đỗ thị thu phân lập đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh pge2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ loài bát giác liên podophyllum difforme hemsl e h wilson họ hoàng liên gai b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THU PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ VÀ ỨC CHẾ SẢN SINH PGE2 IN VITRO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢ

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Podophyllum

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Podophyllum

Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, chi Podophyllum thuộc [3]:

Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae

Tuy nhiên: Theo Shaw, chi Dysosma được xếp vào chi Podophyllum Nên theo nhiều tài liệu, một số loài thuộc chi Dysosma cũng được sắp xếp thuộc chi Podophyllum [1]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Podophyllum

Cây thảo, sống lâu năm Thân rễ bò, có nhiều mấu, nhiều rễ con dạng sợi Thân cây (phần trên mặt đất) mọc thẳng, có lá bắc lớn bao quanh gốc Lá hình khiên, chia 3-9 thùy Hoa mọc thành cụm hoặc thành chùm tán Lá đài 6, chia vách Tràng hoa 6, màu đỏ tía Bao phấn dài, hướng trong, tự khai Nhụy hoa đơn độc; bầu 1 ô; nhiều lá noãn; đầu nhụy hình cầu Quả mọng màu đỏ hoặc đỏ tía Hạt nhiều, phần thịt quả ít [1] Chi Podophyllum có 32 loài [4], trong đó có khoảng 10 loài được tìm thấy ở Trung Quốc và Việt Nam, trong đó có 7 loài phổ biến ở Trung Quốc (được phân vào chi

Dysosma) và 3 loài (được phân vào chi Podophyllum) [1]

Bảy loài phổ biến bao gồm:

 Podophyllum majoense Gagnepain (Dysosma majoensis)

 Podophyllum versipelle Hance (Dysosma versipellis)

 Podophyllum difforme Hemsley & E H Wilson (Dysosma difformis)

 Podophyllum aurantiocaule Handel-Mazzetti (Dysosma aurantiocaulis)

 Podophyllum pleianthum Hance (Dysosma pleiantha)

 Podophyllum aurantiocaule Shaw (Dysosma tsayuensis)

 Podophyllum delavayi Franchet (Dysosma delavayi)

Ba loài hiếm gặp bao gồm:

Và một loài Dysosma villosa mới được phát hiện năm 2019 tại Tây Nam, Trung Quốc [5]

1.1.3 Thành phần hóa học của chi Podophyllum

Thành phần hóa học của chi Dysosma nói riêng và chi Podophyllum nói chung có thể chia thành 2 nhóm là: lignan và flavonoid Tác dụng chữa bệnh chủ yếu do podophyllin quy định và có thể thu được podophyllin bằng cách chiết dược liệu với ethanol Thành phần này chủ yếu là các lignan-C18 trong đó podophyllotoxin chiếm hàm lượng lớn, bên cạnh đó cũng thu được các lignan khác như demethylpodophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và podophyllotoxon Một số flavonoid cũng đã được phân lập từ nhựa bao gồm astragalin, isorhamnetin, kaempferol và quercetin Những thành phần không tạo thành nhựa là: albumen, calci oxalat, acid gallic, tinh bột, chất béo và chất dễ bay hơi [6]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy từ thân rễ của D aurantiocaulis và D pleianthum đã phân lập được 10 lignan, bao gồm: picropodophyllin, podophyllotoxin, 4'- demethylpodophyllotoxin, diphyllin, dehydropodophyllotoxin, podophyllotoxon, picllropodophyllon, ismethylpodophyllophyllon desosoneoxjolophyll và hai anthraquinon: physcion và dysoanthraquinon [7] Từ thân rễ loài D versipellis đã xác định được cấu trúc của 15 hợp chất là: β-sitosterol, 4'-demethylpodophyllotoxin, kaempferol, picropodophyllotoxin-4-O-glucosid, cleistanthin-B, kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid, 4'-demethylpodophyllotoxin-4-O-glucosid, quercetin-3-O-β-D- glucopyranosid, icropodophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosid, quercetin, daucosterol, podophyllotoxon, acid vanillic, 4'- demethyldeoxypodophyllotoxin và sucrose [8], [9], [10]

Ngoài ra từ thân rễ của loài P sikkimensis còn phần lập được hợp chất sikkimotoxin - một lacton có công thức phân thử C23H26O8 [11]

Hình 1.1.Các hợp chất lignan trong một số loài Podophyllum

1.1.4 Tác dụng sinh học và độc tính của chi Podophyllum

1.1.4.1 Tác dụng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư là một tác dụng dược lý chính của chi

Podophyllum, trong đó hợp chất podophyllotoxin (PTOX) là một lignan aryl-tetralin được tìm thấy trong D versipellis đóng vai trò quan trọng Từ PTOX người ta đã bán tổng hợp ra etoposid, etopopho và teniposid các hợp chất này được sử dụng trên lâm

