTTP trung bình PDI số mẫu hỗn dịch dầu 34 Bảng 3.6 Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót số mẫu 38 hỗn dịch dầu theo thời gian Bảng 3.7 Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót mẫu hồn dịch HD ĐN bảo quản 0-5°C sau 14 ngày 40 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIẾU ĐỊ STT Tên Hình 1.1 Hình ảnh Lactobacillus acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Sản phẩm cốm vi sinh SuperBros Hình 1.3 Sản phẩm viên nang optibac Hình 1.4 Sản phẩm hỗn dịch nước Enterogermina Hình 1.5 Sản phẩm hỗn dịch dầu Biogaia Hình 1.6 Cấu trúc hóa học Aerosil 12 Hình 1.7 cấu trúc hóa học Nhơm tristearat 13 Hình 3.1 Hình ảnh mức độ lắng số mẫu hỗn dịch dầu với tỷ lệ 24 Trang phối hợp MCT khác thời điếm khác Hình 3.2 Hình ảnh lọ nhở giọt 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu thị thời gian nhỏ giọt mẫu hỗn dịch với tỷ 29 lệ phối hợp MCT khác Hình 3.4 Hình ảnh trạng thái phân tán mẫu hỗn dịch dầu với tỷ 32 lệ phối họp MCT khác Hình 3.5 Hình ảnh số mẫu hỗn dịch dầu vật kính 40x 33 Hình 3.6 Đồ thị biểu thị phân bố KTTP số mẫu hổn dịch dầu 34 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus mọc đĩa 37 thạch MRS mẫu HD sau bào chế Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật sống sót mẫu hỗn dịch dầu theo thời gian 39 ĐẶT VẨN ĐỀ Hoạt động tiêu hóa người có mối quan hệ mật thiết với cân hệ vi sinh đường ruột, việc đưa lồi vi khuẩn có lợi vào đường tiêu hóa lựa chọn quan tâm đế thiết lập lại trạng thái cân vi sinh vật ngăn ngừa bệnh tật [23] Các nghiên cứu khoa học chứng minh vi sinh vật probiotic đem lại nhiều lợi ích cho người ngăn ngừa bệnh đường ruột, cải thiện hệ thống miễn dịch, cải thiện dung nạp lactose cân hệ vi sinh vật đường ruột, giảm thiểu tiêu chảy không với đối tượng người lớn mà trẻ nhỏ [42] Tuy nhiên việc sản xuất chế phẩm probiotic gặp nhiều khó khăn vi sinh vật bị ảnh hưởng bất lợi yếu tố môi trường pH, nhiệt độ, enzym tiêu hóa, muối mật [6] Nhiều phương pháp bào chế nghiên cứu để giảm thiểu ảnh hưởng yếu tố đến vi khuẩn probiotic, số dạng bào chế hỗn dịch dầu Tuy có nghiên cứu dạng chế phẩm chứa vi sinh vật nên để đảm bảo chế phẩm có tính ổn định cao đem lại tác dụng mong muốn cho người sử dụng cần nhiều nghiên cứu khảo sát quy trình sản xuất chế phẩm hồn dịch dầu chứa probiotic Từ đó, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng số loại dầu lên trình tạo chế phẩm probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát số loại dầu sử dụng chế phấm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus Đánh giá số tiếu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus bào chế CHƯƠNG I: TỐNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic Thuật ngữ “probiotics” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa “vì sống” [35] Năm 1965, thuật ngữ “probiotic” sử dụng để mồ tả chất tiết sinh vật có tác dụng kích thích phát triển sinh vật khác Năm 2002, hội đồng chuyên gia ủy quyền FAO WHO định nghĩa probiotic “vi sinh vật sống” dùng với lượng vừa đủ mang lại lợi ích cho sức khỏe vật chủ [23] Một khái niệm khác prebiotic, định nghĩa thành phần thực phẩm khơng tiêu hóa có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ cách kích thích có chọn lọc phát triển vi khuẩn đường ruột, cải thiện sức khỏe vật chủ Cả probiotics prebiotics kết hợp với tạo thành Synbiotics, giúp cải thiện