trần thị thu huyền tổng hợp và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư của một số dẫn chất n hydroxyoctanamid mới mang dị vòng 4 oxoquinazolin

Giới thiệu chung về enzym histon deacetylase Histon deacetylase HDAC là enzym có khả năng xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm N-acetyl ra khỏi đuôi lysin đã được acetyl hóa trong protein

TỔNG QUAN

ENZYM HISTON DEACETYLASE

1.1.1 Giới thiệu chung về enzym histon deacetylase

Histon deacetylase (HDAC) là enzym có khả năng xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm N-acetyl ra khỏi đuôi lysin đã được acetyl hóa trong protein histon hoặc một số protein không chứa histon, dẫn đến cấu trúc nhiễm sắc thể bị biến đổi và ức chế biểu hiện gen [97], [49] Quá trình acetyl hóa và deacetyl hóa ở đuôi lysin của histon là hai quá trình ngược chiều nhau được kiểm soát bởi hai enzym histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [95]

Nếu HAT được coi như là “người viết” nên quá trình acetyl hóa thì HDAC sẽ được xem như là “cục tẩy” của quá trình này [82] Đây là hai quá trình có tác động lớn đến việc điều hòa biểu sinh và tái cấu trúc chất nhiễm sắc Đơn vị cơ bản cấu tạo nên chất nhiễm sắc được gọi là nucleosome Nucleosome gồm một đoạn ADN quấn xung quanh phức hợp tám phân tử histon lõi, phức hợp này chứa hai cặp histon của bốn histon H2A, H2B, H3 và H4 [45] Khi quá trình acetyl hóa diễn ra, điện tích dương ở lysin tận cùng được trung hòa, do đó làm mất tương tác ion với nhóm phosphat tích điện âm trong các nucleotid của ADN, điều này làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn Dạng tháo xoắn như vậy còn được gọi là “euchromatin” – chất đồng nhiễm sắc, sự tồn tại của chúng sẽ kích hoạt thực hiện phiên mã và làm tăng biểu hiện gen [39], [47] Ngược lại, quá trình deacetyl hóa làm cho histon tích điện dương lớn ở đầu N của đuôi lysin, gây tương tác mạnh với ADN, làm đóng xoắn nhiễm sắc thể, có thể nhìn thấy dưới dạng chất dị nhiễm sắc –

“heterochromatin”, gây ức chế phiên mã và làm giảm biểu hiện gen [36]

Hình 1.1.Hoạt động của HAT và HDAC trong quá trình phiên mã

1.1.2 Phân loại enzym histon deacetylase

Tính đến thời điểm hiện tại, 18 loại HDAC ở người đã được phân lập Chúng được

Bốn nhóm này có thể được chia thành hai loại, loại 1 hoạt động phụ thuộc Zn 2+ (nhóm I, II và IV) và loại 2 hoạt động phụ thuộc NAD + (nhóm III) [70]

Nhóm I bao gồm các enzym HDAC 1, 2, 3, 8, thường phân bố trong nhân và có nhiều biểu hiện phổ biến trên các dòng tế bào và mô khác nhau ở nhiều loại ung thư như là: ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, đại trực tràng, ung thư thận… Chúng có cấu trúc tương đồng với protein RPD3 của nấm men [70], [78]

HDAC nhóm II được chia thành hai phân nhóm nhỏ: phân nhóm IIa (bao gồm HDAC 4, 5, 7, 9) và phân nhóm IIb (bao gồm HDAC 6, 10) Các HDAC nhóm II tương đồng với protein HDA1 (histon deacetylase 1) của nấm men Enzym nhóm này có thể tìm thấy trên cả nhân và tế bào chất Riêng HDAC phân nhóm IIb được tìm thấy chủ yếu trong tế bào chất [70], [78]

HDAC nhóm III còn được gọi là sirtuin (bao gồm SIRT1–SIRT7) do trình tự của chúng tương đồng với protein Sir2 của nấm men [78], [69] Sự phân bố trong tế bào và biểu hiện trên các mô của nhóm này vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, tuy nhiên vẫn có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzym này được tìm thấy trên cả nhân, tế bào chất và ty thể [32]

HDAC nhóm IV có đặc điểm độc nhất là chỉ bao gồm HDAC11, một loại enzym có vị trí xúc tác tương đồng cả với nhóm I và II Tuy nhiên, do cấu trúc khác biệt, HDAC11 không được phân loại vào bất kỳ nhóm nào cụ thể.

Bảng 1.1 Phân loại enzym HDAC

Tương đồng về trình tự với protein nấm men

Cơ chế hoạt động phụ thuộc

Phân bố trong tế bào

Zn 2+ Nhân và tế bào chất

HDAC10 Zn 2+ Chủ yếu ở tế bào chất

Nhóm III Sir2 SIRT1-7 NAD + Nhân, tế bào chất và ty thể

Nhóm IV HDAC11 Zn 2+ Nhân và tế bào chất

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC phụ thuộc Zn 2+

Trung tâm hoạt động của HDAC phụ thuộc Zn 2+ gồm 2 phần chính: ion Zn 2+ và kênh enzym

- Kênh enzym: dạng túi hình ống, cấu trúc linh động có thể biến đổi phù hợp với chiều dài phối tử (ligand) khác nhau Phần miệng túi có một vành nhỏ được tạo nên từ vài vòng xoắn protein, có vai trò tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDACi (CAP) Kênh enzym được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu, đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: phenylalanin, tyrosin, histidin, aspartat, lysin… [8], [88]

- Ion Zn 2+ : là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon thông qua liên kết phối trí Trong phân tử HDAC, ion Zn 2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl ở đuôi lysin từ đó xúc tác cho quá trình tách loại nhóm acetyl Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn 2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng tăng [80]

Ví dụ như nhóm dẫn chất acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với ion kẽm qua 2 nguyên tử oxy của nó và liên kết với các acid amin của kênh enzym bằng các tương tác khác nhau: van der Waals, alkyl, pi-alkyl [8], [88]

Hình 1.2.Trung tâm hoạt động dạng túi hình ống của HDAC phụ thuộc Zn 2+

CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Với tiềm năng chống ung thư đáng chú ý, các chất ức chế HDAC đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và nghiên cứu từ các nhà khoa học Đến nay đã có bốn chất ức chế HDAC (HDACi) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt để điều trị ung thư bao gồm: SAHA (Vorinostat, Zolinza®) [72], FK228 (Romidepsin, Istodax®) [87], PDX101 (Belinostat, Beleodaq®) [93], LBH589 (Panobinostat, Farydak®) [68] Năm 2006, suberoylanilid hydroxamic acid (SAHA) đã được phê duyệt để điều trị bệnh u lympho tế bào T ở da (CTCL) Năm 2009, FK228 là một tetrapeptid vòng, cũng được phê duyệt để điều trị CTCL Sau đó, PDX101 và LBH589 lần lượt được phê duyệt để điều trị bệnh u lympho tế bào T ngoại vi (PTCL) và đa u tủy xương [72], [87], [93], [68]

Hình 1.3.Bốn chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt trong điều trị ung thư

1.2.1 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC bao gồm 3 phần: nhóm gắn kẽm (ZBG – The zinc binding group), nhóm nhận diện bề mặt (CAP – capping group) và vùng cầu nối (Linker):

Hình 1.4 Mô hình của các chất ức chế HDAC

- Nhóm gắn kẽm (ZBG): Khả năng gắn ZBG với ion Zn 2+ đóng vai trò quyết định đến hoạt tính ức chế của HDACi [59] Cấu trúc khóa ion kẽm có thể kể đến như acid hydroxamic, benzamid, acid cacboxylic, thiol… Các cấu trúc này được tìm thấy trong bốn chất ức chế HDAC đã được FDA chấp thuận hoặc đang được nghiên cứu rộng rãi trong các thử nghiệm lâm sàng hiện nay [96] Chúng mang lại hoạt tính sinh học cao, có khả năng ức chế tế bào ở nồng độ thấp nhưng cũng có nhược điểm là thời gian tác dụng ngắn và kém chọn lọc trên các dòng tế bào [18] Trong số các ZBG kể trên, acid hydroxamic thường được sử dụng phổ biến nhất vì có ái lực liên kết mạnh với ion kẽm thông qua khả năng tạo phức chelat bền vững [94]

