Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI NHUNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUÔN NGUYÊN LIỆU CHỨA Lactobacillus acidophilus ĐEN MỌT so CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC DẠNG HỎN DỊCH DẦU KHÓA[.]
Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI NHUNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUÔN NGUYÊN LIỆU CHỨA Lactobacillus acidophilus ĐEN MỌT so CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC DẠNG HỎN DỊCH DẦU _ _ _ _ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2023 Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI NHUNG Mã sinh viên: 1801526 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUÒN NGUYÊN LIỆU CHỨA Lactobacillus acidophilus ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CHÉ PHẨM PROBIOTIC DẠNG HỎN DỊCH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hưởng dẫn: Ths Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghệ Sinh học Dưọc Khoa Công nghệ Sinh học HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung đề tài, tơi muốn bày tở biết ơn chân thành đến thày cô, gia đình, bạn bè, người đà ln hỗ trợ, động viên suốt khoảng thời gian qua, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thầy, người đáng kính: PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, TS Nguyễn Khắc Tiệp Bộ môn Công nghệ Sinh học Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn từ ngày thực khóa luận tất kinh nghiệm, lời khuyên quý báu động viên, cố vũ chân thành Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị kỹ thuật viên, bạn sinh viên nghiên cứu khóa 73 em sinh viên khóa 74 ln sát cánh, chia sẻ giúp đỡ thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người truyền đạt đến kiến thức quý báu, nhiệt huyết dam mê q trình tơi học tập trường Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người nguồn động viên lớn lao, giúp đỡ, cổ vũ xuyên suốt năm trau dồi học thuật rèn luyện thân Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Bùi Thị Mai Nhung MỤC LỤC LỜI CẢM ON DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIẾU ĐÒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Đại cương Probiotic .2 ỉ.1.1 Định nghĩa probiotic 1.1.2 Vi sinh vật probiotic 1.1.3 Vai trò probiotic 1.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lí, điều kiện ni cấy 1.2.2 Vai trò Lactobacillus acidophilus sức khỏe người 1.3 Dạng bào chế chế phẩm probiotic 1.3.1 Một số dạng bào chế chứa probiotic thị trường 1.3.2 Hỗn dịch dầu chứa vi sinh vật probiotic 1.3.3 Tá dược công thức probiotic hỗn dịch dầu 1.4 Một số tiêu chất lượng chế phẩm Probiotic hỗn dịch dầu 1.4.1 Yêu cầu chất lượng chung hỗn dịch 1.4.2 Một số tiêu chất lượng áp dụng nghiên cứu chế phẩm Probiotic hỗn dịch dầu 1.5 Một số nghiên cứu nước chế phẩm probiotic hỗn dịch dầu 11 CHƯƠNG 2: ĐỔI TƯỌNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 12 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 12 2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng 12 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 13 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Xây dựng công thức chế phẩm probiotic hỗn dịch dầu nguồn nguyên liệu chứa Lactobacdỉus acidophilus thông qua đánh giả tiêu vật lỷ độ lắng độ đồng phân tán hon dịch 14 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus đến tiêu khác: khả sống sót vi sinh vật phân bố kích thước tiểu phân hỗn dịch 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp tiệt khuân hóa chất, dụng cụ, thiết bị, mỏi trường nuôi cấy ỉ5 2.3.2 Phương pháp tạo hỗn dịch dầu chứa vi sinh vật probiotic 15 2.3.3 Phương pháp pha loãng liên tục định lượng vi sinh vật chế phẩm 16 2.3.4 Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân hồn dịch 18 2.3.5 Phương pháp đánh giả khả phân tán hỗn dịch 18 