tồn vi khuấn đường tiêu hóa (GIT), giúp tác dụng chúng tăng lên đáng kể [23] Nồng độ vsv probiotic cần thiết để đạt hiệu lâm sàng báo cáo > 106 CFU/ml ruột non > o8 CFU/g ruột già Liều lượng probiotic thường sử dụng người 107-109 CFƯ/ngày [31] Probiotic tìm thấy số thực phẩm chất bổ sung (có thể tự nhiên thêm vào giai đoạn chế biến) Các thực phẩm gồm sữa chua, đồ uống từ sữa chua, sữa lên men chưa lên men, đậu tương lên men, đồ uống đậu nành số nước hoa [7] 1.1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật probiotic Vi sinh vật muốn công nhận probiotic cần phải đáp ứng số tiêu chuân sau: - Có nguồn gốc rõ ràng, chủng (có định danh xác, mang đặc điểm di truyền ổn định) [3] - Khơng gây bệnh cho vật chủ, khơng sinh độc tính (thuộc nhóm GRAS an tồn lành tính, khơng liên quan đến bệnh tật, không mang gen đề kháng kháng sinh truyền được) [10] - Có đặc tính probiotic, sinh sản phẩm với hiệu suất cao (có khả sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả phát triển đường ruột, có hiệu có lợi đáng tin cậy chứng minh khoa học) [3] Kết ► Trạng thái phân tán mẫu sau lắc Hình 3.4: Hình ảnh trạng thái phân tán mẫu hỗn dịch dầu vói tỷ lệ phối họp MCT khác a) Các mâu phôi hợp dâu hướng dương MCT (mâu HD) sau khỉ lăc lên * ' \ ** ' b) Các mâu phôi hợp dâu hướng dương MCT (mâu HD) sau lăc đê yên phút 01 234 56 c) Các mâu phôi hợp dâu đậu nành MCT (mâu ĐN) sau lăc lên 32 d) Các mâu phôi hợp dâu đậu nành MCT (mâu ĐN) sau lăc đê yên phút Chú thích: So đánh lọ tương ứng với so thứ tự mẫu ghi bảng 3.2 Mầu soi kính hiển vi: Các mẫu Biogaia, ĐN 1, HD HD (tỷ lệ phối hợp dầu nêu bảng 3.2) •%* a) Mâu Biogaia b) Mầu ĐN1 c) Mầu HD d) Mau HD Hình 3.5: Hình ảnh số mẫu hỗn dịch dầu dưói vật kính 40x 33 24- • 22- 22- Counts ■ ] Gaussian Fit Blounts’ 20 AV Gaussian Fit B’Counts" 20- Counts 11- 18- 16- ■ IS- • ?”• o 10 ■ I ,J u 10- • 04 &n Centers Bin Centers b) Mau ĐN Ỉ a) Mâu Biogaia M4 30• 21SI- Counts ■ Gaussian Fit BXounts* Counts Gaussian Fit ĐXounts' 60- 24- 2220Is' Iĩ r o 23- 1210- 04 10 30 Bin Centers Bin Centers d) Mau HD c) Mau HD Hình 3.6: Đồ thị biểu thị phân bố KTTP số mẫu hỗn dịch dầu Bảng 3.5: KTTP trung bình PDI số mẫu hỗn dịch dầu Kích thước tiểu phân trung Chỉ số đa phân tán bình (X ± SD) (pm) (PDI) Biogaia 4,02 ±0,11 0,48 ĐN 3,51 ±0,14 0,33 HD 3,61 ± 0,34 0,46 HD 25,67 ±2,71 5,01 Mau 34 ❖ Nhận ì xét: Quan sát trạng thái phân tán mẫu sau lắc hình 3.4, nhận thấy tiểu phân đà tái phân tán hỗn dịch tác động co học Hầu hết mẫu có phân tán sau lắc, nhiên ngoại trừ mẫu HD/ĐN chứa 100% MCT mẫu có tượng lắng tiểu phân sau lắc Với mẫu phối hợp dầu hướng dưong MCT, sau lắc để yên phút, nhận thấy mẫu HD từ 0-3 (tỷ lệ MCT < 7,5%) đạt phân tán đồng không thấy lắng tiểu phân, mẫu HD lại (tỷ lệ MCT > 10%) nhận thấy có dấu hiệu tiểu phân lắng xuống, mức độ lắng theo thể tích tăng dần theo tỷ lệ MCT tăng dung môi, chí xuất hiện tượng lắng cặn nhanh đáy mẫu HD HD (tỷ lệ MCT > 50%) Với mẫu phối hợp dầu đậu nành MCT, sau lắc để yên phút, quan sát thấy mẫu ĐN từ 0-5 (tỷ lệ MCT 50%) thấy có tượng lắng cặn nhanh đáy ống Ngồi ra, mẫu có tỷ lệ phối họp MCT > 50% cần phải lắc với lực mạnh hon thời gian lâu so với mẫu khác phá vờ đóng bánh để tái phân tán tiểu phân Theo kết hình 3.6 bảng 3.5, phân bố kích thước tiểu phân mẫu Biogaia tuân theo phân phối chuẩn đường cong hình chng (bell curve) với KTTP trung