- Nhóm nhận diện bề mặt (CAP): CAP tham gia vào quá trình tương tác với vành protein nhỏ ở phần đầu của trung tâm hoạt động, nhận diện các acid amin bề mặt của kênh enzym Chúng thường là các nhóm kị nước như: các vòng thơm, hệ vòng thơm hoặc peptid vòng [66], [62] Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của các chất ức chế HDAC Hầu hết những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kị nước thì có hoạt tính yếu [83]

- Vùng cầu nối (Linker): Linker đóng vai trò liên kết nhóm gắn kẽm và nhóm nhận diện bề mặt Vùng này thường là các nhóm sơ nước, gồm các mạch hydrocarbon thân dầu, mạch thẳng hoặc mạch vòng nhỏ, có thể no hoặc không no và không chứa nhóm cồng kềnh [62], [56] Trung tâm hoạt động của các HDAC là dạng túi kỵ nước, có chiều dài từ miệng túi đến ion Zn 2+ ở đáy túi là khoảng 4-7 C, do vậy các chất ức chế HDAC có vùng cấu nối dài tương ứng sẽ cho hoạt tính tốt hơn [33]

Linker cùng CAP sẽ liên kết với các acid amin ở trung tâm hoạt động của HDAC, ảnh hưởng đến sự tương tác ligand – receptor (phối tử – thụ thể) do đó quyết định tính chọn lọc của HDACi [73]

Nhiều nghiên cứu gần đây về sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt và vùng cầu nối trong cấu trúc của các chất ức chế HDAC sẽ giúp định hướng thiết kế nhiều chất ức chế HDAC theo hướng chọn lọc với từng loại HDAC cụ thể, với mong muốn tối ưu tác dụng và giảm các tác dụng không mong muốn Do đó, trong nội dung của khóa luận này đã sử dụng khung quinazolin làm nhóm CAP và mạch thẳng 7 carbon no làm cầu nối với hi vọng sẽ góp phần tìm được hợp chất tiềm năng có hoạt tính sinh học và tạo ra được một số chất ức chế HDAC tốt

1.2.2 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học hoặc tính chọn lọc của chúng trên các loại enzym

Trường hợp phân loại theo cấu trúc hóa học, HDACi gồm 4 nhóm dẫn chất: acid hydroxamic (SAHA), peptid dạng vòng (FK228), benzamid (MS-275) và acid béo không vòng (acid valproic) [60], [29]

Ngoài ra, HDACi có thể được phân loại dựa vào tính chọn lọc với từng loại HDAC, bao gồm: chất ức chế HDAC không chọn lọc (pan-HDACi) và chọn lọc Ví dụ, SAHA và TSA (trichostatin A) là các pan-HDACi, trong khi tubastatin A ức chế chọn lọc enzym HDAC6, romidepsin chỉ tác động lên HDAC nhóm I, panobinostat ức chế đặc hiệu HDAC nhóm I và II [60], [13]

Bảng 1.2 Phân loại các chất ức chế HDAC

STT Dẫn chất Ví dụ HDAC đặc hiệu

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

HDACi can thiệp vào chu kỳ tế bào và quá trình phân bào

Các chất ức chế histon deacetylase tác động lên chu kỳ tế bào bằng cách tăng cường sự biểu hiện của gen CDKN1A (p21) mã hóa protein p21, ngăn chặn quá trình dimer hóa của các cyclin và các kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinases) Điều này dẫn đến việc “bắt giữ” chu kỳ tế bào và gây ra sự biệt hóa tế bào [89], [75]

Trên tế bào phơi nhiễm với HDACi, sự gia tăng mức độ hoạt động của các tác nhân ức chế CDK và giảm số lượng cyclin gây nên sự dephosphoryl hóa của Rb, khóa hoạt động của E2F1 trong quá trình phiên mã ở pha G1 và tại điểm chuyển giao G1/S HDACi có thể tiêu diệt cả tế bào bất thường tăng sinh và không tăng sinh, điều này trái ngược với các thuốc hóa trị liệu khác chỉ có tác dụng lên tế bào bất thường tăng sinh [60]

HDACi thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể

Số lượng các đầu histon đã acetyl hóa được tăng cường do quá trình ức chế cạnh tranh của HDAC bởi các chất ức chế HDAC Điều này dẫn đến thay đổi tương tác tĩnh điện giữa các histon và ADN, dẫn đến cấu trúc nhiễm sắc thể bị nới lỏng hay còn gọi là bị tháo xoắn Các chất ức chế HDAC gây ra quá trình acetyl hóa quá mức (hyperacetylation) các histon sau đó làm thay đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể do tác dụng ức chế kéo dài của các HDACi [35], [61]

HDACi tác động lên cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN

Quá trình xảy ra phản ứng phá hủy ADN (DNA damage response - DDR) theo chu trình bao gồm một số giai đoạn liên tiếp và có sự tham gia của các phức hợp phân tử được liên kết với nhau Các chương trình này có thể tìm ra và sửa chữa các ADN bị hư hại Bản thân các kinase cũng giúp khuếch đại tín hiệu của ADN và truyền tín hiệu khuếch đại đến các protein điểm kiểm soát 1 và 2 (checkpoint proteins CHK1 và CHK2) [10] Nhiều nghiên cứu đã được công bố về tác dụng đối kháng của các HDACi đối với các quá trình này và chúng sẽ kích hoạt DDR [40]

HDACi làm giảm hoạt động của HDAC, qua đó tăng cường sự acetyl hóa histon, dẫn đến thay đổi cấu trúc NST, ADN trở nên dễ phơi nhiễm với các yếu tố nguy cơ như tia UV, các loại bức xạ, thuốc độc tế bào và các gốc tự do oxy hóa (ROS) dẫn đến sự gãy kép ADN (DSB) HDACi tham gia điều hòa xuống sự biểu hiện của các gen mã hóa protein sửa chữa ADN Tích lũy DSB gây nên thay đổi biểu hiện gen, dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình [60]

HDACi thúc đẩy quá trình apoptosis

Các HDACi tham gia vào quá trình apoptosis thông qua con đường ty thể bên trong (intrinsic mitochondrial pathway) hoặc thông qua con đường thụ thể gây chết bên ngoài có thể liên kết với các thụ thể gây chết như TRAIL hoặc FASL, kích hoạt chúng và do đó làm kích hoạt con đường bên ngoài Con đường bên trong được khởi phát bởi sự phá vỡ màng ty thể, được kích hoạt bởi các kích thích stress khác nhau, giải phóng các pro- death protein như cytochrom C và SMAC Điều này lần lượt kích hoạt caspase-3, caspase-6 và caspase-7 khởi tạo chu trình apoptosis [57]

HDACi ức chế hình thành mạch

DẪN CHẤT QUINAZOLIN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ

1.3.1 Giới thiệu chung về khung quinazolin và quinazolin-4(3 H )-on

Quinazolin là một khung cấu trúc cấu tạo từ 2 vòng benzen và pyrimidin Khi gắn thêm một nhóm carbonyl vào dị vòng pyrimidin ta được dẫn chất quinazolinon Các dẫn chất quinazolinon thường gặp như là: quinazolin-2,4(1H,3H)-dion, quinazolin-4(1H)- on, quinazolin-4(3H)-on, trong đó quinazolin-4(3H)-on là phổ biến nhất Các dị vòng này đều có thể tìm thấy ở nhiều nhóm chất có hoạt tính sinh học trong tự nhiên cũng như tổng hợp [5]

Trong tự nhiên, dẫn chất quinazolin đã được tìm thấy trong nhiều chất chuyển hóa ở thực vật và vi sinh vật Một số phân tử chứa khung này như là: tryptoquivalin, circumdatin F và G, tryptanthrin, dipegin, dipeginol, vasicinon, deoxyvasicinon [30], [76], [27], [86]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của quinazolin và quinazolin-4(3H)-on

Các dẫn xuất quinazolin-4(3H)-on được quan tâm đặc biệt nhờ sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Khung cấu trúc của chúng bao gồm dị vòng quinazolin với nhóm thế ceto tại vị trí carbon số 4 Dẫn xuất quinazolin-4(3H)-on mang lại nhiều tác dụng dược lý như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống co giật, hạ huyết áp, giảm đau, chống viêm và đặc biệt là khả năng kháng ung thư Do đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng khung quinazolin-4(3H)-on để thiết kế cấu trúc của các dẫn chất mới trong đề tài khóa luận của mình.

