BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI XUÂN TRƯỜNG TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYHEPTANAMID MỚI MANG KHUNG BENZIMIDA
TỔNG QUAN
HISTON DEACETYLASE
1.1.1 Giới thiệu về histon deacetylase
Năm 1964, các nhà khoa học Allfrey, Faulkner và Mirsky đã phát hiện ra sự acetyl hóa thuận nghịch của protein histon và đề xuất rằng quá trình biến đổi này có thể điều hoà biểu hiện gen [11] Nhiều đặc tính của protein được điều chỉnh thông qua quá trình acetyl hóa lysin, bao gồm tương tác ADN-protein, hoạt động phiên mã, tính ổn định và tham gia vào các con đường truyền tín hiệu [12-14]
Các histon acetyltransferase (HAT) là họ enzym đóng vai trò acetyl hóa nhóm ε-amino của lysin trên histon (Hình 1.1), do đó trung hòa điện tích dương của chúng và làm mất khả năng liên kết với ADN tích điện âm [15] Điều này khiến nhiễm sắc thể tháo xoắn dễ dàng và thuận lợi hơn cho quá trình phiên mã Histon deacetylase (HDAC) là họ enzym có tác dụng ngược lại, khiến cho histon tích điện dương lớn ở đầu N, tương
Hình 1.1 Vai trò của HAT và HDAC tác mạnh với ADN, làm đóng xoắn chromatin (chất nhiễm sắc) gây giảm khả năng tiếp cận ADN, do đó ức chế quá trình phiên mã [16] Đến thời điểm hiện tại, đã có 18 loại HDAC trên cơ thể người được xác định, chia làm 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men [17-19]:
- Nhóm I: bao gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 Cấu trúc của chúng có sự tương đồng rất cao với HDAC Rpd3 của nấm men
- Nhóm II: cấu trúc tương tự với HDA1 của nấm men và được chia thành hai phân nhóm nhỏ hơn:
+ Phân nhóm IIa: bao gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9
+ Phân nhóm IIb: bao gồm HDAC6, HDAC10
- Nhóm III: có cấu trúc tương đồng với Sir2 của nấm men, còn được gọi là các sirtuin Nhóm này bao gồm các sirtuin 1-7
- Nhóm IV: chỉ có duy nhất một đại diện là HDAC11 Cấu trúc tương tự với
Nếu căn cứ vào cơ chế xúc tác cho phản ứng deacetyl hoá, các HDAC có thể được chia (Bảng 1.1) thành 2 phân nhóm lớn [17]:
+ Phân nhóm phụ thuộc ion Zn 2+
+ Phân nhóm phụ thuộc NAD +
Phụ thuộc Zn 2+ Phụ thuộc NAD +
Nhóm I Nhóm IIa Nhóm IIb Nhóm IV Nhóm III
HDAC 1 HDAC 4 HDAC 6 HDAC 11 Sirt 1
Bảng 1.1 Các phân nhóm HDAC theo cơ chế xúc tác
1.1.2 Histon deacetylase và vai trò của chúng trong bệnh ung thư
Về bản chất, sự cuộn và tháo xoắn của chromatin là một quá trình thuận nghịch Quá trình acetyl hóa đuôi lysin là một cơ chế có ý nghĩa quan trọng trong sự giãn cấu trúc ADN và phiên mã gen Trong các tế bào ung thư, sự mất cân bằng giữa HAT và HDAC gây ra những thay đổi trong cấu trúc chromatin và làm thay đổi biểu hiện của các gen cơ bản trong chu kỳ tế bào, sự biệt hóa và quá trình chết theo chương trình (apoptosis) Chẳng hạn, trong các tế bào mà histon bị acetyl hóa quá mức, do ức chế HDAC, chất nhiễm sắc ít bị nén hơn và thuận lợi cho việc tăng khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã đến các vùng khởi động trình tự ADN, làm tăng biểu hiện của nhiều gen, có thể bao gồm gen gây ung thư, dẫn đến phát sinh khối u [20] Mặt khác, trong các tế bào bị giảm acetyl hóa, do sự huy động quá mức HDAC, có hiện tượng gia tăng quá trình tăng sinh tế bào thông qua các protein ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào Một cơ chế có thể làm thay đổi quá trình kiểm soát chu kỳ tế bào trong các tế bào có biểu hiện quá mức HDAC, là thông qua sự ức chế protein p21 bởi HDAC, bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha G1-S [21]
HDAC cũng đã được tìm thấy trong quá trình loại bỏ các nhóm acyl khỏi các protein không phải histon khác, như các yếu tố phiên mã và các protein điều hòa quan trọng của quá trình tăng sinh, biệt hóa và chết theo chương trình của tế bào [20] Hơn nữa, sự biểu hiện quá mức HDAC trong các tế bào ung thư có liên quan đến việc tăng cường macropinocytosis (đại ẩm bào), sự di chuyển của tế bào và khả năng di căn của khối u [22]
HDAC cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc kháng hóa trị Một giả thuyết có thể giải thích cho phát hiện này là dựa vào những thay đổi trên cấu trúc chromatin Việc thay đổi trạng thái cuộn của chromatin có thể ngăn các thuốc hướng đích ADN tấn công vào mục tiêu phân tử của chúng, giảm mức độ tổn thương ADN và cải thiện khả năng sống sót của tế bào [23]
1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym histon deacetylase
Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X, các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm hoạt động, xúc tác cho phản ứng deacetyl hóa của chúng (Hình 1.2):
Nhìn chung, các HDAC đều có cấu trúc trung tâm hoạt động tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính là ion Zn 2+ và kênh enzym [24]:
+ Ion Zn 2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí Ion Zn 2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin trên HDAC và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác cho quá trình tách loại nhóm acetyl Thông thường, các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn 2+ thì tác dụng ức chế HDAC và gây độc tế bào càng tăng Chẳng hạn acid hydroxamic ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn 2+ qua 2 nguyên tử oxy của nó [24]
+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất Lòng kênh được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu, đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Cấu trúc của hợp phần này là khá linh động, có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của chất ức chế HDAC (HDAC inhibitor – HDACi) Đáy túi có một vài phân tử nước, giúp vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo liên kết hydro khi không có -OH của Tyr [24]
Hình 1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC
CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE
1.2.1 Giới thiệu về các nhóm chất ức chế histon deacetylase
Một số chất ức chế histon deacetylase (histon deacetylase inhibitor – HDACi) và phân nhóm của chúng được minh hoạ trong Hình 1.3, bao gồm các acid hydroxamic, các benzamid, các peptid vòng, các acid béo mạch ngắn và các ceton [25, 26]
Năm 2006, FDA đã phê duyệt chất HDACi đầu tiên là Vorinostat (SAHA), cho chỉ định điều trị u lympho tế bào T ở da (CTCL) Hiện tại, đã có tổng cộng 3 chất ức chế HDAC khác, cụ thể là Belinostat (PXD101), Panobinostat (LBH589), Romidepsin
Belinostat (PXD101) Phê duyệt 2014 (PTCL)
Panobinostat (LBH589) Phê duyệt 2015 (MM) ACID HYDROXAMIC
Romidepsin (FK228) Phê duyệt 2009/2011 (CTCL, PTCL) PEPTID VÒNG
Acid valproic Phase I, II ACID BÉO MẠCH NGẮN
Hình 1.3 Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc
(FK228) đã được FDA Hoa Kỳ phê duyệt trong điều trị các loại ung thư khác nhau như CTCL, u lympho tế bào T ngoại biên (PTCL) và u đa tủy Năm 2015, một chất HDACi chọn lọc là Chidamid (CS005) đã được Trung Quốc phê duyệt để điều trị PTCL tái phát hoặc khó điều trị [27]