bình 4,02 ±0,11 |1ĨĨ1 So sánh với mẫu khác, mẫu ĐN mẫu HD 2, mẫu có tỷ lệ phối hợp MCT thấp, có KTTP trung bình gần tương tự so với mẫu Biogaia, với kết 3,51 ± 0,14 pm 3,61 ± 0,34 |im Đường cong biểu diễn phân bố KTTP cho thấy đồ thị phân bố KTTP hai mẫu tuân theo phân phối chuấn dạng hình chng Với mẫu HD mẫu có dung mơi hồn tồn MCT, giá trị KTTP trung bình 25,67 ± 2,71 |im, lớn đáng kế so với KTTP trung bình Biogaia Đường cong biểu diễn phân bố KTTP mẫu HD hình lịng thuyền, khơng với dạng hình chng phân phối chuẩn số PDI, theo kết bảng 3.5, mẫu Biogaia, mẫu ĐN HD có giá trị PDI gần nhau, 0,48; 0,33 0,46 Điều cho thấy độ rộng phân bố KTTP mẫu ĐN mẫu HD tương tự với mẫu chế phẩm Biogaia thị trường Chỉ số PDI mẫu nằm khoảng 0,3-0,4 (0,7); lớn gấp 10,44 lần so với giá trị PDI mẫu Biogaia 0,48; cho thấy phân bố KTTP mẫu rộng [33], tiểu phân mẫu HD có kích thước khác 35 ♦♦♦ Bàn luận: Sự khác biệt trạng thái phân tán mẫu sau lắc giải thích dựa vào thông sổ độ nhớt loại dầu: MCT dầu có độ nhớt thấp nhiều so với dầu hướng dương dầu đậu nành [17],[36], tỷ lệ MCT dung môi dầu tăng lên, độ nhớt dung môi giảm dần, làm tốc độ sa lắng tiểu phân tăng (theo công thức mục 1.3.2.1), Như vậy, mẫu có tỷ lệ MCT thấp độ nhớt cao, trạng thái phân tán đồng sau lẳc, ngược lại mẫu có tỷ lệ MCT cao tốc độ sa lắng lớn, nhanh chóng thấy tượng tiếu phân lắng xuống sau lắc, ảnh hưởng đến phân tán đồng tiểu phân Ngoài ra, tốc độ sa lắng tiếu phân tăng lên độ nhớt môi trường phân tán giảm [5], khả tiếu phân tiếp xúc với kết tụ, đóng bánh tăng dẫn đến hình thành tiểu phân có kích thước trọng lượng lớn tiểu phân thông thường Những tiểu phân dễ sa lắng so với tiểu phân thường, ảnh hưởng đến phân tán đồng hỗn dịch Đối với mẫu có tượng sa lắng lắng cặn sau phút, mẫu không đạt yêu cầu chất lượng khả phân tán hỗn dịch nêu Dược điển Việt Nam V [1J Lý tiểu phân lắng xuống sau lắc vài phút, phân tán đồng hỗn dịch khơng đảm bảo, ảnh hưởng đến xác phân liều Ngồi ra, số mẫu có độ nhớt thấp (do tỉ lệ MCT dung môi cao), bao gồm mẫu có tỷ lệ phối hợp MCT dung mơi dầu > 50% có tượng đóng bánh, gây kết tụ tiểu phân, nên kể sau lắc lên đạt phân tán đồng tiểu phân có khác biệt lớn kích thước Như mẫu đạt yêu cầu chất lượng khả phân tán mẫu phải đạt trạng thái phân tán đồng sau lắc giữ trạng thái phút Những mẫu đạt yêu cầu chất lượng bao gồm mẫu HD từ 0-3, mẫu phối hợp dầu hướng dương MCT với tỷ lệ MCT < 7,5% mẫu ĐN từ 0-5, mẫu phối hợp dầu đậu nành MCT với tỷ lệ MCT < 15% Sự khác biệt phân bố KTTP mẫu HD so với mẫu cịn lại giải thích sau: Dung mơi dầu mẫu HD MCT hoàn toàn, MCT dầu có độ nhớt thấp [17] nên tốc độ sa lắng tiểu phân lớn [5], tiểu phân nhanh chóng lắng cặn đóng bánh Kết tiểu phân kết tụ với tạo thành tiểu phân có kích thước lớn hơn, ảnh hưởng đến phân tán đồng hỗn dịch Tóm lại, so sánh với mẫu Biogaia thị trường, mẫu ĐN mẫu HD 2, mẫu có tỷ lệ phối hợp MCT thấp (lần lượt 2,5% 5%), cho thấy giống tương đối số số phân bố KTTP, coi mẫu có phân bố kích thước tiểu phân tốt, đảm bảo xác phân liều 36 3.2.2 Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sắng sót chế phẩm hỗn dịch dầu chứa vsv Với chế phẩm chứa vsv điều quan trọng đảm bảo số lượng vi sinh vật sống sót chế phẩm đế đảm bảo sản phẩm có hiệu thời hạn sử dụng Vì thí nghiệm tiến hành đế khảo sát số lượng vi sinh vật sống sót chế phẩm hỗn dịch dầu theo thời gian ❖ Mục tiêu Đánh giá số lượng vsv sống sót chế phẩm hổn dịch dầu ♦♦♦ Tiến hành Sử dụng số mẫu bào chế mẫu HD 2, HD 3, ĐN ĐN tương tự mục tiến hành phần 3.1.2 Rót mẫu chế phẩm vào ống nghiệm đáy bang có nắp, xếp vào chỗ tối, để yên Tiến hành xác định số lượng vsv sống sót sau thời điểm ngày (ngay sau bào chế), 15 ngày 60 ngày theo phương pháp nêu mục 2.3.3 Tính tốn số lượng vsv sống sót (theo công thức mục 2.3.3) Với mẫu tiến hành thí nghiệm lần, ghi lại kết ♦♦♦ Kết Hình 3.7: Hình ảnh khuân lạc Lactobacillus acidophilus mọc đĩa thạch MRS mẫu HD sau bào chế Chú thích: số ghi đìa tương ứng với dịch pha lỗng có nồng độ pha lỗng 10" 37 số lượng vsv có Ig bột đơng khô ban đầu X 1010 vsv/ Ig Do lượng dịch đem đếm vsv 0,25 ml (1 liều), khối lượng bột vsv dịch 0,005 g (tính theo cồng thức hỗn dịch mục 3.1.2), tương ứng với số lượng vsv ban đầu theo tính tốn 1,5 X 108 CFU/0,25 ml, tương đương với log CFU/0,25 ml = 8,18 Bảng 3.6: Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót số mẫu hỗn dịch dầu theo thòi gian Số lượng vsv sống sót (log CFU/0,25 ml) Mầu Thời gian bào chế Lần HD2 HD3 ĐN0 ĐN Ngay sau Sau 14 ngày Sau 60 ngày 8,23 7,41 6,77 8,14 7,40 6,31 8,08 7,54 6,51 Trung bình 8,15 ± 0,08 7,45 ± 0,08 6,53 ± 0,23 8,00 6,91 6,01 8,03 7,29 6,18 8,07 7,31 6,03 Trung bình 8,03 ± 0,04 7,17 ± 0,23 6,07 ± 0,09 8,20 7,11 6,28 8,10 6,99 5,98 8,14 6,99 6,08 Trung bình 8,15 ± 0,05 7,03 ± 0,07 6,11 ± 0,15 8,09 6,93 5,55 8,13 6,94 5,05 8,14 6,85 5,13 Trung bình 8,12 ± 0,03 6,91 ± 0,05 5,24 ± 0,27 38 log cfu Ngay sau bào chế ■ Sau 14 ngày Sau 60 ngày Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật sống sót mẫu hỗn dịch dầu theo thời gian ♦♦♦ Nhận xét: Kết bảng 3.6 cho thấy số lượng vsv sống sót mẫu nói chung giảm dần theo thời gian Tính từ thời điếm ban đầu, số lượng vsv sống sót khoảng log CFƯ/0,25ml, với giá trị tính theo lý thuyết 8,18 log CFU/0,25 ml Sau 14 ngày số lượng vsv giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) log CFU/0,25 ml, sau 60 ngày số lượng vsv sống sót giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 5-6 log CFU/0,25 ml Mầu HD mẫu có mức độ giảm thấp nhất, với số lượng vi sinh vật sống sót giảm 5,01 lần sau tuần giảm 41,69 lần sau 60 ngày so với số lượng vsv ban đầu Trong mẫu ĐN mẫu có mức độ giảm lớn nhất, sau 14 ngày số lượng vsv sống sót giảm 16,22 lần sau 60 ngày giảm 758,58 lần so với giá trị ban đầu ♦♦♦ Bàn luận: số lượng vsv sống sót giảm dần theo thời gian giải thích vi khn Lactobacillus acidophilus có tính nhạy cảm với số yếu tố mơi trường bên ngồi nhiệt độ, độ ẩm, oxy khơng khí [9],[12] Các yếu tố gây ảnh hưởng đến chế phẩm hỗn dịch chứa vsv trình bảo quản trình đóng mở nắp ống để hút dịch đem định lượng [15], chúng gây chết vi sinh vật, làm giảm số lượng vsv sống sót Ngồi số thành phần dung môi dầu chế phẩm chất chống oxy hóa [22] có tác động định đến vi khuẩn, ảnh hưởng đến độ ổn định lâu dài chế phẩm 39 Kết đếm vsv mẫu sau bào chế khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), kết đếm mẫu sau 14 ngày khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tuy nhiên, kết đếm sau 60 ngày mẫu ĐN nhỏ có ý nghĩa thống kê so với kết sau 60 ngày mẫu cịn lại (p < 0,05) Điều giải thích tác động yếu tố mơi trường bên lên chế phẩm đa dạng phức tạp, vsv mẫu ĐN bị ảnh hưởng lớn hơn, số lượng vsv sống sót giảm nhiều so với mẫu cịn lại Nói