1.3.2 Một số phương pháp tổng hợp khung quinazolin-4( 3H )-on

Năm 1869, nhân quinazolin-4(3H)-on đầu tiên là hợp chất 2-ethoxy-4(3H)- quinazolinon được tổng hợp bởi Griess và cộng sự bằng phản ứng giữa acid anthranilic và hydrocyanid trong dung môi ethanol (sơ đồ 1.1) Nguyên liệu để thực hiện phản ứng tuy dễ kiếm nhưng lại gây ra nguy hiểm cho con người nếu tiếp xúc ở nồng độ cao, đặc biệt là HCN Bên cạnh đó, sản phẩm TQ2 tạo thành luôn có nhóm ethoxy ở vị trí số 2 trên vòng quinazolin và việc tách loại nhóm này sẽ gặp nhiều khó khăn, trở ngại [37]

Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp 2-ethoxy-4(3H)-quinazolinon bởi Griess và cộng sự

Năm 1996, Perumal và cộng sự đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình tổng hợp các dẫn chất quinazolinon sử dụng tác nhân Vilsmeier Kết quả nghiên cứ chỉ ra rằng ở nhiệt độ phòng và có thêm amin bậc 1, phản ứng xảy ra theo hướng tạo thành sản phẩm thế ở vị trí số 3 (TQ3) thay vì dimer hóa (TQ4) (sơ đồ 1.2) Phản ứng tạo TQ3 xảy ra qua hai giai đoạn: tác nhân Vilsmeier được tạo thành từ hỗn hợp DMF và POCl3 ở 0℃, sau đó là quá trình đóng vòng với amin bậc 1 ở nhiệt độ phòng Bởi vì phosphoryl clorua là một hợp chất gây độc nên trong thực nghiệm thường ít được sử dụng Ngoài ra, hiệu suất của phản ứng mang lại cũng không cao do còn có thể tạo thành sản phẩm phụ TQ4 như sơ đồ 1.2 [58]

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất quinazolin-4(3H)-on dùng tác nhân Vilsmeier

Năm 2022, Ali Akbari và cộng sự đã nghiên cứu, thiết kế một phương pháp mới để tổng hợp các dẫn xuất quinazolin-4(3H)-on Phương pháp được thực hiện bằng cách cho tác amoni hexafluorophosphat và dung môi pyridin (sơ đồ 1.3) Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất phản ứng cao và có thể áp dụng được trên quy mô công nghiệp Tuy nhiên thì amoni hexafluorophosphat và pyriin đều là các chất rất độc và gây mùi khó chịu khi sử dụng [2]

Sơ đồ 1.3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất quinazolin-4(3H)-on theo Ali Akbari và cộng sự

Để tổng hợp quinazolin-4(3H)-on, phản ứng Niementowski được ưa chuộng với nhiều ưu điểm như: nguyên liệu dễ kiếm, phản ứng đơn giản, hiệu suất cao, ít độc hại và ít tạp chất Trong phản ứng này, formamid đóng vai trò kép, vừa là dung môi vừa là chất tham gia phản ứng, ngưng tụ với acid 2-aminobenzoic ở nhiệt độ 130-150℃ trong khoảng 6 giờ, tạo ra sản phẩm thông qua quá trình loại bỏ hai phân tử nước Nhờ những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp này để tổng hợp dẫn chất quinazolin-4(3H)-on cho công trình nghiên cứu của mình.

Sơ đồ 1.4 Phản ứng Niementowski

1.3.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất quinazolin

Hình 1.6 Các thuốc mang khung quinazolin đã được thử nghiệm lâm sàng

Hiện nay, một số hợp chất chống ung thư mang cấu trúc quinazolin đã được thử nghiệm lâm sàng ở các phase trên nhiều loại ung thư khác nhau như: gefitinib, erlotinib, alfuzosin, prazosin [43], [44] (hình 1.6)

Dưới đây là một số cơ chế kháng ung thư của dẫn chất quinazolin đã được công bố trên thế giới: Ức chế poly(ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1):

Poly(ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1) là một loại enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc sửa chữa những sai sót của ADN Quá trình này liên quan đến việc PARP-1 xúc tác gắn kết ADP-ribose với các protein nhận và yếu tố phiên mã, sử dụng NAD+ (nicotin adenin dinucleotid) làm chất nền Do đó, việc ức chế hoạt động của PARP-1 có thể ngăn cản quá trình sửa chữa ADN, làm tăng quá trình chết tế bào, mở ra một phương pháp điều trị ung thư đầy triển vọng.

Năm 2004, Kinoshita và cộng sự đã tổng hợp được TQ7 – một hợp chất tiềm năng chứa khung quinazolin-4(3H)-on (hình 1.7) Chất này được xác định là có hoạt tính kháng ung thư thông qua khả năng ức chế PARP-1 với giá trị IC50 là 14 nM [46]

Hình 1.7.Hợp chất có hoạt tính ức chế PARP-1 được Kinoshita và cộng sự tổng hợp Ức chế protein kinase (PK):

Protein kinase là nhóm enzym giúp kiểm soát chu kỳ tế bào, phân bào và tăng sinh tế bào [42] Khi protein này bị đột biến không kiểm soát được hoặc khi được giải phóng ở mức độ cao bất thường, tế bào bình thường sẽ bị biến đổi thành tế bào ung thư Do đó,

PK là một trong những yếu tố đóng vai trò quyết định trong quá trình hình thành khối u [16], [34] Một số protein quan trọng nhất liên quan đến trạng thái ung thư, biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư và thường được coi là đích bao gồm: thụ thể tyrosin kinase (EGFR, GFR…), serin/threonin kinase (GC, CAMK…), histidin kinase [52], [53], [26] Các hợp chất chứa quinazolin có khả năng ức chế tốt thụ thể tyrosin kinase EGFR thông qua việc ức chế quá trình tự phosphoryl hóa EGFR [91]

Năm 2008, Abouzid và các cộng sự đã thiết kế, tổng hợp được TQ8 – một dẫn chất của aminoquinazolin có hoạt tính ức chế EGFR (hình 1.8) Trong thử nghiệm in vitro,

TQ8 cho thấy hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô vú ở người (MCF-7) với giá trị

Hình 1.8.Hợp chất có hoạt tính ức chế EGFR được Abouzid và cộng sự tổng hợp Ức chế quá trình polyme hóa tubulin:

Phân tử tubulin có nhiều vị trí liên kết với phân tử thuốc và được coi như một đích quan trọng của các thuốc chống ung thư Trong các nghiên cứu trước đây, colchicin và các chất tương tự được chứng minh là có khả năng ức chế sự trùng hợp tubulin thành các vi ống Kết quả, vi ống không thể thực hiện chức năng sinh học dẫn tới quá trình nguyên phân bị kéo dài, kéo theo sự chết theo chương trình (apotosis) của tế bào ung thư Tuy nhiên, ứng dụng lâm sàng của chúng bị hạn chế do độc tính mạnh Nhưng việc phát triển các hợp chất có đích là tubulin sau đó vẫn được chú trọng Nhiều hợp chất được tạo ra không chỉ ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư người mà còn có khả năng phá vỡ các mạch máu gây phát triển khối u trên tế bào ung thư nội mô [79] Năm 2004, Raffa và các cộng sự đã tìm ra TQ9 – hợp chất của 2-styrylquinazolin- 4(3H)-on (hình 1.9) Sau đó, TQ9 được chứng minh là có hoạt tính ức chế quá trình trựng hợp tubulin với giỏ trị IC50 là 5,8 àM Hợp chất này cũng đó được đỏnh giỏ về khả năng ức chế tế bào ung thư biểu mô vú MCF-7 ở người và tế bào ung thư hạch Burkitt CA46 với giỏ trị IC50 lần lượt là 0,34 và 1,0 àM [71]