2.3.6 Phương pháp đánh giá độ lắng hỗn dịch 18 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Xây dựng công thức chế phẩm probiotic hỗn dịch dầu đối vói nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus thông qua đánh giá tiêu vật lý độ lắng độ đồng phân tán hỗn dịch 19 3.1.1 Nguôn nguyên liệu 1: Bột đông khô Lactobacillus acidophilus sản xuât Đan Mạch, cung cấp Brenntag Việt Nam 19 3.1.2 Nguồn nguyên liệu 2: Bột đông khô Lactobacillus acidophilus cung cấp công ty BG 29 3.1.3 Nguồn nguyên liệu 3: Bột đông khô Lactobacillus acidophilus cung cấp Viện Thực phẩm Chức 33 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus đến tiêu khác: khả sống sót vi sinh vật phân bố kích thước tiểu phân hỗn dịch 36 3.2.1 Khảo sát tiêu khả sống sót vi sinh vật 36 3.2.2 Khảo sát tiêu phân bố kích thước tiểu phân hỗn dịch 40 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 43 TÃI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỦ VIẾT TẤT CFU (Colony - Forming Units) Số đơn vị khuẩn lac FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức nông lương giới GRAS (Generally recognized as safe) Được công nhận chung an toàn HDL (High density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng cao IBS (Irritable bowel syndrome) Hội chứng ruột kích thích KTTP Kích thước tiểu phân L acidophilus Lactobacillus acidophilus LDL (Low density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng thấp MCT (Medium chain triglycerides) Chuỗi triglycerid trung bình MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn PBS (Phosphate buffered saline) Dung dịch đệm phosphat TCCS Tiêu chuẩn sở TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TKHH Tinh khiết hóa học TPCN Thực phẩm chức WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT Trang Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 13 Bảng 2.3 Công thức môi trường MRS thạch 14 Bảng 3.1 Tên mẫu hồn dịch dầu ứng với tỉ lệ Aerosil thao tác 20 bào chế khác Bảng 3.2 Kết đo độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch dầu 21 ứng với tỉ lệ Aerosil thao tác bào chế khác Bảng 3.3 Kết đo độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch dầu 27 nguồn nguyên liệu Đan Mạch Bảng 3.4 Tỉ lệ phối hợp Nhôm monostearat/Aerosil mẫu hỗn 29 dịch dầu với nguồn nguyên liệu BG Bảng 3.5 Kết đo độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch dầu 30 nguồn nguyên liệu BG Bảng 3.6 Tỉ lệ phối hợp Nhôm monostearat/Aerosil mẫu hỗn 33 dịch dầu với nguồn nguyên liệu Viện TPCN Bang 3.7 Kết đo độ lắng theo thời gian mẫu hỗn dịch dầu 33 nguồn nguyên liệu Viện TPCN Bảng 3.8 Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót có bột vi sinh 37 vật đông khô nguồn nguyên liệu bảo quản o°c sau 60 ngày Bảng 3.9 Kết đếm số lượng vi sinh vật sống sót có số mẫu 37 hỗn dịch dầu theo thời gian Bảng 3.10 So sánh cảm quan KTTP trung bình mẫu hỗn dịch dầu 40 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIÉƯ ĐỊ Tên hình Trang Hình ảnh vi khuẩn L acidophilus kính hiển vi điện tử (độ STT Hình 1.1 phóng đại 10,000x) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Aerosil Hình 1.3 cấu trúc hóa học • Nhơm monostearat Hình 1.4 Hình ảnh minh họa hỗn dịch lắng xuống 10 Hình 3.1 Độ lắng sau tháng mẫu hỗn dịch dầu ứng với tỉ 21 Hình 3.2 lệ• Aerosil thao tác bào chế khác Khả đồng phân tán sau tháng mẫu hỗn dịch 22 dầu ứng với tỉ lệ Aerosil thao tác bào chế khác Hình 3.3 Các mẫu hỗn dịch dầu với tỷ lệ Nhôm monostearat khác 25 thời điểm sau bào chế hồn tất Hình 3.4 Độ lắng sau tháng mẫu hổn dịch dầu nguồn 27 nguyên liệu Đan Mạch Hình 3.5 Khả đồng phân tán sau tháng mẫu hỗn dịch 27 dầu nguồn nguyên liệu Đan Mạch Hình 3.6 Độ lắng sau tháng mẫu hỗn dịch dầu nguồn 30 nguyên liệu BG Hình 3.7 Khả đồng phân tán sau tháng mẫu hỗn dịch 31 dầu nguồn nguyên liệu BG Hình 3.8 Biểu