6 sàng để điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư phổi, ung thư bạch cầu, ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và ung thư tinh hoàn [12], [13], [14]

Theo nghiên cứu của Pu và cộng sự dịch chiết từ loài D versipellis có khả năng ức sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư thực quản CP-C [15] Ba hợp chất podophyllotoxin, 4'-demethylpodophyllotoxin và deoxypodophyllotoxin được phân lập từ thân rễ loài D versipellis có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt với giỏ trị IC50 trong khoảng 0,030-0,056 và 0,032-0,082 àM [13] Hai hợp chất podophyllotoxon và 4'-demethylpodophyllotoxin được phân lập từ thân rễ loài D versipellis có tác dụng ức chế mạnh trên ba dòng tế bào PC3 (ung thư biểu mô tuyến tiền liệt), Bcap-37 (ung thư vú) và BGC-823 (ung thư biểu mô dạ dày) với các giá trị IC50 tương ứng là 17,8 ± 1,0 μM, 21,1 ± 1,8 μM, 19 ± 1,6 μM và 10,6 ± 1,5 μM, 13,2 ± 0,5 μM và 11,5 ± 0,6 μM [10] Trên bào ung thư gan HepG2, 04 hợp chất là: 4'- demethylpodophyllotoxin, α-peltatin, podophyllotoxin và β-peltatin được phân lập từ D versipellis đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HepG2 với giá trị

IC50 < 50 nM, trong đó β-peltatin thể hiện khả năng ức chế tốt nhất với giá trị IC50 là 5 nM [16]

Ngoài ra trong một nghiên cứu khác, kết hợp phân tử nano bạc với dịch chiết nước từ thân rễ loài D pleiantha tạo thành hạt nano (AgNPs), sau đó khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MDA-MB-231 và MDA-MB-453) và tế bào ung thư dạ dày (AGS) của các hạt AgNPs Kết quả cho thấy, AgNPs có khả năng ức chế sự phát triển và phá hủy ADN trờn hai dũng tế bào này với giỏ trị IC50 lần lượt là 33,521 và 36,25 àM Ngoài ra, AgNPs cũng thể hiện khả năng gây độc đối với tế bào ung thư dạ dày của người với

IC50 là 7,14 àM Do đú, cỏc AgNPs được tổng hợp từ thõn rễ D pleiantha cú thể được sử dụng trong quá trình nghiên cứu phát triển các loại thuốc chống ung thư mới [17]

1.1.4.2 Tác dụng bảo vệ gan

Quercetin và kaempferol được phân lập từ loài P versipellis đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan do độc tố podophyllotoxin gây ra Thí nghiệm trên chuột cho thấy, nhóm sử dụng cả podophyllotoxin và flavonoid có tỷ lệ tử vong và tổn thương gan, thận thấp hơn đáng kể so với nhóm chỉ dùng podophyllotoxin Các tác dụng biểu hiện trên

7 lâm sàng gồm giảm nồng độ transaminase huyết tương, phosphatase kiềm, lactat dehydrogenase, ure huyết tương, creatinin và tăng nồng độ glutathion [13], [18]

Podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và β-peltatin được phân lập từ thân rễ các loài Podophyllum có hoạt tính chống lại virus sởi và virus Herpes simplex I với cơ chế có thể là phá vỡ các tế bào vi khuẩn gây cản trở sự nhân lên của virus [19]

Các bộ phận như quả xanh, lá, thân, rễ và thân rễ của cây D pleiantha đều có chứa lignan gây độc gọi là podophyllotoxin, trong đó thân rễ của cây được coi là một bộ phận có độc tính cao nhất vì có chứa hàm lượng podophyllotoxin cao Biểu hiện ngộ độc D pleiantha là kích thích nhu động ruột, rối loạn hấp thu, buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, chậm mọc móng, suy yếu thần kinh, tê bì chân tay Liều gây tử vong trên người tính theo podophyllin ước tính là 350 mg [20]

Năm hoạt chất được tìm thấy trong thân rễ loài D versipellis là podophyllotoxin-4-

O-D-glucosid, podorhizol, podophyllotoxin, podophyllotoxon và 3′,4′-O,O- didemethylpodophyllotoxin đều gây ảnh hưởng đến chuyển hóa phenylalanin, chuyển hóa glycerolipid, chuyển hóa năng lượng, do đó gây ra hiện tượng stress, oxy hóa, quá trình chết tế bào, phản ứng viêm và tiêu hao năng lượng, cuối cùng dẫn đến tổn thương tế bào gan [21] Trong thử nghiệm độc tính cấp của loài D versipellis trên chuột cho thấy, tế bào cơ tim, tế bào gan, tế bào biểu mô ống thận bị phù nề, cấu trúc của màng tế bào và màng nhân tế bào thần kinh bị phá hủy [22]