Hình 1.9.Hợp chất có hoạt tính ức chế sự polyme hóa tubulin được Raffa và cộng sự tổng hợp Ức chế thymidylat synthase (TS) và dihydrofolat reductase (DHFR):

Dihydrofolat reductase (DHFR) xúc tác quá trình khử folat thành tetrahydrofolat (THF) Thông qua việc sử dụng THF làm cofactor, TS xúc tác quá trình methyl hóa khử deoxyuridin monophosphat (dUMP) thành deoxythymidin monophosphat (dTMP) Mà dTMP là một chất cần thiết cho quá trình sao chép ADN [64], [7] Do đó việc ức chế hoạt động của DHFR hoặc TS sẽ dẫn đến “thymineless cell death” (quá trình chết tế bào khi chúng thiếu dTMP) [11]

Năm 1998, Raltitrexed (hình 1.10) là chất ức chế thymidylat synthase mang khung quinazolin đã được đăng ký để điều trị cho bệnh ung thư đại trực tràng tiến triển [41]

ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC

Như đã đề cập ở mục 1.2.1, cấu trúc cổ điển của các chất HDACi gồm ba phần: nhóm gắn kẽm (ZBG), vùng cầu nối (Linker) và nhóm nhận diện bề mặt (CAP) Đây là mô hình pharmacophore đầu tiên của các chất ức chế HDAC (HDACi) Trong một số nghiên cứu, các nhà khoa học thường tìm thấy được một aspartat ở lối vào vị trí xúc tác của kênh enzym, tại đó quá trình nhận diện và liên kết cơ chất với các acid amin bề mặt xảy ra [90] Do đó, mô hình pharmacophore ban đầu được mở rộng hơn (hình 1.13) Nhóm liên kết (connecting unit - CU) là phần liên kết trung gian giữa nhóm nhận diện bề mặt và vùng cầu nối, đóng vai trò tương tác với aspartat ở vòng acid amin ngay lối vào của kênh enzym [81] Nhóm này thường được tích hợp vào cấu trúc nhóm nhận diện bề mặt, một số nhóm CU tạo ra các tương tác đáng kể với aspartat như là: furanon, indanon, uracil, triazol… [81] Năm 2008, Chen và các cộng sự đã nghiên cứu thay thế nhóm amid (cạnh vòng benzen) trong SAHA bằng vòng triazol thông qua phản ứng Click Kết quả thu được các dẫn chất có tác dụng mạnh hơn SAHA [17]

Dựa trên các cơ sở đã trình bày, khóa luận tiến hành thiết kế dãy các dẫn chất bằng cách sử dụng dị vòng quinazolin-4(3H)-on làm nhóm nhận diện bề mặt (CAP), triazol làm nhóm CU, dẫn xuất acid hydroxamic làm nhóm gắn kẽm (ZBG) Các nhóm này được liên kết với nhau thông qua linker là chuỗi 7 carbon no mạch thẳng

Hình 1.13.Thiết kế cấu trúc của các dẫn chất N-hydroxyoctanamid

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các hóa chất, dung môi dùng trong tổng hợp: đạt tiêu chuẩn dùng cho tổng hợp hóa dược (tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR) và chủ yếu có nguồn gốc xuất xứ từ hãng Merck hoặc Sigma-Aldrich Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua bất kỳ quá trình tinh chế nào và được trình bày cụ thể trong bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong thực nghiệm

STT Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc

2 Acid 2-amino-4-methylbenzoic AR Merck

3 Acid 2-amino-5-methylbenzoic AR Merck

4 Acid 2-amino-4-fluorobenzoic AR Merck

5 Acid 2-amino-5-fluorobenzoic AR Merck

6 Acid 2-amino-4-bromobenzoic AR Merck

7 Acid 2-amino-5-bromobenzoic AR Merck

9 Propargyl bromid AR Sigma-Aldrich

10 Natri azid AR Trung Quốc

11 Ethyl 8-bromooctanoat AR Sigma-Aldrich

12 Hydroxylamin hydroclorid (NH2OH.HCl) AR Trung Quốc

13 Natri hydroxyd (NaOH) AR Trung Quốc

14 Kali carbonat (K2CO3) AR Trung Quốc

15 Kali iodid (KI) AR Trung Quốc

16 Natri sulfat khan (Na2SO4) AR Trung Quốc

17 Dicloromethan (CH2Cl2 – DCM) AR Trung Quốc

18 Ethyl acetat (EA) AR Trung Quốc

19 Aceton (AcOH) AR Trung Quốc

20 Methanol (MeOH) AR Trung Quốc

21 Sắt (III) clorid (FeCl3) AR Trung Quốc

22 Acid hydroclorid (HCl) AR Trung Quốc

23 Ethyl aceatat (CH3COOC2H5) AR Trung Quốc

24 Natri hydrocarbonat (NaHCO3) AR Trung Quốc

25 Natri carbonat (Na2CO3) AR Trung Quốc

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50-100 mL, bình nón dung tích

250 mL, bình chiết, ống đong, pipet, phễu thủy tinh, cốc có mỏ các loại

- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Vilber bước sóng 254 nm và 365 nm, bản mỏng silicagel F254 (Merck)

- Cân phân tích Shimazu, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh Memmert, tỷ sấy Memmert

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Tủ nuôi cấy Vision scientific Co.Ltd (model VS-9108 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean beach)

- Tủ lạnh giữ môi trường nuôi cấy, bồn làm ấm môi trường nuôi cấy đến 37 o C Jeio tech SWB-03, tủ giữ mẫu -18 o C (DIOS)

- Pipet Gilson cỏc loại 1000; 200; 20; 1-10; 2-20 àl

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tổng hợp và tinh chế bảy dẫn chất của N-hydroxyoctanamid:

Hình 2.1.Các dẫn chất được tổng hợp trong khóa luận

+ N-Hydroxy-8-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)octanamid (7a)

+ N-Hydroxy-8-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanamid (7b)

+ N-Hydroxy-8-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanamid (7c)

+ 8-(4-((6-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-

+ 8-(4-((7-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-

+ 8-(4-((6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-

+ 8-(4-((7-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-

- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được bằng sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy

Cấu trúc của các dẫn xuất tổng hợp được xác định dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) Các kỹ thuật này liên kết với nhau cung cấp thông tin chi tiết về thành phần nguyên tố, liên kết và nhóm chức năng trong phân tử, từ đó giúp thiết lập cấu trúc hóa học chính xác cho các dẫn xuất tổng hợp.

2.2.2 Thử tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào in vitro của các dẫn chất tổng hợp được trên một dòng tế bào thường: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi (MRC-5) và hai dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620), ung thư vú (MDA-MB-231).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

- Dựa trên nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất Các phản ứng được sử dụng bao gồm:

+ Phản ứng Niementowski đóng vòng quinazolin

+ Phản ứng azid hóa với tác nhân natri azid

+ Phản ứng Click cộng đóng vòng alkyn – azid xúc tác đồng(I) iodid (CuAAC) + Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic sử dụng hydroxylamin hydroclorid (NH2OH.HCl) với sự có mặt của kiềm

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp phù hợp

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng 2 cách:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC):

+ Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút + Pha động là hệ dung môi DCM : MeOH hoặc EA : n-hexan với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào chất phân tích

+ Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và đưa lên bản mỏng với thể tớch khoảng 2àl

+ Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

- Đo nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc

Các dẫn chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và phổ cộng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr Cách tiến hành như sau:

Mẫu sau khi sấy khô được nghiền mịn thành dạng bột, sau đó được trộn đồng đều với KBr đã sấy khô theo tỷ lệ 1:200 Hỗn hợp này được nén dưới áp suất cao tạo thành màng mỏng dạng film, đồng thời hút chân không để loại bỏ hoàn toàn hơi ẩm.