chung, việc sử dụng dung môi dầu khác gần không ảnh hưởng đến kết đếm vsv Tuy nhiên trường hợp dung mơi dầu có độ nhớt q thấp (tỉ lệ MCT phối hợp cao) gây sa lắng, đóng bánh khơng phân tán đồng tiểu phân hỗn dịch, dẫn đến sai số kết đếm vsv Do vsv nhạy cảm với nhiệt, bảo quản nhiệt độ thấp để hạn chế gây chết vsv, tăng tính ổn định cho chế phẩm Đề tài định tạo hai mẫu HD ĐN bảo quản nhiệt độ 0-5°C sau tạo chế phẩm xong Tiến hành đếm vsv sau 14 ngày theo phương pháp nêu mục 2.3.3 thu kết quả: Bảng 3.7: Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót mẫu hỗn dịch HD ĐN bảo quản 0-5°C sau 14 ngày Số lượng VsV sống sót Mầu Lằn HD2 7,96 7,99 7,95 Trung bình 7,97 ± 0,02 7,60 7,88 7,63 Trung bình 7,70 ± 0,15 ĐN (log CFU/0,25 ml) Kết từ bảng 3.7 cho thấy số lượng vi sinh vật sống sót sau tuần mẫu HD điều kiện 0-5°C 7,97 ± 0,02 log CFU/0,25 ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với kết bảo quản mẫu nhiệt độ thường 7,45 ± 0,08 log CFU/0,25 ml Sau 14 ngày bảo quản lạnh, số lượng vsv sống sót mẫu HD 40 giảm 1,51 lần so với ban đầu, thấp so với mức giảm 5,01 lần mẫu bảo quản nhiệt độ phòng Với mẫu ĐN 1, số lượng vsv sống sót sau 14 ngày điều kiện 0-5°C 7,70 ± 0,15 log CFU/0,25 ml, lớn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với kết điều kiện nhiệt độ thường 6,91 ± 0,05 log CFU/0,25 ml số lượng vsv sống sót mẫu ĐN giảm 7,72 lần sau tuần bảo quản nhiệt độ 0-5°C, thấp đáng kế so với mức giảm 16,22 lần mẫu bảo quản thời gian nhiệt độ thường So sánh với kết số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus La-5 sống sót sữa chua bảo quản nhiệt độ 5°c nghiên cứu thực Nighswonger cộng năm 1996 [34], sau 14 ngày số lượng vsv sống sót giảm 1,74 lần so với thời điểm ban đầu, kết tương đương với kết số lượng vsv sống sót mẫu hỗn dịch dầu HD sau 14 ngày bảo quản nhiệt độ 0-5°C giảm 1,51 lần Như việc bảo quản điều kiện nhiệt độ 0-5°C sè giúp giảm thiểu gây chết vsv so với bảo quản nhiệt độ phịng, nhiệt độ thấp ức chế phát triển vsv, tăng tính ổn định lâu dài cho vsv chế phẩm Tóm lại, sau khảo sát số loại dầu sử dụng chế phẩm hỗn dịch dầu đánh giá số tiêu chất lượng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa vsv, mẫu công thức tối ưu lựa chọn công thức mẫu HD mẫu ĐN (thành phần công thức nêu mục 3.1.2), tương ứng với công thức 2: Công thức 1: Lactobacillus acidophilus 2,00 g Aerosil 0,50 g AI stearat 1,75 g Dầu hướng dương MCT 95,0ml 5,0 ml Công thức 2: Lactobacillus acidophilus 2,00 g Aerosil 0,50 g AI stearat 1,75 g Dầu đậu nành MCT 97,5ml 2,5 ml 41 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT I/ KÉT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu đề tài đà thu kết sau: Đã khảo sát số loại dầu sử dụng chế phẩm hỗn dịch dầu chứa Lactobacillus acidophilus J Lựa chọn phối hợp dầu hướng dương dầu đậu nành với MCT để tạo dung mơi dầu có độ nhớt phù hợp để phân tán vsv V Lựa chọn tỉ lệ phối hợp dầu đạt ốn định vật lý: phối hợp dầu hướng dương MCT có tỷ lệ MCT < 7,5%; phối hợp dầu đậu nành với MCT có tỷ lệ MCT < 10% V Lựa chọn tỉ lệ phối hợp dầu có thời gian nhỏ giọt phù hợp: phối hợp dầu hướng dương với MCT tỷ lệ 95:5 phối hợp dầu đậu nành với MCT tỷ lệ 97,5:2,5 Đã đánh giá số tiêu chất lượng hỗn dịch dầu chứa L acidophilus J khả phân tán: Mầu có tỷ lệ MCT < 7,5% phối hợp với dầu hướng dương < 15% phối hợp với dầu đậu nành đạt yêu cầu chất lượng