đồ độ lắng sau tháng mẫu hỗn dịch dầu 31 nguồn nguyên liệu BG Hình 3.9 Độ lắng sau tháng mẫu hỗn dịch dầu nguồn 34 nguyên liệu Viện TPCN Hình 3.10 Khả đồng phân tán sau tháng mẫu hỗn dịch 34 dầu nguồn nguyên liệu Viện TPCN Hình 3.11 Biểu đồ độ lắng sau tháng mẫu hỗn dịch dầu 35 nguồn nguyên liệu Viện TPCN Hình 3.12 Biểu đồ thề số lượng vi sinh vật sống sót mẫu 38 hỗn dịch dầu theo thời gian Hình 3.13 Biểu đồ phân bố KTTP mẫu M15 (nguyên liệu Đan Mạch) Hình 3.14 Biểu đồ phân bố KTTP mẫu N9 (nguyên liệu BG) Hình 3.15 Biểu đồ phân bố KTTP mẫu N9 (nguyên liệu Viện TPCN) 41 41 41 ĐẶT VẤN ĐÈ Probiotic (bao gồm vi khuấn nấm men) vi sinh vật sống chứng minh mang tác dụng có lợi sức khỏe người tồn thề cộng đồng quốc tế cơng nhặn Các nghiên cứu khoa học vi sinh vật probiotic mang đến nhiều lợi ích cho sức khoe ngăn ngừa bệnh đường ruột, cải thiện hệ thống miễn dịch, cải thiện dung nạp lactose, cân hệ vi sinh vật đường ruột, giảm thiểu tiêu chảy, không với đối tượng người lớn mà trẻ nhỏ [39] Gần đây, vi sinh vật probiotic liên tục nghiên cứu phát triển theo đời đa dạng loại chế phẩm sinh học với dạng bào chế khác Nhắm đến đối tượng sử dụng trẻ so sinh trẻ nhở, chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu sản phẩm lý tưởng để cung cấp vi sinh vật sống có lợi nhờ ưu điểm vượt trội khả lưu trữ vi sinh vật không sinh bào tử Lactobacillus acidophilus thuận tiện sử dụng mà mang lại Tiếp nối kế thừa nhừng nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu probiotic dạng hỗn dịch dầu, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus đến số tiêu chất lượng chế phẩm probiotic dạng hỗn dịch dầu” thực với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng công thức chế phẩm probiotic hỗn dịch dầu nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus thông qua đánh giá tiêu vật lý độ lắng độ đồng phân tán hỗn dịch Khảo sát ảnh hưởng nguồn nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus đến số tiêu khác: khả sống sót vi sinh vật phân bố kích thước tiều phân hổn dịch CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Đại cương vê Probiotic 1.1.1 Định nghĩa probiotic Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) định nghĩa probiotic “những vi sinh vật sống bố sung lượng vừa đủ sè mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [18] Probiotic sử dụng liên tục để cải thiện cân nội sinh hệ vi sinh vật bên thể nhằm trì sức khỏe đường ruột người [36] Các chế phẩm probiotic ngày phổ biến thực phẩm lâm sàng chức hỗ trợ sức khoe đặc biệt chúng 1.1.2 Vi sinh vật probiotic Vi sinh vật muốn công nhận probiotic cần phải đáp ứng số tiêu chuân sau: - Có nguồn gốc rõ ràng, chủng (có định danh xác, mang đặc điểm di truyền ổn định) [10] - Không gây bệnh cho vật chủ, khơng sinh độc tính (thuộc nhóm GRAS an tồn lành tính, khơng liên quan đến bệnh tật, không mang gen đề kháng kháng sinh truyền được) [13] - Có đặc tính probiotic, sinh sản phẩm với hiệu suất cao (có khả sống sót qua hệ tiêu hóa, có khả phát triến đường ruột, có hiệu có lợi đáng tin cậy chứng minh khoa học) [10] - Dễ nuôi cấy, tăng sinh nhanh môi trường sản xuất, đưa vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp Ôn định thời gian bảo quản dễ bảo quản, tỷ lệ vi sinh vật sống sót cao thời gian bảo quản Hiện chủng probiotic sử dụng phố biến vi khuấn thuộc chi Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium nâm men Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisỉae [26] Thông tin thu cho thấy Lactobacillus có lịch sử sử dụng lâu dài mà khơng có báo cáo nguy gây hại cho người chứng an tồn chúng [29] 1.1.3 Vai trị probiotic Probiotic có vai trị là: điều tiết môi trường sống vi khuấn đường ruột người, thúc phát triển vi khuấn lactic ruột, nâng cao tỉ lệ sử dụng đường sữa, có tác dụng phòng ngừa điều trị định bệnh đường