+ Quét phổ trong vùng 4000-400 cm -1 và ghi phổ ở độ phân giải 4 cm -1

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi là MeOH, chế độ ESI(+)-HR-MS

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với các thông số máy được cài đặt như sau:

+ Phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz

+ Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

+ Nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K

+ Dung môi pha mẫu là DMSO-d 6

2.3.4 Phương pháp thử tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits [61]

Phép thử xác định hàm lượng protein tế bào sống bằng mật độ quang học (OD) dựa trên nguyên lý gắn Sulforhodamin B (SRB) vào phân tử protein Mật độ quang học đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với protein, do đó OD càng lớn thì lượng tế bào sống càng nhiều.

2.3.4.2 Các dòng tế bào thử nghiệm và chất đối chiếu dương tính

- Thử hoạt tính ức chế tế bào trên một dòng tế bào thường và hai dòng tế bào ung thư gồm:

+ SW620: tế bào ung thư đại tràng người

+ MDA-MB-231: tế bào ung thư vú người

+ MRC-5: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi

Các dòng tế bào này được mua từ Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung một số thành phần cần thiết

- Chất đối chiếu dương tính: SAHA (Vorinostat), ADR (Adriamycin)

2.3.4.3 Các bước tiến hành Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:

+ Các tế bào ung thư ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM được bổ sung 5% FBS Đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (thường là 3 x 10 4 tế bào/ml) Thêm vào mỗi giếng trờn đĩa 96 giếng 180 àL dịch tế bào, rồi đem ủ trong 24 giờ ở 37 o C trong điều kiện 5% CO2

Để xác định nồng độ ức chế, các chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng môi trường nuôi cấy Sau đó, các dung dịch chất thử đã pha loãng được thêm vào các giếng của đĩa 96 giếng đã được ủ với tế bào ung thư Giếng chỉ chứa dịch tế bào ung thư mà không có chất thử được sử dụng làm đối chứng ngày 0.

+ Cố định tế bào và nhuộm màu: Các giếng được ủ thêm 48 giờ ở 37 o C trong điều kiện 5% CO2 Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng dung dịch TCA lạnh trong 1 giờ Tiếp đó, tất cả các giếng được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 o C, rửa 3 lần bằng acid acetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng

+ Đo độ hấp thụ màu: Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn lại được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, đồng thời đặt đĩa trong máy lắc khoảng 10 phút Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

Khả năng ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% ức chế = 100% −[OD chất thử − OD ngày 0 ] × 100

ODđối chứng âm− OD ngày 0

Trong đó, đối chứng âm là giá trị OD của giếng chỉ thêm dung môi pha chất thử (hay DMSO)

Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử mà ở đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Giá trị IC50 được xác định nhờ vào phần mềm Probits.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

HÓA HỌC

Bảy dẫn chất của N-hydroxyoctanamid được tổng hợp tương tự nhau như mô tả trong sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung của các chất 7a-g 3.1.1.1 Tổng hợp nguyên liệu ethyl 8-azidooctanoat (2)

Chất 2 được tổng hợp bằng phản ứng azid hóa giữa ethyl 8-bromooctanoat với natri azid, sử dụng dung môi methanol Phản ứng được mô tả trong sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp chất 2

- Cân 2,51 g (10,0 mmol) ethyl 8-bromooctanoat (1) sau đó hòa tan hoàn toàn vào khoảng 50mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml

- Thêm 5 đương lượng NaN3 là 3,25 g NaN3 (50,0 mmol) vào bình phản ứng

- Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong vòng 36 giờ

- Sau khi phản ứng kết thúc, loại dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm

- Thêm 30ml nước cất vào hỗn hợp cắn, chiết pha nước đó với pha DCM (chiết 3 lần x 30 ml)

- Thu lại pha dicloromethan (DCM), sau đó làm khan dịch chiết bằng Na2SO4

- Cô quay loại hết dung môi DCM thu được sản phẩm (2)

- Cảm quan: chất lỏng màu trắng

Nguyên liệu ethyl 8-azidooctanoat sẽ được sử dụng cho phản ứng tổng hợp các dẫn chất 7a-g được trình bày dưới dây

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-8-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)octanamid (7a) a Tổng hợp chất quinazolin-4(3H)-on (4a)

Chất trung gian 4a được tổng hợp từ acid 2-aminobenzoic (3a) bằng phản ứng đóng vòng quinazolin với tác nhân formamid theo sơ đồ 3.3

Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất 4a

- Cân 274 mg (2,0 mmol) acid 2-aminobenzoic (3a) vào 450 mg formamid (5 đương lượng) trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 120℃ trong khoảng 5 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM : MeOH = 15 : 1 cho đến khi kết thúc

- Sau khi kết thúc phản ứng, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng 30 ml dung dịch natri hydrocarbonat (NaHCO3) thì thấy xuất hiện tủa sản phẩm màu vàng nâu nhạt tạo thành

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa ở 60 o C trong vòng 24 giờ thu được sản phẩm 4a

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng nâu

- R f = 0,46 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5a) Điều chế chất trung gian 5a từ chất 4a bằng phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân formamid và xúc tác KI Phản ứng được mô tả trong sơ đồ 3.4

- Hòa tan 219 mg (1,5 mmol) chất 4a vào 30ml aceton trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL, sau đó thêm khoảng 414 mg K2CO3 (2 đương lượng)

- Đun hồi lưu hỗn hợp trong khoảng 1 giờ

- Thêm khoảng 30 mg KI (0,12 đương lượng) và 178,5 mg propargyl bromid (1 đương lượng) vào bình cầu, tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng trong vòng 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với dung môi pha động là DCM : MeOH = 15:1

- Sau khi phản ứng kết thúc, cô quay loại aceton ở áp suất giảm thu được hỗn hợp chất rắn màu xám nhạt

- Thêm 30ml nước cất vào hỗn hợp chất rắn và chiết với DCM trong bình chiết (3 lần x 30 ml)

- Thu pha DCM và làm khan bằng Na2SO4

- Cô quay chân không loại DCM thu được sản phẩm trung gian màu trắng 5a

- Cảm quan: chất rắn, màu trắng

- R f = 0,76 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)octanoat (6a)

Chất 6a được tổng hợp bằng phản ứng Click cộng đóng vòng alkyn - azid giữa chất

5a với ethyl 8-azidooctanoat (2), sử dụng xúc tác đồng(I) Phản ứng được mô tả trong sơ đồ 3.5

- Hòa tan 184 mg chất 5a (1 mmol) và 213 mg ethyl 8-azidooctanoat (2) (1 đương lượng) vào 15 ml MeCN trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Thêm khoảng 50 mg CuI và đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong vòng 4 giờ

- Để nguội bình phản ứng đến nhiệt độ phòng, cô quay loại dung môi MeCN dưới áp suất giảm thu được hỗn hợp rắn

- Thêm 30 ml dung dịch Na2CO3 vào hỗn hợp rắn, sau đó chiết hỗn hợp thu được

- Tiến hành lọc hỗn hợp thu được qua phễu lọc Buchner với chất trợ lọc Celite để loại bỏ kết tủa không tan, thu pha ethyl acetat (EA)

- Làm khan pha EA bằng Na2SO4 và cô quay loại dung môi thu được sản phẩm là chất rắn màu vàng 6a

- Cảm quan: chất rắn, màu vàng

- R f = 0,52 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-8-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanamid (7a)

Dẫn chất 7a được tạo thành thông qua phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester trung gian 6a và hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm mạnh Phản ứng được mô tả trong sơ đồ 3.6

- Phân tán đều 198,5 mg (0,5 mmol) chất 6a và 347,5 mg NH2OH.HCl (5 mmol, 10 đương lượng) vào 10,0 mL MeOH trong bình cầu sạch đáy tròn dung tích 50 mL

- Làm lạnh bình phản ứng đến 0℃ bằng hỗn hợp đá muối, khuấy nhẹ nhàng hỗn hợp trong bình phản ứng

- Thêm từ từ dung dịch NaOH bão hòa trong nước vào bình phản ứng đến khoảng pH = 11 – 12 và tiếp tục cho phản ứng thêm 60 phút ở 0℃

- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl 5% và TLC, tiến hành như sau:

Để phân tích sản phẩm phản ứng, lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng cho vào lọ, thêm 1 ml nước cất pha loãng Sau đó, làm axit hóa hỗn hợp bằng dung dịch HCl 5%, chiết sản phẩm bằng dung môi hữu cơ ethyl acetate (EA) Chấm dung dịch hữu cơ lên bản mỏng và chạy sắc ký lớp mỏng với dung môi là hỗn hợp dichloromethane (DCM) và methanol (MeOH) theo tỷ lệ 9:1 Sản phẩm được phát hiện bằng thuốc thử FeCl3.