Hiện nay, một số chất HDACi khác cũng cho thấy tiềm năng là đơn trị liệu hoặc phối hợp với nhiều loại thuốc chống khối u khác để điều trị bệnh ung thư ác tính, như Pracinostat (SB939), ITF2357 (Givinostat), MGCD0103 (Mocetinostat), Entinostat (MS-275), PCI-24781 và acid valproic [28]
1.2.2 Cơ chế tác dụng của các HDACi trong điều trị ung thư
Các HDACi đã được thử nghiệm và đưa vào sử dụng trên lâm sàng với tác dụng kháng ung thư, vì hiệu quả kháng khối u in vitro và in vivo [29] Trong nhiều trường hợp, sự ức chế quá trình acetyl hóa bất thường trên histon có thể đóng vai trò như một liệu pháp điều trị, gây ra (Hình 1.4) sự bắt giữ chu trình tế bào, nhạy cảm với quá trình chết theo chương trình của tế bào, ức chế sự hình thành mạch, sửa chữa tổn thương ADN và điều chỉnh đáp ứng miễn dịch [30]
HDACi và tế bào ung thư Chu trình tế bào
Hình thành mạch máu mới Đáp ứng miễn dịch Sửa chữa
Hình 1.4 Các quá trình trong tế bào ung thư bị ảnh hưởng bởi HDACi
1.2.2.1 HDACi tác động lên chu trình tế bào
Bằng cách làm tăng cường sự điều hoà biểu hiện của chất ức chế kinase phụ thuộc cylcin (cyclin-dependent kinase – CDK), chẳng hạn như protein p21, các HDACi có thể gây ra sự bắt giữ chu trình tế bào ở phase G0/G1, G1/S hoặc G2/M [31, 32] Sự cảm ứng protein p21 làm gián đoạn quá trình sản xuất dimer từ cyclin và CDK, do đó ức chế sự biệt hóa tế bào Bên cạnh đó, một chất ức chế CDK khác là protein p53, có thể điều chỉnh sự biểu hiện của protein p21 thông qua liên kết với promotor của nó [33] Quá trình deacetyl hóa protein p53, bị ức chế bởi các HDACi, có thể cải thiện hơn nữa sự tương tác của nó với protein p21 Sự tăng sinh bất thường của tế bào đã được biết đến như một yếu tố quan trọng trong bệnh ung thư, do đó, sự thay đổi biểu sinh này có thể tạo ra những ảnh hưởng thiết yếu trong quá trình phát sinh ung thư [34]
1.2.2.2 HDACi tác động lên quá trình chết theo chương trình
Các HDACi đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình chết theo chương trình (apoptosis) cả nội bào và ngoại bào, dẫn đến việc loại bỏ các tế bào bị hoại tử [35] Một mặt, các HDACi có thể làm tăng biểu hiện của một số thụ thể gây chết (DR4, DR5) với con đường ngoại bào trong tế bào ung thư [36] Caspase-8 và 10 có thể được kích hoạt bởi tương tác của DR4 và DR5 với thụ thể hoại tử khối u (tumor necrosis factor – TNF) và các phối tử của chúng, do đó gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào [37] Mặt khác, các HDACi cũng có thể điều chỉnh con đường chết theo chương trình nội bào bằng cách điều chỉnh chất ức chế chết theo chương trình, hoặc điều chỉnh tương tác của vùng chết với phức hợp tín hiệu gây chết [38] Ngoài ra, các HDACi có thể gây ra quá trình chết theo chương trình theo con đường nội bào bằng cách thúc đẩy giải phóng cytochrom c từ màng ty thể, dẫn đến việc kích hoạt caspase-9 [39]
1.2.2.3 HDACi ảnh hưởng đến sự hình thành mạch máu mới
Với tác dụng chủ yếu là kháng sinh mạch, các HDACi đã được chứng minh là điều chỉnh sự hình thành mạch (angiogenesis) thông qua các cơ chế khác nhau [40] Các HDACi không chỉ làm giảm sự biểu hiện quá mức của yếu tố gây thiếu oxy-1α (hypoxia- inducible factor-1α – HIF-1α), mà còn làm tăng biểu hiện của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (vascular endothelial growth factor – VEGF) trong một số loại ung thư, dẫn đến sự giáng hoá của HIF-1α [41] Bên cạnh đó, các HDACi còn có thể làm tăng hàm lượng các protein chống tạo mạch như activin A và thrombospondin-1, do đó ảnh hưởng đến sự tạo mạch của các tế bào nội mô [42]
1.2.2.4 HDACi ảnh hưởng tới quá trình sửa chữa ADN
Do bộ máy sửa chữa tổn thương ADN (DNA damage repair – DDR), các tế bào ung thư có thể giảm nhạy cảm với liệu pháp hóa trị và xạ trị [43] Khi kết hợp với các HDACi, quá trình gây tổn thương ADN có thể được gia tăng, chứng tỏ rằng sự ức chế HDAC ngăn chặn khả năng sửa chữa đứt gãy sợi kép của ADN Một số chất HDACi, chẳng hạn như TSA và SAHA, có thể điều chỉnh quá mức biểu hiện của protein tái tổ hợp A (recombination protein A) và ung thư vú, do đó ức chế các cơ chế tái tổ hợp tương đồng/không tương đồng tham gia sửa chữa tổn thương ADN [44, 45] Bên cạnh đó, các HDACi có thể điều chỉnh tăng cường quá trình tạo ra các gốc tự do chứa oxy (reactive oxygen species – ROS), gây ra các tổn thương ADN và gây chết tế bào trong các tế bào kháng apoptosis [46]
1.2.2.5 HDACi ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của tế bào
Các HDACi có thể điều chỉnh biểu hiện của các phân tử đáp ứng miễn dịch, chẳng hạn như các phân tử đồng kích thích (costimulatory molecule), do đó điều chỉnh tăng trình diện kháng nguyên, gây kích hoạt tế bào T [47] Các chất ức chế HDAC nhóm
I đã được chứng minh là mục tiêu miễn dịch thích ứng thông qua sự tăng cường chức năng của các tế bào CD8+ và các tế bào tiêu diệt tự nhiên (natural killer) [48] Hơn nữa, các chất ức chế HDAC nhóm II có thể nhắm mục tiêu các tế bào T điều hòa (regulatory
T cells – Tregs) Ngoài ra, các chất ức chế HDAC6 có thể cải thiện khả năng ngăn chặn checkpoint miễn dịch (immune checkpoint blockade – ICB) trong khối u ác tính [49]
1.2.3 Cấu trúc chung của các HDACi
Kĩ thuật phân tích HDLP (histon deacetylase-like protein – protein tương tự HDAC) cho thấy các vùng cấu trúc quan trọng đối với tất cả các HDAC Cấu trúc tinh thể của HDLP với hai chất ức chế là trichostatin A (TSA) và vorinostat (SAHA) đã cung cấp khá đầy đủ thông tin cho việc hình thành mô hình pharmacophore đầu tiên của các chất HDACi Mô hình này chia phân tử thành ba phần (Hình 1.5) là nhóm gắn kẽm (zinc-binding group – ZBG), vùng cầu nối (Linker) và nhóm nhận diện bề mặt (Cap-group) [50]:
+ Vùng ZBG ở dưới đáy của kênh có vai trò tương tác với Zn 2+ tại vị trí liên kết và các acid amin xúc tác khác (Tyr và các His từ hai cặp acid amin Asp-His)
+ Vùng cầu nối có vai trò kết nối vùng ZBG với phần còn lại của khung pharmacophore, có vai trò trong tương tác với kênh enzym kỵ nước hình ống được hình thành bởi hai acid amin Phe
+ Vùng nhận diện bề mặt có vai trò tương tác với các acid amin trên bề mặt kênh enzym Đây là phần giúp các chất ức chế HDAC nhận diện bề mặt, chúng còn có tên khác là nhóm mũ (Cap-group)
KHUNG BENZIMIDAZOL
1.3.1 Giới thiệu về khung benzimidazol
Benzimidazol là một bộ khung quan trọng, nổi lên vào những năm 1950 khi các nhà khoa học phát hiện hợp chất 5,6-dimethylbenzimidazol là sản phẩm thoái hóa của vitamin B12 [67] Các benzimidazol có nhiều hoạt tính sinh học, chẳng hạn như kháng nấm, chống viêm, chống dị ứng, kháng virus, kháng ung thư,…[68-71] Hoạt tính đa dạng của các benzimidazol có thể bắt nguồn từ các nhóm thế khác nhau trên vòng thơm [72, 73] Do đó, việc thay đổi các nhóm thế này trên khung benzimidazol có thể làm tăng thêm lực tương tác protein-phối tử và dẫn đến sự cải thiện về hoạt tính Một số
NH 2 i) AcOH, EtOH, 4 giờ ii) DIEA, DMF, 1 giờ