khả phân tán Mầu ĐN HD có phân bố KTTP tốt tương đương mẫu chứng: mẫu ĐN (KTTP trung bình 3,51 ±0,14 |im PDI= 0,33), mẫu HD (KTTP trung bình 3,61 ± 0,34 pm PDI= 0,46) V khả sống sót VSV: số lượng VSV sống sót ban đầu log CFU/0,25 ml, sau 14 ngày số lượng vsv giảm xuống log CFU/0,25 ml sau 60 ngày 5-6 log CFU/0,25 ml số lượng VSV sống sót điều kiện nhiệt độ 05°c sau 14 ngày 7,5-8 log CFU/0,25 ml, thấp so với số lượng ban đầu J Lựa chọn công thức hỗn dịch tối ưu nhất: Công thức 1: Lactobacillus acidophilus 2,00 g; Aerosil 0,50 g; Al stearat 1,75 g; Dầu hướng dương 95,0 ml; MCT 5,0 ml Công thức 2: Lactobacillus acidophilus 2,00 g; Aerosil 0,50 g; Al stearat 1,75 g; Dầu đậu nành 97,5 ml; MCT 2,5 ml II/ ĐỀ XUẤT Do thời gian có hạn nên khóa luận chưa đề cập hết vấn đề có liên quan, đề tài xin đưa số hướng nghiên cứu sau: ♦♦♦ Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố trình bào chế đến khả sống sót VSV thành phần chất phụ gia loại dầu, nhiệt độ trì trình tiệt khuẩn dầu ❖ Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố trình bảo quản đến khả sống sót VSV nhiệt độ bảo quản, chất liệu bao bì bảo quản 42 TÀI LIỆU THAM KHÃO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược Điển Việt Nam K, Nhà xuất Y học, Hà Nội, Phụ Lục, tr 12 Bộ Y tế (2017), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, Phụ Lục, tr.414-415 Trần Cát Đông, Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP HCM (2015), Xu hướng nghiên cứu ủng dụng chủng lợi khuấn Probiotic Y học thực phấm chức năng, Sở khoa học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hoa (2021), Khảo sát khả sống sót Lactobacillus acidophilus dầu, Khóa luận tốt nghiệp duợc đại học, Truờng Đại học Duợc Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Đăng Hòa (2020), Bào chế sinh dược học tập I, Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 169-194 Phạm Thị Phương (2015), Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Trương Hồng Sơn, Nguyễn Hồng Khánh, Phạm Văn Hoan (2018), Nghiên cứu tổng quan hiệu Probiotics -Chủng Caseỉ 431, Viện Y học ứng dụng Việt Nam, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Akkaya, M R (2018), “Prediction of fatty acid composition of sunflower seeds by near-infrared reflectance spectroscopy”, J Food Sci Technol, 55(6), pp.2318-2325 Baral, K c., Bajracharya, R., Lee, s H., Han, H K (2021),“Advancements in the Pharmaceutical Applications of Probiotics: Dosage Forms and Formulation Technology”, Int J Nanomedicine, 16, pp.7535-7556 10 Binda, s., Hill, c., Johansen, E., Obis, D., Pot, B., Sanders, M E., Tremblay, A., Ouwehand, A c (2020), “Criteria to Qualify Microorganisms as Probiotic in Foods and Dietary Supplements”, Front Microbiol, 11, 1662 11 Boateng, L., Ansong, R., Owusu, w., & Steiner-Asiedu, M (2016), “Coconut oil and palm oil’s role in nutrition, health and national development: A review”, Ghana Medical Journal, 50(3), pp 189-196 12 Bull, M., Plummer, s., Marchesi, J., Mahenthiralingam, E (2013), “The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success”, FEMS Microbiology Letters, 349(2), pp.77-87 13 Bullerman, L B (2003), “SPOILAGE I Fungi in Food - An Overview”, Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition, pp.5511-5522 14 Campbell, E J (1983), “Sunflower oil”, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 60(2), pp.387-392 15 