5% Phản ứng kết thúc khi thấy vết ester 6a không còn quan sát thấy trên bản mỏng

- Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình phản ứng 20 ml nước cất Tiếp theo, trung hòa hỗn hợp bằng HCl 5%

- Tiếp tục làm lạnh hỗn hợp trong tủ âm qua đêm để kết tinh sản phẩm

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất

- Kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp dung môi MeOH – H2O, sấy khô tủa ở 60℃

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC với dung môi pha động là DCM : MeOH = 9:1 Thu được sản phẩm (7a)

- R f = 0,45 (hệ dung môi DCM : MeOH= 9:1)

- Hiệu suất toàn phần được trình bày ở bảng 3.1

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-8-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)octanamid (7b)

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất 7b a Tổng hợp chất 6-methylquinazolin-4(3H)-on (4b)

* Tiến hành, xử lý phản ứng:

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 302 mg chất 3b thu được 289,3 mg sản phẩm 4b

- R f = 0,48 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5b)

- R f = 0,74 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6b)

- R f = 0,49 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-8-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)octanamid (7b)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 7a, sử dụng 205,5 mg chất 6b thu được 123 mg sản phẩm 7b

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-8-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)octanamid (7c)

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất 7c a Tổng hợp chất 7-methylquinazolin-4(3H)-on (4c)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 302 mg chất 3c thu được 272,3 mg sản phẩm 4c

- R f = 0,47 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 7-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5c)

- R f = 0,75 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6c)

- R f = 0,50 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất N-hydroxy-8-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)octanamid (7c)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 7a, sử dụng 205,5 mg chất 6c thu được 134,7 mg sản phẩm 7c

- R f = 0,43 (hệ dung môi DCM : MeOH = 9:1)

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất 8-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7d)

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất 7d a Tổng hợp chất 6-fluoroquinazolin-4(3H)-on (4d)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 310 mg chất 3d thu được 285,7 mg sản phẩm 4d

- R f = 0,47 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-fluoro-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5d)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 5a, sử dụng 250,5 mg chất 4d thu được 267,2 mg sản phẩm 5d

- R f = 0,74 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6d)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 6a, sử dụng 202 mg chất 5d thu được 361,1 mg sản phẩm 6d

- R f = 0,52 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 8-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7d)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 7a, sử dụng 207,5 mg chất 6d thu được 106,3 mg sản phẩm 7d

3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất 8-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7e)

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp chất 7e a Tổng hợp chất 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (4e)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 310 mg chất 3e thu được 299,8 mg sản phẩm 4e

- R f = 0,46 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 7-fluoro-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5e)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 5a, sử dụng 250,5 mg chất 4e thu được 275,4 mg sản phẩm 5e

- R f = 0,75 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6e)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 6a, sử dụng 202 mg chất 5e thu được 370,6 mg sản phẩm 6e

- R f = 0,52 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 8-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7e)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 7a, sử dụng 207,5 mg chất 6e thu được 110,8 mg sản phẩm 7e

3.1.1.7 Tổng hợp dẫn chất 8-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7f)

Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp chất 7f a Tổng hợp chất 6-bromoquinazolin-4(3H)-on (4f)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 432 mg chất 3f thu được 374,9 mg sản phẩm 4f

- R f = 0,48 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 6-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5f)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 5a, sử dụng 337,5 mg chất 4f thu được 348,7 mg sản phẩm 5f

- R f = 0,75 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6f)

- R f = 0,51 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 8-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7f)

3.1.1.8 Tổng hợp dẫn chất 8-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7g)

Sơ đồ 3.12 Quy trình tổng hợp chất 7g a Tổng hợp chất 7-bromoquinazolin-4(3H)-on (4g)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 4a, sử dụng 432 mg chất 3g thu được 407,3 mg sản phẩm 4g

- R f = 0,47 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất 7-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5g)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 5a, sử dụng 337,5 mg chất 4g thu được 359 mg sản phẩm 5g

- R f = 0,74 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất ethyl 8-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)octanoat (6g)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 6a, sử dụng 263 mg chất 5g thu được 396,5 mg sản phẩm 6g

- R f = 0,49 (hệ dung môi DCM : MeOH = 15:1) d Tổng hợp chất 8-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)-N-hydroxy-octanamid (7g)

- Quy trình tương tự như tổng hợp 7a, sử dụng 238 mg chất 6g thu được 141 mg sản phẩm 7g

Bảng 3.1 Cảm quan và hiệu suất toàn phần quá trình tổng hợp dẫn chất 7a-g

Dẫn chất R Cảm quan Hiệu suất toàn phần (%)

7b 6-CH3 Chất rắn màu trắng 44,2

7c 7-CH3 Chất rắn màu trắng 44,4

7f 6-Br Chất rắn màu trắng 37,5

7g 7-Br Chất rắn màu trắng 41,8

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất 7a-g sau khi tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Phương pháp này được thực hiện trên bản mỏng Silica gel F254 với các hệ dung môi pha động là DCM : MeOH (9:1), DCM : MeOH (15:1), DCM : MeOH (90:1) Các chất đã tổng hợp được hòa tan bằng dung môi thích hợp, sau đó chấm lên bản mỏng và tiến hành triển khai sắc ký Sau khi kết thúc, sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy các dẫn chất 7a-g đều có vết tròn,

3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Các sản phẩm cuối cùng thu được sau tinh chế đều ở thể rắn Vì vậy, có thể tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện để kiểm tra độ tinh khiết Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.2 Kết quả cho thấy: các dẫn chất

7a-g có điểm chảy xác định (khoảng dao động hẹp, khoảng 1℃)

Bảng 3.2 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất 7a-g

(Hệ dung môi sắc kí DCM : MeOH = 9:1)

Như vậy, dữ liệu về sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều tinh khiết và đủ điều kiện để đo phổ

3.1.3 Xác định cấu trúc Để xác định cấu trúc các chất đã tổng hợp được, các phương pháp: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR) đã được sử dụng Kết quả được trình bày dưới đây và trong phần phụ lục

Phổ IR được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr Các phổ đồ được ghi lại ở các phụ lục 1-7 Kết quả phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phổ hồng ngoại IR của các dẫn chất 7a-g

Số sóng ứng với dao động hóa trị của các liên kết (cm -1 )

Qua bảng 3.3 và phân tích phổ đồ IR (Phụ lục 1-7), quan sát thấy sự xuất hiện của một số nhóm chức cụ thể dựa trên vị trí, cường độ và hình dạng các đỉnh như O-H, C=O đặc trưng cho acid hydroxamic Tuy nhiên, để xác định cấu trúc của bảy dẫn chất đã tổng hợp, cần có thêm các dữ liệu từ các phương pháp phân tích khác.