K 2 CO 3 , Cu, DMSO, 3 giờ, nhiệt độ phòng
EtOH, 2 giờ, nhiệt độ phòng
DMF, 9 giờ, nhiệt độ phòng
DIEA, DMAP, DCM, 8 giờ, nhiệt độ phòng
MeOH, 2 giờ, nhiệt độ phòng Cl
Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp Citarinostat công thức thuốc/ứng cử viên làm thuốc (Hình 1.5) với bộ khung benzimidazol đã được biết đến như Flubendazol, Bilastin, Omeprazol, Liarozol…[74]:
1.3.2 Khung benzimidazol và hoạt tính kháng ung thư
Benzimidazol có cấu trúc giống với nucleotid purin tự nhiên, cho phép chúng dễ dàng tiếp xúc với các polymer sinh học trong các hệ thống sống Benzimidazol và các dẫn chất của nó có vai trò quan trọng như chất ức chế topoisomerase, tác nhân alkyl hoá và xen giữa ADN, chất đối kháng thụ thể androgen, chất ức chế protein kinase, ức chế dihydrofolate reductase và ức chế vi ống [75, 76] Các dẫn chất của benzimidazol cũng đã được báo cáo là hoạt động như yếu tố điều chỉnh biểu sinh với hoạt tính kháng ung thư đầy triển vọng Một số ví dụ (Hình 1.9) về ứng cử viên làm thuốc điều trị ung thư chứa bộ khung benzimidazol đã được thử nghiệm lâm sàng các pha có thể kể đến như Pracinostat, Bendamustin và Nocodazol [74]:
Omeprazol (Ức chế bơm proton)
Hình 1.8 Một số công thức thuốc/ứng cử viên làm thuốc chứa vòng benzimidazol
1.3.3 Các dẫn chất acid hydroxamic chứa vòng benzimidazol
Pracinostat, còn được gọi là SB939, với cấu trúc chứa nhóm acid hydroxamic và đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II SB939 có khả năng ức chế HDAC nhóm I,
II và IV So với SAHA, SB939 đã cải thiện các đặc tính và dược động học và dược lực học, dẫn đến khả dụng sinh học đường uống cao và tích tụ nhiều trong khối u [9]
Quy trình tổng hợp Pracinostat (Sơ đồ 1.5) bởi nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự được công bố vào năm 2011, bao gồm 4 bước với hiệu suất tổng cộng là 61% [77] Bước đầu tiên là phản ứng este hoá của acid TQ15 Sau bước N-aryl hoá vào vòng thơm để hình thành TQ17, pentaldehyd được sử dụng để tạo vòng benzimidazol trong
4 giờ, hồi lưu Et 3 N, dioxan, 4 giờ, nhiệt độ phòng
AcOH, MeOH, 4 giờ, nhiệt độ phòng
MeOH, 2 giờ, nhiệt độ phòng
Hình 1.9 Một số hoạt chất chứa vòng benzimidazol đang được thử nghiệm lâm sàng
Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp Pracinostat chất trung gian TQ18 Cuối cùng là phản ứng tạo thành pracinostat (SB939) với tác nhân hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm được tạo ra bởi natri methylat
Minomustin, còn gọi là EDO-S101, có thể coi là một phân tử lai giữa vorinostat, một chất mang khung N-hydroxyheptanamid, và bendamustin, một chất mang khung benzimidazol Minomustin hiện đang được thử nghiệm lâm sàng phase I cho chỉ định điều trị ung thư máu ác tính [78]
Về mặt cơ chế tác dụng, EDO-S101 duy trì được khả năng alkyl hóa, đồng thời cũng ức chế HDAC Nó tạo ra liên kết chéo ADN bằng cách alkyl hóa mạnh gấp 5 lần so với melphalan và gấp 10 lần so với bendamustin Hoạt tính ức chế HDAC tổng của EDO-S101 là cỡ nM, mạnh tương đương với vorinostat [10] EDO-S101 ở dạng phân tử tấn công các tế bào ung thư, đảm bảo tạo ra quá trình alkyl hóa và ức chế HDAC đồng
O OH HBr, DMF, 20 giờ, nhiệt độ phòng EtOH, 0 0 C, 4 giờ
THF, 10 giờ, nhiệt độ phòng
Sơ đồ 1.6 Quy trình tổng hợp Minomustin thời ở cùng một vị trí và tạo ra hiệu quả điều trị hiệp đồng Sự tiếp xúc đồng thời với cả hai tác nhân kháng ung thư với cơ chế khác nhau đã được chứng minh là rất quan trọng để đạt được hiệu quả điều trị tối đa [79]
Mehrling và cộng sự đã mô tả quy trình tổng hợp minomustin (Sơ đồ 1.6) với các bước như sau: đầu tiên là phản ứng tạo chất TQ20 chứa vòng benzimidazol từ TQ19 và acid suberic trong môi trường acid HBr Kế đến là phản ứng ester hoá nhóm carboxy tự do, tạo chất TQ21 Sau khi khử hoá nhóm nitro trên vòng benzimidazol thành amino, phân tử TQ22 tiếp tục được nối dài mạch bằng hai đương lượng ethylenoxid tạo diol TQ23 Dưới tác dụng của thionyl clorid (SOCl2), diol này chuyển thành dẫn chất dicloro
TQ24 trước khi tham gia phản ứng cuối cùng tạo ra minomustin [10].
ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC
Quá trình tìm kiếm các chất ức chế HDAC thường tiếp cận theo 3 hướng: thay đổi nhóm gắn kẽm, thay đổi vùng cầu nối và thay đổi nhóm nhận diện bề mặt
- Với hướng thay đổi nhóm gắn kẽm: nhiều hợp phần cấu trúc đã được tìm ra có khả năng tạo phức với coenzym Zn 2+ như các acid hydroxamic, các acid carboxylic, các thiol, các ceton vòng, các benzamid Trong đó hướng các acid hydroxamic thường được tập trung nghiên cứu nhiều nhất bởi chúng thường có cấu trúc đơn giản nhưng lại cho hoạt tính ức chế mạnh enzym HDAC [17] Nhóm các acid hydroxamic còn là hướng nghiên cứu phát triển thành công nhất khi có tới 3 trên 4 chất ức chế HDAC được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư đều có chứa nhóm acid hydroxamic [80] Vì vậy, đề tài luận văn quyết định đưa hợp phần này vào trong định hướng thiết kế cấu trúc các chất mới
- Với hướng thay đổi nhóm nhận diện bề mặt: đặc điểm thường thấy của nhóm nhận diện bề mặt là mang các vòng thơm, hệ vòng giàu điện tử hoặc chứa các nhóm chức thân dầu [81] Một hướng đi mới trong nghiên cứu phát triển các chất ức chế HDAC gần đây là sử dụng những khung cấu trúc có hoạt tính kháng ung thư làm nhóm nhận diện bề mặt Do đó, luận văn chọn khung benzimidazol với một số nhóm thế ở trên vòng trong thiết kế các phân tử acid hydroxamic mới Để mở rộng thêm các tương tác thân dầu, bộ khung benzimidazol được gắn thêm phần nhánh chứa vòng benzen nối với nhóm chức amin (-CH2NH-, dãy I)/amid (-CONH-, dãy II) với các nhóm thế khác nhau nhằm xác định mối liên quan cấu trúc – tác dụng và từ đó đưa ra được nhóm thế tối ưu cho độc tính với tế bào ung thư
- Với vùng cầu nối: nhiều kiểu cấu trúc cầu nối đã được thay đổi và đã có một số kết luận về mối liên quan cấu trúc tác dụng Chiều dài vùng cầu nối từ 5 đến 6 carbon là phù hợp với chiều dài của kênh enzym và do đó có lợi cho hoạt tính ức chế enzym HDAC [82] Do đó, mạch thẳng 6 carbon ở cầu nối (ứng với công thức các dẫn chất của N-hydroxyheptanamid) được chọn trong định hướng thiết kế các dẫn chất của đề tài luận văn này
Tổng kết lại, hai dãy chất mới được định hướng thiết kế cấu trúc vừa là dẫn chất của N-hydroxyheptanamid, vừa có khung benzimidazol, gắn thêm vòng benzen với một số nhóm thế thông qua cầu nối methylen amin hoặc amid (Hình 1.10)
Nhóm R a: H b: 2-Cl c: 3-Cl d: 4-Cl e: 4-F f: 4-Br g: 4-CH 3
Hình 1.10 Định hướng thiết kế cấu trúc các chất N-hydroxyheptanamid mới
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU
Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp: đạt tiêu chuẩn cho tổng hợp hóa dược (tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR), được đặt mua từ các nhà cung cấp trong nước hoặc nước ngoài (Merck, Sigma-Aldrich) Một số dung môi dùng để chiết tách, phân lập được mua từ các nhà cung cấp của Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua bất kỳ quá trình tinh chế nào