1.1.5 Công dụng và một số bài thuốc trong YHCT của chi Podophyllum

D pleiantha là một trong những loại thuốc cổ truyền lâu đời nhất của Trung Quốc

Thân rễ D pleiantha đem cắt thành lát hoặc đập dập được ngâm với nước hoặc rượu để làm thuốc ở Đài Loan và Trung Quốc để điều trị rắn cắn, suy nhược, u bã đậu, bệnh nổi hạch, khối u, áp xe với liều lượng 3-60 g cao khô D pleiantha [17], [20] Ngoài ra, D pleiantha còn được sử dụng như một loại thuốc long đờm, thuốc giảm đau, chống co thắt, tác dụng an thần [14]

D versipellis có tác dụng tiêu đờm, giải độc, tiêu huyết ứ, tán kết, chủ yếu được dùng để điều trị ho, đau họng, đau bìu, nọc độc sưng tấy, rắn cắn, chấn thương do va đập và đau khớp, thấp khớp [21] và thường dùng trị mụn nhọt lở ngứa, tràng nhạc, sưng yết hầu [3]

1.1.5.2 Một số bài thuốc trong YHCT

Loài D versipellis được ứng dụng trong một số bài thuốc để điều trị ung thư vú, nhọt độc sưng tấy, tràng nhạc, rắn cắn Cụ thể:

Bài thuốc chữa u vú, nhọt độc sưng tấy: Thân rễ bát giác liên 15 g, Hoàng đỗ quyên

15 g, Tử bối thiên quỳ 30 g ngâm với 500 ml rượu trắng sau 7 ngày, mỗi lần uống 10-

15 ml, ngày 2-3 lần, kết hợp dùng ngoài xoa hoặc lá Bát giác liên giã nhỏ hơ nóng đắp vào nơi đau [3], [23]

Tổng quan về loài Podophyllum difforme

1.2.1 Vị trí phân loại của loài P difforme

Bát giác liên còn có tên gọi khác trong Tiếng Việt là: Pha mỏ (Tày), Độc cước liên, Quỷ cửu Tên khoa học là: Podophyllum difforme Hemsl & E H Wilson; tên đồng nghĩa là Dysosma difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang ex T S Ying,

Dysosma tonkinensis (Gagnepain) Hiroe, Podophyllum tonkinense Gagnepain; Podophyllum triangulum Handel-Mazzetti) thuộc chi Podophyllum, họ Hoàng liên gai

(Berberidaceae), bộ Hoàng liên (Ranunculales), lớp Ngọc lan (Magnoliosida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [1], [3]

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài P difforme

Cây thảo, sống lâu năm, chiều cao từ 15 cm đến 30 cm Thân rễ hình trụ, cứng, chia nhiều đốt, có nhiều rễ nhỏ hình sợi, nhiều xơ Phần trên mặt đất thẳng, một thân có một lá, có màu đỏ tía hoặc màu xanh lục, thân nhẵn, đường kính 0,5-1 cm Lá mọc xen kẽ so le, thường có 1-2 cái, phiến lá hình khiên chéo, kích thước khác nhau, phần lớn lá không phân thùy Nhánh trên cùng với 1 lá nên có dạng cuống dài Cuống lá khác nhau

9 về chiều dài, cuống nhẵn, dài 20-40 cm Mặt trên phiến lá có màu đỏ tía kích thước 5-

11 x 7-15 cm, phiến lá mỏng, cả hai bề mặt nhẵn, gốc lá thường tròn Mép lá rải rác có hoặc rất ít răng cưa Hoa mọc từ gần cuống lá, hình chóp thuôn dài (như đèn lồng) Cụm hoa từ 2-5 hoa, cuống dài 1-2 cm, rủ xuống, phủ một lớp lông trắng mỏng Cánh đài hình chữ nhật hoặc mũi mác, dài 2-2,5 cm x 2-5 mm, bên ngoài có lông, bên trong nhẵn, đỉnh nhọn Cánh hoa có màu đỏ tía nhạt hình chữ nhật, kích thước 4-5 x 0,8-1 cm, nhẵn, đầu tròn Nhị khoảng 2 cm, chỉ nhị 0,8 cm Bao phấn dài khoảng 1,2 cm Nhụy khoảng 0,9 cm Bầu hình nhạc, đầu nhụy có hình khiên Quả mọng hình cầu, dài 1,7-2,7 cm, khi chín có màu đen, trong chứa nhiều hạt Mùa hoa: tháng 3-6, mùa quả: tháng 6-10 [24], [1]