Các phổ đồ MS được ghi ở phụ lục 8-14 Kết quả phân tích dữ liệu phổ khối lượng được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả phổ khối lượng HR-MS của các dẫn chất 7a-g

Chất R CTPT KLPT Pic ion phân tử (m/z)

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.4 và phân tích phổ đồ (phụ lục 8-14), có thể nhận thấy trên phổ đồ xuất hiện các pic ion với cường độ mạnh tương ứng khối lượng phân tử dự kiến Từ đó, có thể khẳng định kết quả phổ khối lượng HR-MS phù hợp với công thức dự kiến của bảy dẫn chất 7a-g

3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Phổ 1 H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500, sử dụng tần số máy là 500 MHz và dung môi DMSO-d 6 Các phổ đồ được ghi ở phụ lục 15-21 Kết quả phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) của dẫn chất 7a-g

Chất R Kết quả δ (ppm), J (Hz)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10,32 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 8,55 (1H, s, H-2’’); 8,15 (1H, d, J = 8,00 Hz, H-5’’); 8,12 (1H, s, H-5’); 7,84 (1H, t, J = 7,50 Hz, H-6’’); 7,70 (1H, d, J = 8,00

Hz, H-8’’); 7,56 (1H, t, J = 7,50 Hz, H-7’’); 5,26 (2H, s, CH2); 4,30 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-8a, H-8b); 1,91 (2H, t, J = 7,25 Hz, H-2a, H- 2b); 1,76 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-7a, H-7b); 1,44 ( 2H, t, J = 7,00 Hz, H-3a, H-3b); 1,23-1,18 (6H, m, H-4a, H-4b, H-5a, H-5b, H-6a, H- 6b)

J = 8,50 Hz, H-7’’); 5,36 (2H, s, CH2); 4,40 (2H, t, J = 7,00 Hz, H- 8a, H-8b); 2,55 (3H, s, CH3); 2,01 (2H, t, J = 7,50 Hz, H-2a, H-2b); 1,88 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-7a, H-7b); 1,54 ( 2H, m, H-3a, H-3b); 1,35-1,33 (6H, m, H-4a, H-4b, H-5a, H-5b, H-6a, H-6b)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10,31 (1H, s, NH); 8,51 (1H, s, H-2’’); 8,11 (1H, s, H-5’); 8,03 (1H, d, J = 8,50 Hz, H-5’’); 7,50 (1H, s, H-8’’); 7,38 (1H, d, J = 8,00 Hz, H-6’’); 5,24 (2H, s, CH2); 4,30 (2H, t, J = 7,25 Hz, H-8a, H-8b); 2,46 (3H, s, CH3); 1,91 (2H, t, J = 7,25 Hz, H-2a, H-2b); 1,76 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-7a, H-7b); 1,44 ( 2H, t, J = 7,00 Hz, H-3a, H-3b); 1,23-1,21 (6H, m, H-4a, H-4b, H-5a, H-5b, H-6a, H-6b)

Chất R Kết quả δ (ppm), J (Hz)

(1H, s, H-5’); 7,83-7,77 (2H, m, H-5’’, H-8’’); 7,73 (1H, m, H-7’’); 5,27 (2H, s, CH2); 4,30 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-8a, H-8b); 1,91 (2H, t, J = 7,25 Hz, H-2a, H-2b); 1,76 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-7a, H-7b); 1,44 ( 2H, t, J = 7,00 Hz, H-3a, H-3b); 1,25-1,23 (6H, m, H-4a, H- 4b, H-5a, H-5b, H-6a, H-6b)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10,36 (1H, s, NH); 8,70 (1H, s, OH); 8,65 (1H, s, H-2’’); 8,26 (1H, m, H-8’’); 8,18 (1H, s, H-5’); 7,55 (1H, dd, J = 10,00 Hz, J’ = 2,00 Hz, H-5’’); 7,48 (1H, m, H- 6’’); 5,31 (2H, s, CH2); 4,35 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-8a, H-8b); 1,96 (2H, t, J = 7,25 Hz, H-2a, H-2b); 1,82 (2H, m, H-7a, H-7b); 1,50 ( 2H, m, H-3a, H-3b); 1,28-1,26 (6H, m, H-4a, H-4b, H-5a, H-5b, H- 6a, H-6b)

1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10,32 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 8,60 (1H, s, H-2’’); 8,23 (1H, d, J = 2,50 Hz, H-5’’); 8,13 (1H, s, H-5’); 8,00 (1H, dd, J = 9,00 Hz, J’ = 2,00 Hz, H-7’’); 7,67 (1H, d, J = 8,25 Hz, H-8’’); 5,27 (2H, s, CH2); 4,31 (2H, t, J = 7,25

(2H, s, CH2); 4,30 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-8a, H-8b); 1,91 (2H, t, J 7,50 Hz, H-2a, H-2b); 1,76 (2H, t, J = 7,00 Hz, H-7a, H-7b); 1,44 ( 2H, t, J = 7,25 Hz, H-3a, H-3b); 1,23-1,19 (6H, m, H-4a, H-4b, H- 5a, H-5b, H-6a, H-6b)

Chú thích: δ: độ dịch chuyển hóa học; s: singlet, pic đơn; d: doublet, pic đôi; t: triplet, pic ba; m: multiplet, nhiều pic

Dựa vào Bảng 3.5 và Phổ đồ (Phụ lục 15-21), số lượng proton (δH), độ dịch chuyển hóa học (δC), độ bội của pic (Int), hằng số ghép cặp (J) phù hợp với công thức dự kiến của 7 hợp chất dẫn xuất 7a-g.

3.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

Phổ 13 C-NMR cũng được ghi bằng thiết bị đo giống phổ 1 H-NMR, tuy nhiên sử dụng tần số máy 125 MHz Các phổ đồ được ghi ở phụ lục 22-28 Kết quả phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) được trình bày trong bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) của dẫn chất 7a-g

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.6 và phổ đồ (phụ lục 22-28), có thể nhận thấy số lượng carbon và độ dịch chuyển hóa học phù hợp với công thức dự kiến của bảy dẫn chất tổng hợp được Như vậy, từ kết quả các dữ liệu phổ, có thể khẳng định rằng: đã tổng hợp được bảy dẫn chất 7a-g theo thiết kế ban đầu.

THỬ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO

Các dẫn chất 7a-g được đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên hai dòng tế bào ung thư là ung thư đại tràng (SW620) và ung thư vú (MDA-MB-231) Bên cạnh đó, các dẫn chất đồng thời được thử trên dòng tế bào thường MRC-5 (dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi) để xác định độc tính trên tế bào thường, từ đó dự đoán sơ bộ tính chọn lọc gây độc giữa tế bào ung thư và tế bào thường Phương pháp thử được dùng là phương pháp Sulfohordamin B (SRB) Kết quả giá trị IC50 của các dẫn chất được trình bày trong bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế tế bào ung thư của các dẫn chất 7a-g

Chất R Log P 1 Độc tớnh tế bào (IC 50 , 2 àM) trờn từng dũng tế bào 3

Dựa trên tính toán bằng phần mềm Chemdraw 16.0, nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của các hợp chất trên ba dòng tế bào (SW620: ung thư đại tràng, MDA-MB-231: ung thư vú, MRC-5: tế bào nguyên bào sợi phổi của thai nhi) Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50) được sử dụng để so sánh Các chất đối chiếu dương tính bao gồm SAHA (suberoylanilid hydroxamic acid) và ADR (Adriamycin).

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.7, có thể nhận thấy rằng hầu hết các dẫn chất tổng hợp được (trừ 7g) đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên cả hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm ở nồng độ IC50 < 60àM Nhỡn chung, cỏc chất thể hiện độc tớnh trờn dòng tế bào SW620 tốt hơn trên dòng tế bào MDA-MB-231.

BÀN LUẬN

Quá trình tổng hợp các dẫn chất 7a-g trải qua một số phản ứng khác nhau Các sản phẩm trung gian có chứa các nhóm chức kém bền nên cần kiểm soát chặt chẽ các điều kiện phản ứng để tránh tạo ra các sản phẩm phụ

3.3.1.1 Phản ứng azid hóa với tác nhân natri azid

Phản ứng azid hóa giữa ethyl 8-bromooctanoat (1) và natri azid trong dung môi MeOH được diễn ra dễ dàng với hiệu suất khá cao (92,2%)

Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng azid hóa bao gồm: loại dung môi sử dụng, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, khả năng phản ứng của tác nhân azid hóa và tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng Trong nghiên cứu này, methanol được chọn làm dung môi do khả năng hòa tan tốt chất 1, dễ kiếm, giá thành rẻ và phổ biến Tỷ lệ mol của các chất tham gia được sử dụng là 5 đương lượng và phản ứng được tiến hành dưới điều kiện đun hồi lưu.