STT Tên hoá chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc
14 Acid acetic (CH3COOH) AR Trung Quốc
15 Acid hydrocloric (HCl) AR Trung Quốc
16 Dicloromethan (CH2Cl2) AR Trung Quốc
17 Ethyl acetat (CH3COOC2H5) AR Trung Quốc
18 Hydroxylamin hydroclorid (NH2OH.HCl) AR Trung Quốc
19 Kali carbonat (K2CO3) AR Trung Quốc
Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong thực nghiệm
20 Kali iodid (KI) AR Trung Quốc
21 Methanol (CH3OH) AR Trung Quốc
23 Natri cyanoborohydrid (NaBH3CN) AR Trung Quốc
24 Natri hydrocarbonat (NaHCO3) AR Trung Quốc
25 Natri hydroxid (NaOH) AR Trung Quốc
26 Natri sulfat khan (Na2SO4) AR Trung Quốc
28 Sắt (III) clorid (FeCl3) AR Trung Quốc
29 Thiếc (II) clorid dihydrat (SnCl2.2H2O) AR Trung Quốc
THIẾT BỊ
- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 – 100 mL, bình chiết, sinh hàn hồi lưu, ống nghiệm, ống đong, pipet, cốc có mỏ các loại
- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Camag bước sóng 254 nm và 366 nm, bản mỏng silicagel F254 (Merck)
- Cân phân tích Shimazu, cân kỹ thuật Shimazu
- Tủ ấm lạnh Memmert, tủ sấy Memmert
- Máy cất quay Buchi R-210, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital
- Máy đo phổ hồng ngoại:
+ Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
+ Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (Agilent technology, Santa Clara, California, United States) – Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân:
+ Bruker AC-500 MHz, khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Tủ nuôi cấy Vision scientific Co.Ltd (Model VS-9108 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean beach)
- Tủ lạnh giữ môi trường nuôi cấy, bồn làm ấm môi trường nuôi cấy đến 37 ºC Jeio tech SWB-03 Tủ giữ mẫu -18 ºC (DIOS)
- Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) tại khoa Dược, Đại học Chungbuk, Hàn Quốc.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Tổng hợp và tinh chế 10 dẫn chất N-hydroxyheptanamid mới mang khung benzimidazol (2 dãy I và II):
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng
- Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng độ phân giải cao (HRMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H- NMR, 13 C-NMR)
- Đánh giá độc tính của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào người
Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp và tinh chế 10 dẫn chất N-hydroxyheptanamid mới
Nhóm R a: H b: 2-Cl c: 3-Cl d: 4-Cl e: 4-F f: 4-Br g: 4-CH 3
Hình 2.1 Các dẫn chất tổng hợp trong luận văn
Luận văn sử dụng các loại phản ứng:
Phản ứng N-alkyl hoá; phản ứng khử hóa với tác nhân SnCl2; phản ứng amin hóa – khử với NaBH3CN; phản ứng amid hoá sử dụng tác nhân clorid acid; Phản ứng tạo acid hydroxamic bằng hydroxylamin hydroclorid trong kiềm
Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất được trình bày dưới đây:
2.3.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết Đề tài luận văn sử dụng hai phương pháp: đo nhiệt độ nóng chảy và chạy sắc ký lớp mỏng (TLC):
- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital
- Sắc ký lớp mỏng: dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành:
+ Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254
Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất N-hydroxyheptanamid trong luận văn
+ Hệ dung môi pha động tùy thuộc vào chất phân tích
+ Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và đưa lên bản mỏng với thể tích phù hợp
+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở điều kiện phòng và để pha động chạy trên bản mỏng Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
2.3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp
Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ như sau:
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Quét phổ trong vùng 4000 – 400 cm -1 và ghi phổ ở độ phân giải 4 cm -1
- Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS): được ghi bằng máy khối phổ Agilent
6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (Agilent technology, Santa Clara, California, United States) tại Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun mù bụi điện tử ESI (electrospray inonization), dung môi MeOH
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d 6
2.3.2.4 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào
Nguyên tắc: Xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density – OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị
Thử hoạt tính kháng tế bào (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB [83] và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits [84] Dòng tế bào thử nghiệm sử dụng:
SW620: tế bào ung thư đại tràng người
MDA-MB-231: tế bào ung thư vú
MRC-5: tế bào lưỡng bội bào thai người
Chất đối chiếu dương tính: Vorinostat (SAHA), ADR (Adriamycin)
Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung: L-glutamin, penicillin/ streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và FBS (huyết thanh bò chửa) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:
Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM được bổ sung 5% FBS và điều chỉnh đến nồng độ 3 x 104 tế bào/ml, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 180 μl Các đĩa sau đó được ủ ở 37 o C trong điều kiện 5% CO2
Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 μl môi trường DMEM bổ sung 5% FBS từ dung dịch gốc trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi được đưa vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ trong 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%
Tế bào sống protein tế bào
Hấp thụ tại bước sóng 560nm Rửa
Hình 2.2 Nguyên tắc đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư
* Cố định tế bào và nhuộm màu
Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 μl dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4oC trong 1h để tế bào tự tái tạo, rồi sau đó rửa 5 lần với nước cất, loại bỏ phần nước dư
Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với sulforhodamin B (SRB) 0,04% trong acid acetic 1% Thời gian nhuộm là 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm tự do, không kết dính Loại bỏ hết acid acetic còn dư và để các đĩa khô ngoài không khí
* Đo độ hấp thụ màu
Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10mM Trizma-base không đệm (pH 10,5), đồng thời đặt đĩa trong máy lắc trong 10 phút Độ hấp thụ được đọc bằng thiết bị ELISA ở bước sóng 510 nm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
HOÁ HỌC
3.1.1.1 Tổng hợp 7-(5-(benzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid và dẫn chất (5a-g)
Dãy chất I được tổng hợp theo quy trình trong Sơ đồ 3.1 dưới đây:
* Tổng hợp 7-(5-(benzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5a)
Chất 5a được tổng hợp qua 4 phản ứng:
+ Đầu tiên là phản ứng N-alkyl hoá: Hoà tan 4,0 mmol 5-nitro-1H- benzo[d]imidazol (chất 1) vào khoảng 10 mL DMF khan trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL Thêm 685 mg K2CO3 (5,0 mmol) vào bình phản ứng rồi khuấy hỗn hợp ở
60 ℃ trong khoảng 60 phút, sau đó thêm tiếp 33,2 mg (0,2 mmol) KI Tiếp tục khuấy hỗn hợp thêm 15 phút rồi thêm từ từ từng giọt dung dịch chứa ethyl 7-bromoheptanoat (4.0 mmol) trong dung môi DMF (2 mL) vào hỗn hợp Nhiệt độ tiếp tục được duy trì ở
60 °C tới khi phản ứng kết thúc (theo dõi tiến trình bằng TLC) Sau đó, hỗn hợp được
HOHN R a, R = H b, R = 2-Cl c, R = 3-Cl d, R = 4-Cl e, R = 4-F f, R = 4-Br g, R = 4-CH 3
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp dãy chất I làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm nước cất lạnh (30 mL) để tạo kết tủa Kết tủa được lọc rồi sấy khô ở 40 °C trong 24 giờ Sản phẩm thu được là chất rắn màu vàng nhạt chứa hỗn hợp các chất 2 và 2’ với tỉ lệ khối lượng gần bằng nhau
+ Phản ứng thứ hai là phản ứng khử hoá: Hoà tan toàn bộ hỗn hợp chất 2 và 2’
(khoảng 3,0 mmol) vừa thu được vào khoảng 30 mL ethyl acetat trong bình cầu sạch dung tích 50 mL Thêm tiếp 3,38 g SnCl2.2H2O (15 mmol) và 2 giọt acid acetic băng rồi khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ thường trong khoảng 4 giờ Sau phản ứng, làm lạnh hỗn hợp rồi thêm khoảng 50 mL nước cất Tiếp tục trung hoà hỗn hợp bằng natri carbonat rồi lọc qua celit để loại bỏ các tạp chất rắn (muối kim loại, hydroxid kim loại) rồi chiết sản phẩm sang pha hữu cơ bằng ethyl acetat (3 lần x 30 mL/lần) Gộp dịch chiết, làm khan bằng natri sulfat, sau đó cô quay dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô là chất rắn màu trắng hơi vàng Sử dụng sắc kí cột (silica gel, DCM: MeOH = 98:2) tách được 2 đồng phân amin là chất 3 và 3’ (đồng phân vị trí nhóm NO2- trên vòng benzimidazol) với tỉ lệ khối lượng tương đương nhau Đồng phân amin 3 được sử dụng cho phản ứng tiếp theo
+ Phản ứng thứ ba là phản ứng amin hoá – khử: Hoà tan 1 mmol chất 3 vào khoảng 10 mL methanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL Thêm 2 giọt acid acetic đặc rồi thêm tiếp 1 mmol benzaldehyd vào bình phản ứng Khuấy hỗn hợp trong khoảng 15 phút rồi thêm từ từ từng giọt 1 mL dung dịch chứa 50 mg natri cyanoborohydrid (NaBH3CN) trong methanol và khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 6-8 giờ Khi phản ứng kết thúc, làm bay hơi dung môi rồi thêm khoảng 10 mL nước cất vào hỗn hợp Tiếp tục chiết lấy pha hữu cơ bằng dicloromethan (DCM) rồi cô quay dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc kí cột (silica gel, DCM:MeOH = 96:4) thu được chất lỏng màu vàng là amin 4a
+Phản ứng cuối cùng là phản ứng tạo acid hydroxamic: Hoà tan hoàn toàn este
4a vào khoảng 10 mL methanol trong bình cầu sạch dung tích 50 mL Thêm 685 mg (10 mmol) hydroxylamin hydroclorid rồi thêm từ từ từng giọt dung dịch NaOH (400 mg hoà tan trong 1 mL nước cất) đến khi pH đạt giá trị khoảng 12 Liên tục làm lạnh bên ngoài hỗn hợp bằng nước đá, để duy trì nhiệt độ ở 0 ℃ trong bình cầu tới khi phản ứng kết thúc (1-2 giờ) Sau đó, thêm 20 mL nước cất lạnh vào bình phản ứng, trung hoà hỗn hợp
(pH khoảng 7) bằng dung dịch HCl 5% để kết tủa sản phẩm thô Lọc và rửa kết tủa rồi kết tinh lại trong methanol, thu được sản phẩm 5a Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5b)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5b tương tự như chất 5a, với tác nhân amin hoá - khử là 2-clorobenzaldehyd trong phản ứng thứ ba Sản phẩm 5b thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C- NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5c)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5c tương tự như chất 5a, với bước phản ứng amin hoá - khử sử dụng tác nhân 3-clorobenzaldehyd Sản phẩm 5c thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5d)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5d tương tự như chất 5a, với tác nhân amin hoá - khử trong phản ứng thứ ba là 4-clorobenzaldehyd Sản phẩm 5d thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C- NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((4-fluorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5e)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5e tương tự như chất 5a, tác nhân amin hoá - khử là 4-fluorobenzaldehyd Sản phẩm 5e thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((4-bromobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5f)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5f tương tự như chất 5a, với phản ứng amin hoá - khử sử dụng tác nhân 4-bromobenzaldehyd Sản phẩm 5f thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 7-(5-((4-methylbenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5g)
Các bước tiến hành tổng hợp chất 5g tương tự như chất 5a, với tác nhân amin hoá - khử là 4-methylbenzaldehyd Sản phẩm 5g thu được là chất rắn màu trắng Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
3.1.1.2 Tổng hợp N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)benzamid và dẫn chất (7a-c)
Dãy chất II được tổng hợp theo quy trình trong Sơ đồ 3.2 dưới đây:
* Tổng hợp N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)benzamid (7a)
Chất 7a được tổng hợp qua 4 phản ứng:
+ Cách thức tiến hành hai phản ứng đầu tiên (N-alkyl hoá và khử hoá) hoàn toàn
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp dãy chất II giống với quy trình tổng hợp chất 5a Sau khi tinh chế bằng sắc kí cột, thu được amin 3
+ Phản ứng thứ ba là phản ứng tạo amid: Hoà tan amin 3 (1 mmol) vào DCM (30 mL) trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL, thêm 122 mg DMAP (1,1 mmol) rồi khuấy hỗn hợp trong khoảng 10 phút Thêm tiếp 1,2 mmol benzoyl clorid vào bình phản ứng rồi khuấy ở 40 °C trong 12 giờ Sau khi phản ứng kết thúc (theo dõi tiến trình bằng TLC), làm bay hơi dung môi dưới áp suất giảm, rồi thêm vào bình một lượng dung dịch NaHCO3 5% để điều chỉnh pH về khoảng 7, thu được kết tủa trắng Lọc kết tủa rồi rửa bằng nước lạnh sau đó sấy khô ở 60 °C Chất rắn sau khi làm khô được tinh chế bằng sắc kí cột (silicagel, DCM:MeOH = 95:5) thu được este 6a
+ Phản ứng cuối cùng là phản ứng tạo acid hydroxamic: Hoà tan hoàn toàn este
6a vào khoảng 10 mL methanol trong bình cầu sạch dung tích 50 mL Thêm 343 mg (5 mmol) hydroxylamin hydroclorid rồi thêm từ từ từng giọt dung dịch NaOH (200 mg hoà tan trong 1 mL nước cất) đến khi pH đạt giá trị khoảng 12 Liên tục làm lạnh bên ngoài hỗn hợp bằng nước đá, để duy trì nhiệt độ ở 0 ℃ trong bình cầu tới khi phản ứng kết thúc (1-2 giờ) Sau đó, thêm 20 mL nước cất lạnh vào bình phản ứng, trung hoà hỗn hợp (pH khoảng 7) bằng dung dịch HCl 5% để kết tủa sản phẩm thô Lọc và rửa kết tủa rồi kết tinh lại trong methanol, thu được sản phẩm 7a Giá trị hiệu suất, nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf được trình bày ở mục 3.1.2 Sản phẩm được xác định cấu trúc bằng các dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