Hình 1.2.Cơ quan sinh dưỡng của cây Bát giác liên [25]

Chú thích: 1 Cây bát giác liên; 2 Thân rễ; 3 Mặt cắt ngang thân rễ.; 4 Cây non; 5 Lá; 6 Mép lá

Hình 1.3.Cơ quan sinh sản của cây Bát giác liên [25]

Chú thích: 1,2,3 Cụm hoa; 4 Ðài và tràng; 5 Bộ nhị; 6 Bộ nhụy; 7 Bộ nhụy cắt ngang;

1.2.3 Phân bố và sinh thái của loài P difforme

Loài P difforme phân bố rải rác ở một số tỉnh miền trung và nam Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam, Tứ Xuyên…) [1] Ở Việt Nam, P difforme phân bố ở một số tỉnh vùng núi phía bắc như: Cao Bằng, Bắc Kạn (Ba Bể), Hà

Nội (Ba Vì), Hòa Bình (Chợ Bờ), Lạng Sơn (núi Khau Cú) Bát giác liên là cây ưa ẩm và ưa sáng, mọc rải rác dưới tán rừng, bên khe suối, hốc đá Phần trên mặt đất lụi hằng năm vào mùa khô, vào tháng 3 từ phần thân rễ sẽ mọc lên 3 chồi là những thân giả mang lá sau 30-45 ngày, khi lá đạt đến độ trưởng thành cây bắt đầu ra hoa [2], [24] Thân rễ

11 có khả năng phân nhánh, sau mỗi năm, phần trên mặt đất tàn lụi, đồng thời tạo thành một “đốt củ” ở thân rễ Căn cứ vào số đốt củ trên trục chính của thân rễ, có thể ước tính được tuổi của cây

Bát giác liên là loại cây thuốc thuộc diện quý hiếm ở Việt Nam, cần được ưu tiên nghiên cứu bảo tồn [2]

1.2.4 Thành phần hóa học của loài P difforme

Theo Trung dược chí I (1993) và Trung dược từ hải I (1993) thân rễ Bát giác liên chứa khoảng 2-4% nhựa, chủ yếu là podophylotoxin (0,4-0,8%), picropodophylotoxin Ngoài ra còn có desoxypodophylotoxin, kaempferol và quercetin [2]

Jie Zhang (2014) cùng các cộng sự đã xác định được 05 hợp chất có hoạt tính sinh học từ thân rễ loài D diformis là: quercetin, kaempferol, rutin và quercitrin và podophyllotoxin [26]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Cao Thanh Mai (2014) đã mô tả được các đặc điểm thực vật và dự đoán mẫu nghiên cứu có thể là 1 trong 3 loài: D pleiantha (Hance) Woodson (P pleianthum Hance) hoặc D majoensis (Gagnepain) M Hiroe (P majoense Gagnepain) và D difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang ex T S Ying (P tonkinense Gagnepain) và sơ bộ xác định thành phần hóa học của thân rễ mẫu nghiên cứu có các nhóm: flavonoid, saponin, coumarin, glycosid tim, đường khử, trong đó nhiều nhất là flavonoid [27] Năm 2018, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã công bố 07 hợp chất từ P difforme là podophylotoxin, deoxypodophylotoxin, α-peltatin, quercetin, rutin, kaempferol và nicotiflorin [28]

Hình 1.4.Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên

1.2.5 Tác dụng sinh học và độc tính của loài P difforme

Các nghiên cứu khác tác dụng dược lý của loài P difforme còn hạn chế Một số nghiên cứu cho thấy, tác dụng nổi bật nhất của loài là ức chế tế bào ung thư

 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

13 Podophylotoxin phân lập từ P difforme có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như: tế bào ung thư bạch cầu cấp tính, tế bào adenocarcinoma, melanoma… [2]

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Dung (2018) cho thấy, α-peltatin được phân lập từ thân rễ loài P difforme có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư bạch cầu cấp (Jukat), bào ung thư tủy xương (K562), ung thư vú (MCF-7) và ung thư biểu mô miệng (KB) với giá trị IC50 lần lượt là 11,63; 5,51; 51,11; 8,88 và 7,36 ng/ml [25]

Hợp chất α-peltatin được phân lập từ thân rễ loài P difforme có tác dụng chống oxy húa (dọn gốc tự do DPPH và superoxyd) với giỏ trị IC50 là 0,47 àg/ml [25]

Các chất thuộc nhóm flavonoid như kaempferol và quercetin có trong loài P difforme có tác dụng giảm ho, lợi đờm trong viêm phế quản mạn tính [2]