ruột như: viêm ruột mạn tính, hội chứng ruột kích thích, chứng tiêu chảy, khó tiêu, P4 29,70 49,20 P5 20,50 35,12 P6 7,62 25,87 P7 22,64 48,78 P8 12,45 37,10 P9 7,50 19,52 P10 34,17 51,31 Pll 8,23 25,92 P12 10,91 27,32 P1 P2 P3 P4 P6 P5 P7 P8 P9 P10 P11 P12 DQ OS Dffl B9i 03 DO DS DS DS BS138 BS ô ãB J9 u *- *-*ã* ~ * ô 106 CFU/ml ruột non > 108 CFU/g ruột già [28] Tuy nhiên, mẫu MI5, M I 6, N6 N9 có số lượng vi sinh vật sống sót giảm xuống 4-5 log CFU/lieu Nồng độ khơng cịn đảm bảo hiệu lâm sàng chế phẩm Kết bảng 3.8 cho thấy: hàm lượng vi sinh vật sống bột đông khô nguồn nguyên liệu Đan Mạch BG giảm mạnh dù vi sinh vật không nằm 38 hỗn dịch mà bảo quản khô, lạnh, theo quy định nhà sản xuất Điều có nghĩa rằng, hai nguồn nguyên liệu từ đầu tồn tỷ lệ chết cao vi sinh vật Bên cạnh đó, từ phương diện bào chế, nhận thấy: cặp mẫu N6 P6, cặp mẫu N9 P9 hai cặp mẫu có chung phương pháp bào chế giống tỷ lệ tá dược MCT, Aerosil Nhôm monostearat, khác nguồn nguyên liệu Tuy nhiên, hai mẫu N6, N9 lại có tỷ lệ vi sinh vật chết cao hai mẫu P6, P9 đến xấp xỉ 50 lần Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu BG có tỷ lệ vi sinh vật chết cao nguồn nguyên liệu Viện TPCN đến xấp xỉ 33 lần Những tương quan ra: nguyên nhân khiến số lượng vi sinh vật mẫu hỗn dịch sụt giảm mạnh nguồn nguyên liệu ban đầu không đảm bảo trì ổn định mặt hàm lượng Số lượng vi sinh vật sống sót giảm dần theo thời gian giải thích nguyên nhân khác Do vi khuân Lactobacillus acidophilus có tính nhạy cảm với số yếu tố mơi trường bên ngồi nhiệt độ, độ ẩm, oxy khơng khí [12], [14] Các yếu tố gây ảnh hưởng đến chế phẩm hỗn dịch chứa vi sinh vật trình bảo quản hổn dịch [15], kết gây chết vi sinh vật Ngồi ra, trường hợp bột vi sinh vật đông khô nguồn nguyên liệu Đan Mạch, có tượng không ổn định mặt thể chất: bột đông khô vi sinh vật bắt đầu xuất phần bị biến màu, hút ẩm, đóng bánh khơng thể qua rây đem phối hợp tạo hỗn dịch Đây đặc điểm cần lưu ý lựa chọn nguyên liệu Ngoài số thành phần có dung mơi dầu chế phẩm chất bảo quản, chất chống oxy hóa [22] có tác động định đến vi sinh vật, ảnh hưởng đến độ ốn định lâu dài chế phẩm f Kết luận: Các mẫu hỗn dịch dầu nguồn nguyên liệu Viện TPCN (P6 P9) đạt tiêu hàm lượng vi sinh vật sống sót sau tháng Các mẫu hỗn dịch dầu nguồn nguyên liệu Đan Mạch (MI5 MI6) nguồn nguyên liệu BG (N6 N9) không đạt tiêu hàm lượng vi sinh vật sống sót sau tháng Một nguyên nhân khiến số lượng vi sinh vật mẫu hỗn dịch sụt giảm mạnh nguồn nguyên liệu ban đầu đà không đảm bảo trì ổn định mặt hàm lượng Vì vậy, việc lựa chọn nguồn ngun liệu cịn hạn sử dụng dài, ổn định mặt thể chất: khơng vón cục, khơng biến màu, qua rây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng chế phẩm Bên cạnh đó, hàm lượng vi sinh vật sống nguồn nguyên liệu ban đầu nên đạt từ 101()CFU/g trở lên 39 3.2.2 Khảo sát tiêu phân bố kích thước tiểu phân hồn dịch Hỗn dịch hệ phân tán dị thể chứa chất rắn khơng tan Khi chế phẩm bào chế, kích thước hạt tiểu phân bên ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý cấu trúc chế phẩm [11] a Mục tiêu: So sánh phân bố kích thước tiểu phân hỗn dịch nguồn nguyên liệu thông qua mẫu M15 (nguyên liệu Đan Mạch), N9 (nguyên liệu BG) P9 (nguyên liệu Viện TPCN) b Tiến hành: Lắc mẫu, dùng đầu lấy xác lượng dịch 30,00 pL cách bề mặt thoáng 5cm làm tiêu soi kính hiển vi Các mẫu chụp hình ảnh, xác định kích thước đếm số lượng phần mềm phân tích hình ảnh NISElements Phép đo thực 10 vi trường ngẫu nhiên với xấp xỉ 100 tiểu phân để xác định giá trị KTTP trung bình tiến hành vẽ đồ thị phân bố KTTP c Kết quả: Bảng 3.10 So sánh cảm quan KTTP trung bình mẫu hỗn dịch dầu rp «Ạ /V _ Tên mâu Cảm quan KTTP trung bình (pm) (x ± SD) Tiểu phân kích thước to nhỏ khơng đồng đều, M15 (nguyên liệu khoảng chênh lệch lớn, kích thước từ nhở Đan Mạch) (