* Tổng hợp 4-cloro-N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)benzamid (7b)
HOẠT TÍNH SINH HỌC
- Các chất 5a-g và 7a-c đều được đánh giá hoạt tính gây độc in vitro trên 3 dòng tế bào: tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào lưỡng bội bào thai người (MRC-5) với 2 chất đối chứng dương là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) và adriamycin (ADR) Thử nghiệm được đánh giá thông qua giá trị IC50 (nồng độ của chất tại đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào) và tỉ lệ sống sót của từng dòng tế bào sau khi ủ với các dẫn chất ở nồng độ 10 μM Các kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 3.6 và Bảng 3.7
- Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Hàn Quốc
STT Chất Log P 1 Tỉ lệ tế bào sống sót 2 (%)
Chú thích: 1 Tính toán bằng phần mềm ChemDraw 16.0; 2 Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (ung thư đại tràng), MDA-MB-231 (ung thư vú), lưỡng bội bào thai người (MRC-5), nồng độ các dẫn chất là 10 μM; 3 SAHA: acid suberoylanilid, chất đối chiếu dương tính; 4 ADR: adriamycin, chất đối chiếu dương tính
Hầu hết các dẫn chất đều không làm giảm tỉ lệ sống sót trên các dòng tế bào thử nghiệm (ngoại trừ chất 5f, 7b và 7c) Sau khi sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0 để tính toán, các giá trị IC50 được trình bày trong Bảng 3.7 a, R = H e, R = 4-F b, R = 2-Cl f, R = 4-Br c, R = 3-Cl g, R = 4-CH 3 d, R = 4-Cl
Bảng 3.6 Tỉ lệ sống sót của từng dòng tế bào sau khi xử lý với các dẫn chất
STT Chất Log P 1 Độc tớnh trờn từng dũng tế bào 2 (IC 50 , 3 àM±SEM)
Chú thích: 1 Tính toán bằng phần mềm ChemDraw 16.0; 2 Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (ung thư đại tràng), MDA-MB-231 (ung thư vỳ), lưỡng bội bào thai người (MRC-5); 3 Nồng độ (àM) của chất thử tại đó gây giảm 50% sự phát triển tế bào hoặc 50% hoạt tính của enzym, dữ liệu là kết quả trung bình của 3 lần thử nghiệm độc lập với độ lệch chuẩn không quá 10%; 4 SAHA: acid suberoylanilid, chất đối chiếu dương tính; 5 ADR: adriamycin, chất đối chiếu dương tính
Ngoại trừ chất chất 5f, 7b và 7c, tất cả các dẫn chất trong 2 dãy I và II đều cho giỏ trị IC vượt quỏ 30 àM, cao hơn so với 2 chất chứng dương SAHA và ADR a, R = H e, R = 4-F b, R = 2-Cl f, R = 4-Br c, R = 3-Cl g, R = 4-CH 3 d, R = 4-Cl
Bảng 3.7 Kết quả độc tính của các dẫn chất trên từng dòng tế bào
BÀN LUẬN
BÀN LUẬN VỀ TỔNG HỢP HOÁ HỌC
Trong sự có mặt của KI, ethyl 7-bromoheptanoat được thay thế ion Br - bởi kali iodid, tạo chất trung gian ethyl 7-iodoheptanoat với ion I - đi ra dễ hơn, làm tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng thế kế tiếp Đây là phản ứng Finkelstein: dẫn chất R-I được tạo ra do KBr ít tan hơn trong dung môi DMF nên dễ dàng tách ra khỏi hệ phản ứng, tạo lợi thế về mặt nhiệt động, làm phản ứng dịch chuyển theo chiều tạo dẫn chất iodid
Dưới tác dụng của tác nhân base là K2CO3, proton linh động (nhóm N-H trên vòng benzimidazol) bị loại đi, sinh ra một anion trung gian với hai công thức cộng hưởng (1-1 và 1-2) mang điện tích âm trên các nguyên tử N trong vòng thơm Hai anion trung gian này đóng vai trò là tác nhân ái nhân tiếp tục tấn công vào vị trí 7-iodo của ester trung gian (phản ứng thế lưỡng phân tử) Kết quả là sau phản ứng 1, hình thành 2 chất
Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng N-alkyl hoá
2 và 2’ với sự khác biệt duy nhất về vị trí nhóm thế -NO2 lần lượt là 5- và 6- tương ứng trên vòng benzimidazol
Cơ chế đề xuất cho phản ứng này được minh hoạ trong Sơ đồ 4.2, dựa theo tài liệu tham khảo [85]:
Thiếc (II) clorid trong môi trường acid HCl đóng vai trò là tác nhân khử hoá nhóm nitro thành amino Do trên nguyên tử thiếc còn orbital trống, hai ion clorid có thể tạo phức tứ diện [SnCl4] 2- với SnCl2, phức này tiếp tục tạo liên kết cộng hoá trị cho – nhận với ion H + , hình thành ion phức mới dạng lưỡng tháp tam giác [HSnCl4] -
Bước tiếp theo là sự tấn công ái nhân của ion H - vào nguyên tử N dương điện trên nhóm -NO2 gắn với vòng benzimidazol, hình thành muối SnCl4 và chất trung gian
TG1 Chất trung này trong môi trường acid sẽ tách một phân tử nước, tạo TG2 Quá trình khử hoá được tiếp tục đối với TG2, tạo TG3 với 2 nguyên tử H gắn với N trên
Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng khử hoá vòng benzimidazol Nhóm OH cuối cùng trong TG3 được loại đi (dưới dạng một phân tử nước) nhờ cơ chế thế ái nhân lưỡng phân tử với tác nhân [HSnCl4] - , kết quả là tạo thành sản phẩm muối amoni của 3 và 3’
4.1.3 Phản ứng amin hoá – khử
Cơ chế đề xuất cho phản ứng này được minh hoạ trong Sơ đồ 4.3, dựa theo tài liệu tham khảo [86]
Phản ứng amin hoá – khử trải qua 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: Do tính chất giàu điện tử, nguyên tử O của nhóm -CHO trên các benzamid có thể nhận proton từ môi trường acid, điều này khiến nguyên tử C nối với O trong nhóm aldehyd càng dương điện, và do đó có thể bị tấn công bởi tác nhân amin bậc
I là Ar 1 -NH 2 (3) Chất trung gian sau khi trao đổi proton sẽ tách loại một phân tử nước, tạo muối iminium trung gian với điện tích dương trên nguyên tử N, làm tăng tính ái điện tử của nguyên tử C kế cận
+ Giai đoạn 2: Sau khi tạo thành trung gian là muối iminum, tác nhân cyanoboronhydrid sẽ tấn công ái nhân vào nguyên tử C dương điện trên muối này, để trung hoà điện tích dương Và do đó một ion H - được cộng thêm vào liên kết đôi C=N, kết quả là hình thành được sản phẩm amin bậc 2, tương ứng với các chất 4a-g
Nhóm R a: H b: 2-Cl c: 3-Cl d: 4-Cl e: 4-F f: 4-Br g: 4-CH 3
Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng amin hoá – khử
Cơ chế đề xuất cho phản ứng ghép cặp tạo amid được thể hiện trong Sơ đồ 4.4:
Bước đầu tiên trong tiến trình phản ứng là quá trình tấn công ái nhân của DMAP với các benzoyl clorid, loại đi ion clorid (Cl - ) tạo chất trung gian N-acylpyridium Chất trung gian này không bền nên nhanh chóng bị tấn công ái nhân bởi amin 3 (Ar1NH2) có trong hỗn hợp phản ứng, loại đi xúc tác DMAP và sau đó là trao đổi proton để tạo thành sản phẩm amid (6a-c)
Như vậy, trong phản ứng N-acyl hóa, xúc tác 4-dimethylaminopyridin (DMAP) có vai trò tạo trạng thái trung gian hoạt động, giúp amin dễ phản ứng hơn đồng thời trung hòa HCl mới sinh, làm cân bằng của phản ứng dịch chuyển theo chiều thuận, giúp tăng hiệu suất quá trình amid hóa [87]
Có nhiều tác nhân thường được lựa chọn để thực hiện phản ứng amid hóa như acid carboxylic, este, anhydrid, acid halid hoặc acyl azid [87] Tuy nhiên, sau khi so sánh các tác nhân này về sự thuận lợi cho thao tác, sự sẵn có cũng như giá thành của nguyên liệu, chúng tôi đã lựa chọn sử dụng các benzoyl clorid làm tác nhân cho phản ứng trong luận văn Đây là một tác nhân phản ứng mạnh, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ Nhược điểm của tác nhân này là rất nhạy cảm với nước (thuỷ phân tạo
Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng tạo amid acid carboxylic), do đó dung môi phản ứng cần được làm khan và bình phản ứng phải kín, tránh hơi ẩm Vì các benzoyl clorid có thể dễ dàng được loại bỏ khi xử lí trong môi trường kiềm nên tác nhân này được sử dụng với lượng dư (khoảng 1,2 đương lượng) nhằm làm tăng hiệu suất phản ứng
4.1.5 Phản ứng tạo acid hydroxamic
Cơ chế của phản ứng tạo acid hydroxamic được mô tả trong Sơ đồ 4.5 dưới đây:
Về mặt lí thuyết, có thể sử dụng trực tiếp hydroxylamin dạng base để thực hiện phản ứng tạo thành các acid hydroxamic Tuy nhiên, dạng base này không bền, dễ phân huỷ, khó bảo quản Vì vậy, luận văn đã sử dụng nguyên liệu ban đầu là dạng muối hydroclorid và do đó trong môi trường kiềm NH2OH tự do sẽ được giải phóng Lượng hydroxylamin cũng được dùng dư so với este (khoảng 10 đương lượng) để tăng hiệu suất phản ứng
Một tác nhân khác cũng có vai trò quan trọng trong phản ứng tạo acid hydroxamic là NaOH Lượng NaOH dư được thêm vào hỗn hợp phản ứng với mục đích chuyển hết
BÀN LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
Phổ hồng ngoại (IR) là kỹ thuật dựa vào sự dao động của các liên kết và sự quay của các nguyên tử trong phân tử Cụ thể phổ IR nhận được bằng cách cho tia bức xạ IR qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lượng nhất định Năng lượng tại pic bất kỳ trong phổ hấp thụ xuất hiện tương ứng với tần số dao động của một phần trong phân tử mẫu [89]
Vùng phổ hồng ngoại IR thường được chia làm hai vùng: vùng hồng ngoại gần và vùng hồng ngoại xa, nhưng vùng phổ có ý nghĩa nhất trong xác định cấu trúc là từ
4000 đến 400 cm -1 Dữ liệu phổ IR cung cấp thông tin về các dải hấp thụ đặc trưng cho các dao động hóa trị và dao động biến dạng đặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết trong cấu trúc của chất phân tích Trong vùng từ 4000-400 cm -1 , phổ IR thường được chia làm hai vùng nhỏ hơn: vùng nhóm chức 4000-1500 cm -1 và vùng vân tay 1500-650 cm -1 Vùng nhóm chức thường cung cấp được thông tin về các dải hấp thụ đặc trưng của các liên kết trong các nhóm chức Trong khi đó cùng vân tay thường xuất hiện nhiều pic chồng chập nhau do mức năng lượng tương ứng của vùng này có thể được hấp thụ bởi nhiều liên kết với các dao động khác nhau [89] Do vậy, luận văn sẽ tập trung biện giải các kết quả vùng nhóm chức, từ đó đưa ra kết luận sơ bộ về cấu trúc của các dẫn chất được tổng hợp
Có thể nhận dạng sự xuất hiện của một số nhóm chức, một số liên kết thông qua các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR Căn cứ các kết quả trên phổ đồ và các giá trị tham khảo trong tài liệu [89] có thể biện luận một số nhóm chức như sau:
+ Khoảng từ 3370-3323 cm -1 có sự xuất hiện của dao động hóa trị liên kết N-H trong nhóm chức acid hydroxamic và nhóm chức amid
+ Khoảng từ 3269-3242 cm -1 cũng thể hiện vân hấp thụ khá rõ nét và tù tương ứng với dao động hóa trị của liên kết O-H trong nhóm chức acid hydroxamic
+ Khoảng từ 2859-2853 cm -1 có thể giúp nhận biết dao động hóa trị của liên kết C-H sp 3 và 3103-3032 cm -1 là dao động hóa trị của liên kết C-H sp 2
+ Khoảng từ 1645-1636 cm -1 xuất hiện đỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và sắc nét giúp nhận biết được dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm chức amid và nhóm chức acid hydroxamic
+ Khoảng từ 1597-1437 cm -1 cũng có thể nhận ra dao động hóa trị của liên kết C=C trên vòng thơm
Nhìn chung, việc có mặt của các dải hấp thụ tương ứng với liên kết C=O, N-H có thể đặc trưng cho liên kết amid trong cấu trúc của các dẫn chất Pic hấp thụ tương ứng với dao động hóa trị của liên kết O-H xuất hiện trên phổ các dẫn chất và thường có đỉnh hấp thụ mạnh, có chân rộng và tù nên có thể che chắn các pic khác Sự xuất hiện các pic tương ứng với liên kết N-H và OH giúp sơ bộ khẳng định được hợp phần acid hydroxamic của các dẫn chất đã được tổng hợp
Cấu trúc vòng thơm của các dẫn chất được xác định dựa vào các dải hấp thụ đặc trưng của các dao động hóa trị trong liên kết C-H sp 2 và C=C Liên kết C-H sp 2 được đặc trưng bởi dải hấp thụ có số sóng từ 3103 đến 3032 cm -1 , trong khi liên kết C=C được xác định dựa vào dải hấp thụ có số sóng từ 1597 đến 1437cm -1
Hình 4.1 Phổ đồ hồng ngoại (IR) của chất 5a
Như vậy, phổ hồng ngoại đã giúp sơ bộ khẳng định các hợp phần cấu trúc của 10 dẫn chất N-hydroxyheptanamid mới như: vòng thơm, cầu nối methylen, các nhóm chức như carbonyl, amid và acid hydroxamic Để có thêm thông tin khẳng định cấu trúc, 10 dẫn chất này tiếp tục được tiến hành đo phổ khối lượng
4.2.2 Phổ khối lượng độ phân giải cao
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hoà thành ion phân tử và các ion mảnh có số khối A = m/z (m là khối lượng, z là điện tích ion) Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi ra thu được phổ khối lượng Dựa vào dữ liệu phổ khối này có thể xác định phân tử khối, số khối của các mảnh ion bị phân mảnh và từ đó dự đoán cấu trúc phân tử của chất nghiên cứu [90]
Trên phổ đồ khối lượng phân giải cao (HRMS) của tất cả 10 dẫn chất N- hydroxyheptanamid được tổng hợp trong đề tài, pic có cường độ cao nhất đều tương ứng với giá trị m/z của các chất: [M+H] + với chế độ đo positive và [M-H] - với chế độ đo negative Ngoài ra, các dẫn chất có chứa Cl, Br đều xuất hiện các pic với các đồng vị
35Cl, 37 Cl và 79 Br, 81 Br tương ứng Do đó, có thể kết luận các dẫn chất được tổng hợp trong luận văn đều có công thức phân tử phù hợp với dự kiến thiết kế ban đầu
4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Ngoài dữ liệu phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, các dẫn chất được xác định chính xác cấu trúc thông qua dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR Phổ
Hình 4.2 Phổ đồ khối lượng độ phân giải cao (HRMS) của chất 5e
1H-NMR cung cấp thông tin về sự có mặt của các proton thông qua độ chuyển dịch hóa học, cường độ và độ bội của tín hiệu thông qua tương tác với các proton của carbon bên cạnh Phổ 13 C-NMR cung cấp thông tin về sự có mặt của các carbon thông qua độ chuyển dịch hóa học, số lượng các pic và tương tác của nguyên tử carbon 13 với các hạt nhân mang từ tính khác ngoài proton trong cấu trúc của chất phân tích [91]
4.2.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
* Phổ 1 H-NMR của các dẫn chất dãy I:
Nhìn chung, phổ 1 H-NMR của các chất dãy I (5a-g) đều xuất hiện các pic phù hợp với cấu trúc phân tử dự kiến Cụ thể:
+ Các proton của hợp phần hydroxamic có đặc điểm rất linh động, có thể dễ dàng trao đổi với dung môi pha mẫu Do đó, pic hấp thụ đặc trưng có dạng singlet giãn rộng và có thể không xuất hiện trên phổ đồ (chất 5c) Trong hợp phần acid hydroxamic, nhóm -NH của gần nhóm >C=O hơn nhóm -OH nên bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng hút điện tử và liên hợp nhiều hơn Vì vậy, trên phổ đồ, proton của nhóm -NH cộng hưởng ở vùng trường thấp hơn