Một số thành phần trong Bát giác liên (P difforme) gây kích thích tim ếch, làm tim ngừng đập ở thời kỳ tâm thu, làm giãn mạch máu tai thỏ, gây co bóp nhẹ với mách máu thận của thỏ, mạch máu chi sau của ếch Nhựa Bát giác liên có tác dụng gây nôn, tiêu chảy và gây tử vong cho mèo trên thực nghiệm Podophyllotoxin gây tiêu chảy nặng, đau bụng, đi ngoài ra máu, nghiêm trọng hơn có thể dẫn đến suy sụp kiệt sức Dùng bằng đường tiêm xuất hiện tác dụng kích thích thần kinh trung ương Do có độc tính lớn nên podophyllotoxin không được sử dụng trực tiếp trên lâm sàng Vì vậy, người ta đã cải tiến cấu trúc hóa học của podophyllotoxin, dùng các dẫn chất có độ độc thấp hơn và đã được ứng dụng trên lâm sàng trong điều trị một số bệnh ung thư [2]

1.2.6 Công dụng và các bài thuốc trong YHCT của loài P difforme

Bát giác liên có vị đắng, cay, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, hóa đờm, tán kết, khử ứ, tiêu thũng [2]

Trong y học cổ truyền, Bát giác liên được sử dụng khá phổ biến với các công dụng: lao thương, ho, hen, nôn ra máu, viêm họng, đau dạ dày, tràng nhạc, mụn nhọt, áp xe vết thương, rắn cắn, sưng tấy, mụn nhọt [2], [24] Liều dùng: 3-9 g sắc nước uống hằng

14 ngày hoặc chế thành hoàn tán Cây tươi giã nát đắp tại chỗ hoặc rễ mài lấy nước bôi Lưu ý, phụ nữ có thai không dùng được

Rễ bát giác liên nghiền thành bột, điều chế với giấm, đắp vào hạch sưng đau, hoặc dùng thân rễ 30 g sắc nước uống, còn bã đắp tại chỗ

Bát giác liên, hoàng đỗ quyên mỗi vị 15 g, tử bối kì 30 g ngâm trong 500 ml rượu trắng trong 7 ngày Mỗi ngày uống 2-3 lần, 10-15 ml/lần Dùng ngoài xoa.

Tổng quan giữa tác dụng chống ung thư và tác dụng chống viêm

Từ thế kỉ XIX, mối tương quan giữa chứng viêm và ung thư đã được tìm ra Những người có tình trạng viêm mãn tính dễ mắc một số loại ung thư như: ung thư vú, ung thư gan, ruột, bàng quang, tiết niệu, tuyến tiền liệt, niêm mạc dạ dày, buồng trứng và ung thư da Tình trạng viêm mạn gây ra sự biến đổi sinh lý và chiếm khoảng 15% tổng số ca ung thư trên toàn thế giới [29] Điển hình như viêm gan virus B, viêm gan virus C nếu không được điều trị và kiểm soát tốt có thể dẫn đến ung thư gan Tương tự một số tình trạng viêm như viêm thực quản, viêm tụy mãn tính, viêm túi mật… mãn tính lâu ngày cũng có thể dẫn niên ung thư thực quản, tuyến tụy và túi mật [30] Viêm mãn tính thường đặc trưng bởi tổn thương mô, sự tăng sinh của tế bào, tế bào lympho và đại thực bào tại ổ viêm được kích thích sản xuất ra các chất trung gian gây viêm như: ROS, cytokine, NF-kB, tăng hoạt tính COX-2 (tăng sinh PGE2)… dẫn đến ức chế quá trình chết của tế bào và kích thích tăng sinh tế bào [31]

Các bệnh ung thư liên quan đến virus papilloma ở người (HPV), đặc biệt là ung thư cổ tử cung nguyên nhân chính là kích thích trực tiếp bởi các gen gây ung thư của HPV Ngoài ra, những dạng ung thư này cũng có thể được kích thích gián tiếp bởi tình trạng viêm mãn tính do HPV gây ra Viêm mãn tính có liên quan đến tổn thương mô lặp đi lặp lại và phát triển các đột biến ở các gen ức chế khối u quan trọng do làm tăng sự biểu hiện của cyclooxygenase COX-2 và PGE2, (được cho là nguyên nhân chính gây ra tình trạng viêm do HPV) [32] Trong số các chất trung gian gây viêm, prostaglandin E2 (PGE2) hỗ trợ sự xâm lấn của khối u biểu mô bằng một số cơ chế, như: bao gồm thúc