Theo nghiên cứu, thời gian phản ứng tối ưu là 36 giờ để đạt được phản ứng hoàn toàn và tăng tốc độ phản ứng Ion azid, một nhóm thế ái, đóng vai trò là tác nhân phản ứng, tấn công vào carbon bậc 1 liên kết với brom Quá trình này dẫn đến sự loại bỏ ion bromid theo cơ chế thế ái nhân SN2.

Sơ đồ 3.13 Cơ chế phản ứng azid hóa tạo thành sản phẩm 2 3.3.1.2 Phản ứng ngưng tụ Niementowski tạo vòng quinazolin

Phản ứng bắt đầu bằng sự tấn công ái nhân của cặp điện tử tự do trên nguyên tử N của nhóm amin thơm vào nguyên tử C của nhóm C=O trên formamid, sau đó một phân tử nước được loại đi để tạo thành hợp chất 4’ Giả thuyết này dựa trên sự phát hiện vết tinh chế sản phẩm Hợp chất 4’ tiếp tục ngưng tụ nội phân tử và loại đi phân tử nước thứ hai để tạo thành 4

Sơ đồ 3.14 Cơ chế phản ứng đóng vòng quinazolin tạo thành sản phẩm 4

Formamid trong phản ứng này vừa đóng vai trò là dung môi hòa tan 3, vừa đóng vai trò là tác nhân phản ứng Mặt khác, chất ban đầu 3 tan rất ít trong formamid ở nhiệt độ phòng nhưng độ tan tăng khi cung cấp nhiệt cho phản ứng Do đó, cần phải cho dư lượng formamid đủ để hòa tan chất 3 Ngoài ra, formamid có thể tan trong nước nên dễ dàng loại đi khỏi hỗn hợp sản phẩm khi tủa sản phẩm 4 trong nước và rửa sạch tủa bằng nước Nhiệt độ phản ứng được lựa chọn là 120 o C Tại nhiệt độ này, các acid 2- aminobenzoic tồn tại ở dạng lỏng, giúp tăng diện tích tiếp xúc với formamid và tăng tốc độ phản ứng Ngoài ra, nhiệt độ này còn giúp bay hơi nước, nhằm mục đích giảm lượng nước có trong hỗn hợp phản ứng, giúp quá trình cân bằng tách nước của hai lần ngưng tụ chuyển dịch mạnh hơn về chiều thuận theo nguyên lí Le Chatelier [58]

Dung dịch NaHCO3 đã được sử dụng để xử lí hỗn hợp sản phẩm do có khả năng chuyển các dạng acid của chất ban đầu 3 còn dư, chất trung gian 4’ thành dạng muối đều tan được trong nước, giảm thiểu khả năng kết tủa cùng với sản phẩm 4

Sơ đồ 3.15 Cơ chế phản ứng N-alkyl hóa tạo thành sản phẩm 5 Đây là phản ứng N-alkyl hóa của các dẫn chất quinazolin với tác nhân là propargyl bromid Các phản ứng này đều xảy ra khá dễ dàng và đạt hiệu suất cao (nằm trong khoảng 86,8 - 91,0%)

Nhóm nghiên cứu có sử dụng KI làm chất tham gia phản ứng do KI có độ tan lớn hơn so với KBr trong dung môi aceton, dẫn đến liên kết C-Br bị làm yếu đi Khi đó, liên kết C-I có độ bền kém hơn liên kết C-Br, tạo điều kiện cho phản ứng thế ái nhân SN2 của chất 4 vào carbon lai hóa sp 3 của tác nhân alkyl hóa, giúp nhóm thế đi ra dễ hơn, làm tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng

Ngoài ra, quá trình tiến hành phản ứng này cần sử dụng lượng dung môi aceton đủ để phân tán chất rắn 4, giúp tăng diện tích tiếp xúc, từ đó tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng Mặt khác, hợp chất 4 có tính ái nhân yếu nên phản ứng có sử dụng K2CO3 là một base đóng vai trò hoạt hóa nhóm NH trong quinazolin để tạo thành một anion có tính ái nhân cao hơn, dễ dàng tấn công vào tác nhân alkyl hóa [63]

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng phản ứng giữa các dẫn chất amid vòng tương tự quinazolin với tác nhân alkyl bromid ngoài sinh ra sản phẩm N-alkyl hoá còn có thể sinh ra sản phẩm O-alkyl hoá tuỳ điều kiện phản ứng Tuy nhiên, có thể khẳng định rằng phản ứng trong khoá luận là phản ứng N-alkyl hoá thông qua dữ liệu phổ 1 H-NMR và

13C-NMR của các dẫn chất 7a-g

3.3.1.4 Phản ứng Click cộng đóng vòng alkyn – azid xúc tác đồng(I) iodid (CuAAC)

Sơ đồ 3.16 Cơ chế phản ứng CuAAC tạo thành sản phẩm 6

Phản ứng bắt đầu bằng sự hình thành giữa phân tử alkyn với nguyên tử đồng thứ nhất thông qua liên kết π Tiếp theo đó nguyên tử đồng thứ hai tiếp tục tạo phức vào alkyn này thông qua liên kết σ Phức hợp này có khả năng phản ứng được với phân tử azid để tạo nên phức hợp trung gian 6’ chứa 2 nguyên tử đồng Cuối cùng, hai nguyên tử đồng lần lượt được loại bỏ để tạo sản phẩm 1,2,3-triazol chọn lọc tại vị trí thế 1,4 Vậy nên, đồng(I) là chất xúc tác với mục đích tạo đồng phân thế ở vị trí 1,4 Phản ứng này được gọi là phản ứng cộng đóng vòng alkyn – azid xúc tác đồng(I) (CuAAC) [6]

Phản ứng sử dụng dung môi MeCN vì nó hòa tan tốt cả azid và sản phẩm alkyl hóa, cũng như một phần chất xúc tác CuI, tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng Hiệu suất phản ứng cao, gần như hoàn toàn (83,3 – 91,1%) Ngoài ra, sử dụng trực tiếp Cu(I) giúp tăng tốc độ phản ứng so với tạo Cu(I) từ quá trình khử Cu(II).

3.3.1.5 Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic sử dụng hydroxylamin hydroclorid (NH 2 OH.HCl) với sự có mặt của kiềm

Sơ đồ 3.17 Cơ chế phản ứng hydroxamic hóa tạo thành sản phẩm 7

Muối hydroclorid (NH2OH.HCl) là dạng phổ biến của hydroxylamin tự do (NH2OH) trong các phản ứng vì NH2OH không ổn định Để tạo NH2OH tự do từ muối này, cần sử dụng NaOH, nhưng trong điều kiện kiềm mạnh của NaOH, phản ứng cũng tạo ra acid carboxylic không mong muốn Để hạn chế sản xuất acid carboxylic, điều quan trọng là phải kiểm soát giá trị pH bằng cách điều chỉnh lượng NaOH được thêm vào trong quá trình phản ứng.

Nhóm nghiên cứu đã thực nghiệm và nhận thấy rằng phản ứng hydroxamic hóa chỉ xảy ra ở pH > 10 Do vậy, NaOH ở đây còn có vai trò tạo pH đủ cao để phản ứng có thể xảy ra Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, môi trường kiềm mạnh sẽ làm các ester dễ bị thuỷ phân tạo tạp acid carboxylic rất khó loại bỏ, cho nên pH = 11-12 được nhóm nhiên cứu lựa chọn để thực hiện phản ứng Phản ứng cần được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (khoảng 0-5℃), đồng thời nhỏ từ từ dung dịch NaOH đã được làm lạnh vào bình phản ứng để dễ kiểm soát giá trị pH đồng thời tránh tăng nhiệt độ đột ngột làm thủy phân ester

Kết quả phổ hồng ngoại đã được quy kết (Bảng 3.3 và phụ lục 1-7) và cho thấy hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân tử dự kiến, với các vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các nhóm chức và liên kết

Tiêu đề	Tổng hợp và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxyoctanamid mới mang dị vòng 4-oxoquinazolin
Tác giả	Trần Thị Thu Huyền
Người hướng dẫn	PGS. TS. Phan Thị Phương Dung, TS. Dương Tiến Anh
Trường học	Trường Đại học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Dược sĩ
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	98
Dung lượng	3,99 MB