+ Proton ở vị trí 2’ trên phổ đồ của cả 7 chất 5a-g đều có tín hiệu cộng hưởng dạng singlet với độ chuyển dịch hoá học nằm trong khoảng 7,82-7,84 ppm, lớn hơn so với các proton còn lại do có hiệu ứng hút điện tử mạnh từ nhóm C=N trên vòng benzimidazol
BÀN LUẬN VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Giá trị logP (hệ số phân bố dầu/nước) là một thông số cơ bản để đánh giá khả năng hấp thu và phân bố của một chất, từ đó giúp xác định hoạt chất đó có thể trở thành thuốc hay không Đánh giá logP là một tiêu chí nằm trong bộ quy tắc “Ro5” của Lipinski, mô tả mối liên hệ giữa các chỉ số hóa lý và dược động học Theo đó, hoạt chất dùng đường uống được xem là có “tính thuốc” cần đáp ứng ít nhất 3/4 tiêu chí: có giá trị logP không quá 5, có khối lượng phân tử không quá 500 Dalton, có không quá 10 trung tâm nhận liên kết hydro (N, O, F), và có không quá 5 trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) [94] Các kết quả (tính toán bằng phần mềm ChemDraw 16.0) trong Bảng 4.1 đã cho thấy 10/10 dẫn chất 5a-g và 7a-c đều đáp ứng ít nhất 3/4 tiêu chí, vì vậy thoả mãn quy tắc Lipinski
Chất R Log P KLPT Nhóm nhận liên kết hydro
Nhóm cho liên kết hydro
Sau khi xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ, các dẫn chất tổng hợp được tiến hành thử độc tính trên ba dòng tế bào: SW620 (ung thư đại tràng), MDA-MB-231 (ung thư vú) và lưỡng bội bào thai người (MRC-5) với 2 chất đối chiếu dương tính là SAHA và ADR
Bảng 4.1 Kết quả theo bộ "Ro5" của Lipinski
4.3.1 Hoạt tính của các dẫn chất dãy I
Hầu hết các chất 5a-g đều có hoạt tính thấp trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm, khi so sánh với 2 chất chứng dương là SAHA và ADR Các giá trị IC50 hầu hết đều lớn hơn
30 àM Ngoại lệ duy nhất là chất 5f với nồng độ ức chế 50% tế bào SW620 (ung thư đại tràng) và MDA-MB-231 (ung thư vỳ) nhỏ hơn 30 àM, cho thấy khả năng chọn lọc trờn
2 dòng tế bào này so với tế bào lưỡng bội bào thai người (MRC-5) của chất 5f Khi so sánh giá trị IC50 của 5f trên 2 dòng tế bào này, có thể thấy khả năng ức chế tế bào ung thư đại tràng là tốt hơn khoảng 3 lần so với tế bào ung thư vú (Hình 4.6)
Như vậy trong điều kiện thí nghiệm, chất 5f với nhóm thế bromo ở vị trí 4- trên vòng benzen cho hoạt tính tốt nhất trong dãy I, với độ chọn lọc cao hơn trên dòng tế bào SW620 so với MDA-MB-231 và MRC-5
Hình 4.6 Biểu đồ so sánh độc tính tế bào của 5f với SAHA và ADR trên 2 dòng tế bào
4.3.2 Hoạt tính của các dẫn chất dãy II
Trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm, các giá trị IC50 của các dẫn chất 7a-c đều lớn hơn so với 2 chất chứng dương là SAHA và ADR Trong khi chất 7a hầu như không thể hiện hoạt tớnh ức chế tế bào, với cỏc giỏ trị IC50 vượt quỏ 30 àM, cỏc chất 7b và 7c cú nồng độ ức chế 50% tế bào nhỏ hơn 7a nhiều lần
Khi so sánh nồng độ ức chế 50% tế bào của dẫn chất 7b và 7c, có thể thấy dẫn chất 7c thể hiện hoạt tính tốt hơn trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm, với tỉ lệ IC50 chênh lệch từ khoảng 2 đến 5 lần Cả hai chất đều có khả năng ức chế chọn lọc trên tế bào ung thư (SW620 và MDA-MB-231) hơn tế bào lưỡng bội bào thai người (MRC-5) Đối với chất 7b, khả năng ức chế tế bào SW620 là tốt hơn khoảng 2 lần so với tế bào MDA-MB-231 và khoảng 3 lần so với tế bào MRC-5 Chất 7c cũng thể hiện độc
Hình 4.7 Biểu đồ so sánh độc tính của 7b và 7c với chất chứng dương SAHA và ADR trên 3 dòng tế bào tính ức chế chọn lọc với xu hướng tương tự, tuy nhiên tỉ lệ chênh lệch về nồng độ IC50 trên 2 dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 và SW620 là thấp hơn, cỡ khoảng 1,4 lần (Hình 4.7) Như vậy, việc thêm nhóm thế cloro hoặc methyl vào vị trí 4- trên vòng benzen làm cải thiện hoạt tính, trong đó nhóm thế methyl thể hiện độc tính tế bào tốt hơn với các giá trị IC50 được cải thiện đáng kể, còn nhóm thế cloro giúp làm tăng độ chọn lọc trên dòng tế bào ung thư SW620 hơn so với MDA-MB-231 và tế bào thường MRC-5
Khi tiếp tục so sánh độc tính trên các tế bào SW620 và MDA-MB-231 của các chất 5f (dãy I), 7b và 7c (dãy II), có thể sơ bộ nhận thấy rằng các chất thuộc dãy II cho độc tính tế bào ung thư tốt hơn các chất thuộc dãy I trong điều kiện thử nghiệm Như vậy sự thay đổi cấu trúc từ amin bậc 2 với cầu nối methylen -CH2NH- (5a-g) sang nhóm amid -CONH- (7a-c) giúp cải thiện hoạt tính (Hình 4.8)
Hình 4.8 Biểu đồ so sánh độc tính của các chất 5f, 7b và 7c trên 2 dòng tế bào ung thư
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể đưa ra các kết luận sau:
1.1 Về tổng hợp và xác định cấu trúc Đã tổng hợp được 10 dẫn chất N-hydroxyheptanamid mới và cả 10 dẫn chất này đều chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đó Các dẫn chất này được chia thành 2 nhóm:
+ Nhóm thứ nhất gồm 7 chất thuộc dãy I:
7-(5-(Benzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5a)
7-(5-((2-Clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5b)
7-(5-((3-Clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5c)
7-(5-((4-Clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5d)
7-(5-((4-Fluorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5e) 7-(5-((4-Bromobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5f) 7-(5-((4-Methylbenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (5g)
+ Nhóm thứ hai gồm 3 chất thuộc dãy II:
N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)benzamid (7a)
4-Cloro-N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)benzamid (7b)
N-(1-(7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)-4-methylbenzamid (7c) Đã xác định cấu trúc của tất cả các dẫn chất tổng hợp được từ việc phân tích dữ liệu phổ IR, HRMS, 1 H-NMR, 13 C-NMR
1.2 Về hoạt tính sinh học Đã đánh giá độc tính của 10 dẫn chất N-hydroxyheptanamid tổng hợp được trên
3 dòng tế bào thử nghiệm, gồm tế bào ung thư đại tràng người (SW620), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào lưỡng bội bào thai người (MRC-5) Kết quả cho thấy 03/10 chất (5f, 7b và 7c) cú độc tớnh tế bào với nồng độ IC50 nhỏ hơn 30 àM và cú độ chọn lọc tốt trên dòng tế bào SW620 Trong đó chất 5f thể độc tính trên tế bào ung thư tốt nhất trong dãy I Chất 7c có độc tính cao nhất trong cả 2 dãy I và II, với giá trị IC50 nằm trong khoảng 2,33-10,31 àM Chất 7b cho khả năng chọn lọc tốt nhất trờn dũng tế bào SW620 so với trên dòng tế bào MDA-MB-231 và MRC-5
2 KIẾN NGHỊ Đánh giá hoạt tính ức chế enzym HDAC tổng và hoạt tính ức chế chọn lọc một số loại HDAC của 10 dẫn chất đã tổng hợp, đặc biệt là chất 5f, 7b và 7c, nhằm tìm ra chất có hoạt tính tối ưu và xây dựng mối liên quan cấu trúc-tác dụng của các dẫn chất lai hoá N-hydroxyheptanamid với vòng benzimidazol
Tiến hành tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học các dẫn chất N- hydroxyheptanamid tương tự mang khung benzimidazol hoặc các khung chứa vòng thơm khác như quinazolin, indirubin, indazol.