15 đẩy tế bào ung thư tăng trưởng, thoát khỏi apoptosis, kích thích hoạt hóa các thụ thể của yếu tố tăng trưởng tyrosine kinase và tạo ra sự hình thành mạch Hơn nữa, PGE2 là một nhân tố quan trọng trong môi trường vi mô khối u, PGE2 giúp tế bào ung thư ngăn chặn và né tránh khả năng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tăng sự tiến triển của khối u[33] Trong khi các cytokine và chemokine tiền viêm điều chỉnh sự phát triển của ung thư, thì các bằng chứng mới đã chỉ ra rằng việc tăng sản xuất PGE2 thúc đẩy sự khởi đầu, tiến triển, xâm lấn, di căn và tái phát của ung thư đường tiêu hóa [34]

Sự biểu hiện quá mức của COX-2 liên quan việc tăng cường hình thành mạch và gây ung thư thông qua việc ức chế tế bào T, tế bào B, tăng sinh tế bào NK, tăng khả năng vận động và xâm lấn của khối u Như vậy có thể thấy viêm và ung thư có mối liên hệ chặt chẽ với nhau và bằng cách hạn chế tình trạng viêm mãn tính có thể kiểm soát ung thư ở một mức độ nào đó tốt hơn Một số nghiên cứu đã chứng minh sử dụng các thuốc NSAIDs (aspirin, celecoxib, diclofenac, diflunisal, naproxen, piroxicam…) trong viêm mạn tính giúp giảm tỉ lệ mặc bệnh lý ác tính và ung thư

Các chất đã được chứng minh vừa có tác dụng chống ung thư vừa có tác dụng chống viêm như: 8-anilinoimidazopyridine ức chế hoạt động của MEK kinase, chiết xuất sụn vi cá mập có tác dụng chống viêm, ức chế quá trình tạo mạch và hình thành khối u, kết hợp curcumin với một NSAIDS trong chế phẩm điều trị ung thư và viêm, các dẫn xuất imidazole có hoạt tính chống ung thư và ức chế cytokine trong viêm cột sống, viêm xương, viêm khớp… Một số hợp chất có nguồn gốc từ thực vật được chứng minh có hiệu quả trong việc ức chế tế bào ung thư thông qua ức chế quá trình viêm như: tinh bột nghệ (curcuma longa) kích thích đào thải các chất chuyển hóa gây viêm của oxy, berberin kiểm soát các gen chết theo chu trình Casp5 GADD45A tác dụng tốt trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt, apigenin (cam, hoa cúc, hành tây) kiểm soát protein pro- apototic tác dụng trên tế bào A549 và H1299, piperin ức chế surviving và p65 có tác dụng trên tế bào MDA-MB-231 và MDA-MB-468, quercetin tác dụng lên apotosis có tác dụng trên các dòng tế bào MCF-7, BT-20… [35]

Như vậy có thể thấy, viêm thường liên quan đến sự phát triển và tiến triển của bệnh ung thư Viêm bên ngoài khối u được gây ra bởi nhiều yếu tố, bao gồm nhiễm trùng do

16 vi khuẩn và virus, bệnh tự miễn, béo phì, hút thuốc lá, phơi nhiễm amiăng và uống quá nhiều rượu, tất cả đều làm tăng nguy cơ ung thư và kích thích tiến triển ác tính Ngược lại, tình trạng viêm do ung thư hoặc do ung thư gây ra có thể được kích hoạt bởi các đột biến khởi phát ung thư và có thể góp phần vào sự tiến triển ác tính thông qua việc tuyển dụng và kích hoạt các tế bào viêm Cả tình trạng viêm bên ngoài và bên trong đều có thể dẫn đến ức chế miễn dịch, do đó tạo nền tảng thuận lợi cho sự phát triển của khối u Các tế bào gây ra tình trạng viêm liên quan đến ung thư ổn định về mặt di truyền và hạn chế được tình trạng kháng thuốc; do đó, việc nghiên cứu các chế phẩm vừa có tác dụng chống viêm vừa có tác dụng chống ung thư là một chiến lược có nhiều hứa hẹn tốt cho việc phòng ngừa ung thư và điều trị ung thư trong tương lai [36]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thân rễ của loài Bát giác liên thu hái tại xã Quyết Tiến, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 7 năm 2022 (Hình 2.1) Ước tính tuổi cây từ 15-20 năm Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Podophyllum difforme Hemsl &

E H Wilson Tiêu bản thực vật Bát giác liên được lưu tại phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP), Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/18694/23 (Phụ lục 1)

Dược liệu tươi thu hái (Hình 2.1) được rửa sạch, thái phiến mỏng, sấy khô ở 45-50 o C, bảo quản trong túi nilon đến khi làm thực nghiệm a Toàn cây b Thân rễ