Chavda, H (2021), “In-use stability studies: guidelines and challenges”, Drug Dev Ind Pharm, 47(9), pp 1373-1391 16 Chen,Y., She,Y., Lei, J., Wang, D., Wu, s., Men, K (2021), “Medium chain fatty acids: extraction, isolation, purification, bioactive properties and application”, IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, Proceedings of the 4th International Conference on Agricultural and Food Science, Istanbul, Turkey, October 28-30, 2020, IOP Publishing, 705(1), 012013 17 De Vries, A., Gomez, Y L., van der Linden, E., Scholten, E (2017), “The effect of oil type on network formation by protein aggregates into oleogels”, RSC Advances, 7(19), pp.l 1803-11812 18 Di Cerbo, A., Palmieri, B., Aponte, M., Morales-Medina, J c., lannitti, T (2016), “Mechanisms and therapeutic effectiveness of lactobacilli”, J Clin Pathol, 69(3), pp 187-203 19 Gerde, J A., Hammond, E G., Johnson, L A., Su, c., Wang, T., White, P J (2020), “Soybean Oil”, Bailey’s Industrial Od and Fat Products, pp.1-68 20 Gopal, p K (2011), “Lactic Acid Bacteria I Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus’’', Encyclopedia of Dairy Sciences, pp.91-95 2LGrompone, M A (2020), “Sunflower and High-Oleic Sunflower Oils”, Bailey’s Industrial Oil and Fat Products, pp 1-54 22 Gunstone, F D (2013) “Composition and Properties of Edible Oils”, Edible Oil Processing, pp.1-39 23 Gupta, V., Garg, R (2009), “Probiotics”, Indian Journal of Medical Microbiology, 27(3), pp.202-209 24 Her, J Y., Song, c s., Lee, s J., Lee, K G (2010), “Preparation of kanamycin powder by an optimized spray freeze-drying method”, Powder Technology, 199(2), pp 159-164 25 Heydinger, J A., Nakhasi, D K (1996), “Medium chain triacylglycerols”, Journal of Food Lipids, 3(4), pp.251-257 26 Jonathon, T B (1990), “Final Report of the Safety Assessment of Lithium Stearate, Aluminum Distearate, Aluminum Stearate, Aluminum Tristearate, Ammonium Stearate, Calcium Stearate, Magnesium Stearate, Potassium Stearate, Sodium Stearate, and Zinc Stearate”, Journal of the American College of Toxicology, 1(2), pp.143-177 27 Khalesi, s., Bellissimo, N., Vandelanotte, c., Williams, s., Stanley, D., Irwin, c (2019), “A review of probiotic supplementation in healthy adults: helpful or hype?”, European Journal of Clinical Nutrition, 73(1), pp.24-37 28 Kirejevas, V., Kazarjan, A (2012), “Probiotic oil suspension and use thereof’, EP2421384A1 29 Korpela, R., Niittynen, L (2012), “Probiotics and irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health and Disease, 23 30 Lee, N K., Kim, w s., Paik, H D.(2019), “Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier”, Food Science and Biotechnol, 28(5), pp 1297-1305 31 Minelli, E B., Benini, A (2008), “Relationship between number of bacteria and their probiotic effects”, Microbial Ecology in Health and Disease, 20(4), pp 180-183 32 Mody, s K., Naqvi, s H (2017), “Stable probiotic suspensions”, WO2017223150AL 33 Mudalige, T., Qu, H., Van Haute, D., Ansar, s M., Paredes, A., Ingle, T (2019), “Characterization of Nanomaterials”, Nanomaterials for Food Applications, pp.313353 34 Nighswonger, B D., Brashears, M M., Gilliland, s E (1996), “Viability of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei in Fermented Milk Products During Refrigerated Storage”, Journal of Dairy Science, 79(2), pp.212-219 35 Reid, G., Jass, J., Sebulsky, M T., McCormick, J K (2003), “Potential uses of probiotics in clinical practice”, Clinical Microbiology Reviews, 16(4), pp.658-672 36 Rojas, E E G., Coimbra, J s R., Telis-Romero, J (2013), “Thermophysical Properties of Cotton, Canola, Sunflower and Soybean Oils as a Function of Temperature”, International Journal of Food Properties, 16(7), pp 1620-1629 37 Rowe, R.C., Sheskey, P.J., Quinn, M.E (2009), “Aluminum Monostearate”, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed, Pharmaceutical Press, pp.35-36 38 Rowe, R.C., Sheskey, P.J., Quinn, M.E (2009), “Colloidal Silicon Dioxide”, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed, Pharmaceutical Press, pp 185-188 39 Schaafsma, G., Meuling, w J., van Dokkum, w., Bouley, c (1998), “Effects of a milk product, fermented by Lactobacillus acidophilus and with fructo oligosaccharides added, on blood lipids in male volunteers”, European Journal of Clinical Nutrition, 52(6), pp.436-440 40 Selle, K M., Klaenhammer, T R., Russell, w M (2014), “LACTOBACILLUS I Lactobacillus acidophilus”, Encyclopedia of Food Microbiology, pp.412-417 41 Shanmugam, s (2017), “Granulation techniques and technologies: recent progresses”, BioImpacts, 5(1), pp.55-63 42 Shi, L H., Balakrishnan, K., Thiagarajah, K., Mohd Ismail, N L, Yin, o s (2016), “Beneficial Properties of Probiotics”, Trop Life Sci Res, 27(2), pp.73-90 43 Silanikove N, Leitner G, Merin Ư (2015), “The interrelationships between lactose intolerance and the modern dairy industry: global perspectives in evolutional and historical backgrounds”, Nutrients, 7(9), pp.7312-7331 44 Sinn, D H., Song, J H., Kim, H J., Lee, J H., Son, H J., Chang, D K., Kim, Y FL, Kim, J J., Rhee, J c., Rhee, p L (2008), “Therapeutic effect of Lactobacillus acidophilus-SDC 2012, 2013 in patients with irritable bowel syndrome”, Digestive Diseases and Sciences, 53(10), pp.2714-2718 45 Sleeter, R T (1981), “Effects of processing on quality of soybean oil”, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 58(3), pp.239-247 46 Todar, G K (2006), “Lactic Acid Bacteria”, Todar's Online textbook of bacteriology, University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology 47 Turnbull, p c B (1996), “Bacillus”, Medical Microbiology, 4th ed, Galveston (TX), 15 48 Wang, T (2011), “Soybean Oil”, Vegetable Oils in Food Technology, 2nd ed, Blackwell Publishing, pp.59-105 49 Wang, Y., Wu, J., Lv, M., Shao, z., Hungwe, M., Wang, J., Bai, X., Xie, J., Wang, Y., Geng, w (2021), “Metabolism Characteristics of Lactic Acid Bacteria and the Expanding Applications in Food Industry”, Front Bioeng Biotechnol, 9, 612285 50 Weiss, G., Rasmussen, s., Zeuthen, L H., Nielsen, B N., Jarmer, H., Jespersen, L., Frokiaer, H (2010), “Lactobacillus acidophilus induces virus immune defence genes in murine dendritic cells by a Toll-like receptor-2-dependent mechanism”, Immunology, 131(2), pp.268-281 51 Zawistowski, J., Kopec, A (2022), “Effect of functional food ingredients on nutrient absorption and digestion”, Nutrition and Functional Foods in Boosting Digestion, Metabolism and Immune Health, 1st ed, Academic Press, pp 173-189 Tài liệu mạng 52 https://vegetableoilhx.com/news/production-and-consumption-of-vegetable-oils-inVietnam-to-2025Z747.html 53 https://www.botanical-online.com/en/food/sunflower-oil-characteristics