Hình 2.1.Mẫu bát giác liên nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất, dung môi và dòng tế bào

 Các dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập các hợp chất bao gồm: Ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dichloromethan

 Dung môi đo phổ: CDCl3 và DMSO-d 6

 Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% để phát hiện vết chất trên bản mỏng

 Silica gel pha thuận (silica gel 60; 0,040-0,063 mm; 230 - 400 mesh; Merck, Đức) và silica gel pha đảo YMC (30-50 mm; Fujisilisa Chemical Ltd., Nhật Bản)

 Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

 Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt), có bổ sung thêm L- glutamin, sodium piruvat, NaHCO3, penicillin/streptomycin, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), Trypsin-EDTA (0.05%); dung dịch đệm PBS

 Các hóa chất cơ bản khác: DMSO, TCA (acid trichloroacetic), Tris base, PBS (phosphate buffered saline), ellipticin, SRB (sulforhodamin B), acid acetic v.v

 Các dòng tế bào do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và

GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp: MDA-MB-231: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma); HepG2: Ung thư gan ở người (human hepatocellular carcinoma) và HL60: Ung thư bạch cầu cấp ở người (human leukemia)

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc

 Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích Statorius độ chính xác 0,001 g

 Bể đun cách thủy Memmert (Đức)

 Dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, ống đong, phễu thủy tinh…

 Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Swichzerland, Thụy Sỹ)

 Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ)

 Đèn soi tử ngoại hai bước song 254 nm và 365 nm

 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H- và 13 C-NMR) của hãng Bruker (Viện Hóa học, VAST)

 Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng ghép cao kết nối với 2 lần khối phổ LC-MS/MS và detector DAD

 Các trang thiết bị khác thuộc Viện Dược liệu, Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

 PGE2 assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)

 Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL);

 Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ);

 Tủ ấm CO2, Tủ lạnh sâu -80 o C, bình nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH và các dụng cụ thí nghiệm thông thường.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu để ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Nội dung 1: Chiết xuất cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ thân rễ loài Bát giác liên

 Nội dung 2: Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro của cao chiết toàn phần và cao phân đoạn từ thân rễ loài Bát giác liên

 Nội dung 3: Phân lập, đo phổ và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn được lựa chọn của thân rễ loài Bát giác liên

 Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ loài Bát giác liên Thiết kế nghiên cứu của luận văn được tóm tắt ở sơ đồ hình 2.2

Hình 2.2.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

03-05 hợp chất tinh khiết Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng trế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 in vitro củac các hợp chất phân lập được

1 Chiết nóng với EtOH 70% 3 lần, 3h/lần, tỉ lệ dm/dl: 6/1 (tt/kl)

2 Gộp dịch chiết, thu hồi dung môi

1 Phân tán cao vào nước và chiết lỏng – lỏng lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol

3 Thu hồi các dung môi dưới áp xuất giảm Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro của các phân đoạn

Phân lập bằng sắc kí cột

Xác định cấu trúc các hợp chất

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

Dược liệu Bát giác liên được chiết xuất với EtOH 70% bằng phương pháp chiết nóng sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần

Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần với tỉ lệ 1:1, v/v) thu được các phân đoạn tương ứng

Các hợp chất được phân lập bằng sắc ký cột pha thường và pha đảo Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và phát hiện các chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 365 nm và quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử

H2SO4 10% trong EtOH 96% rồi hơ nóng Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất bằng TLC với các hệ dung môi phù hợp [37]

2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều ( 1 H-, 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và NOESY) kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo

2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro

2.2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp – thử trên 02 dòng tế bào: MDA-MB-231 và HepG2

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan [38] và Monks [39]

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng SRB Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

 Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phự hợp với thớ nghiệm Tiến hành đưa 190 àL tế bào vào đĩa 96 giếng để thử nghiệm

 Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100% để có nồng độ ban đầu (stock) là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào (không có FBS) thành các dãy nồng độ từ cao xuống thấp

 Cỏc cao phõn đoạn thử trờn dóy nồng độ: 1; 3; 10; 30; 50 àg/ml

 BGL1 và BGL2 thử trờn dóy nồng độ: 0,8; 0,16; 0,032; 0,0064; 0,00128 àg/ml

 BGL4 và BGL5 thử trờn dóy nồng độ: 0,8; 4; 20; 100 àg/ml

 Chất thử đã pha loãng ở các nồng độ (10 L) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng đã chuẩn bị tế bào ở trên Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 L) + DMSO 1% (10 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng acid Trichloracetic – TCA 20%

 Ủ trong tủ ấm 72 giờ Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 o C, rửa 3 lần bằng acid acetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng

 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek)

2.2.3.2 Phương pháp MTT để xác định hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào đối với tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch – thử trên dòng tế bào HL60

Phương pháp này được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological

Methods năm 1983 [40] và Alley MC trên tạp chí Cancer research năm 1988 [41] Tác giả sử dụng muối tetrazolium (MTT - (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

 Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100% để có nồng độ ban đầu (stock) là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào

23 (không có FBS) thành các dãy nồng độ từ cao xuống thấp Tiến hành đưa 10 àL/giếng mẫu thử đó pha loóng vào cỏc giếng của đĩa thớ nghiệm

 Cỏc cao phõn đoạn thử trờn dóy nồng độ: 1; 3; 10; 30; 50 àg/ml

 BGL1 và BGL2 thử trờn dóy nồng độ: 0,8; 0,16; 0,032; 0,0064; 0,00128 àg/ml

 BGL4 và BGL5 thử trờn dóy nồng độ: 0,8; 4; 20; 100 àg/ml

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất cao tổng và các phân đoạn từ thân rễ Bát giác liên

4,5 kg thân rễ Bát giác liên sau khi sấy khô và xay nhỏ được chiết nóng với EtOH 70% ở nhiệt độ 65 o C (chiết 3 lần, trong 3 giờ, tỉ lệ dược liệu/ dung môi 1/10, 1/8 và 1/6 (kg/l)) Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết EtOH 70% (PDT, 855 g) Phân tán 535 g cao chiết EtOH 70% trong nước nóng và chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, tỉ lệ 1 :1) Dịch chiết các phân đoạn được gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao tương ứng: cao n-hexan (PDH, 7,4 g), cao EtOAc (PDE, 65,6 g), cao BuOH (PDB, 115,3 g) và cắn nước (PDW, 295,3 g)

Quá trình chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn được tóm tắt trong hình 3.1

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên trên một số dòng tế bào được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên trên các dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2

STT Tờn mẫu IC 50 (àg/ml)

Nhận xét: Các mẫu cao chiết phân đoạn từ thân rễ loài Bát giác liên đều thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển trên các dòng tế bào ung thư MDA-MB-231, HL60 và HepG2 với các mức độ khác nhau, trong đó cao chiết EtOAc (PDE) thể hiện tác dụng ức chế mạnh nhất với giỏ trị IC50 lần lượt là 5,90 ± 0,93 àg/ml (trờn dũng tến bào HL60), 6,93 ± 1,05 àg/ml (trờn dũng tến bào MDA-MB-231) và 8,68 ±1,13 àg/ml (trờn dũng tế bào HepG2) Các cao chiết còn lại (PDT, PDH và PDB) thể hiện tác dụng yếu hơn với IC50 nằm trong khoảng 12,70 - 19,06 àg/ml Ngoài ra, tỏc dụng ức chế cỏc dũng tế bào ung thư của các phân đoạn theo mức độ như sau: PDE > PDB > PDT > PDH Do đó, phân đoạn EtOAc được lựa chọn để phân lập các hợp chất.

Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn EtOAc của thân rễ Bát giác liên

Cao ethyl acetat (63,6 g) được phân tách bằng cột sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient dichloromethan - aceton (20:1 - 1:1, v/v) thu được 6 phân đoạn (E1 - E6) và hai hợp chất BGL1 (194,5 mg) và BGL3 (324,6 mg)

Phân đoạn E2 (24,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi dichloromethan - aceton (15:1 - 1:1, v/v) thu được 10 phân đoạn (E2.1 - E2.10) Phân đoạn E2.6 (5,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton - nước (6:4, v/v) thu được 2 hợp chất BGL2 (18 mg) và BGL4 (12 mg) Phân lập phân đoạn E2.7 (4,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton - nước (6:4, v/v) thu được hợp chất BGL5 (14 mg) Quá trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc ở sơ đồ hình 3.2

29 Quá trình phân lập các hơp chất được tóm tắt trong hình 3.2

Hình 3.2.Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ thân rễ Bát giác liên

Hình ảnh sắc kí của các hợp chất phân lập được ở đèn 254nm

Hình ảnh sắc kí của các hợp chất phân lập được sau khi phun H2SO4 10% ở đèn 365nm

Hình 3.3 Hình ảnh sắc kí đồ của các hợp chất phân lập được, trên bản mỏng pha đảo, hệ dung môi aceton:nước (7:3)

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Hợp chất BGL1 thu được dưới dạng bột màu trắng Phổ ESI-MS xuất hiện peak ion giả phân tử tại m/z 399,30 [M-H] - phù hợp với công thức phân tử C21H20O8 Phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) và phổ 13 C-NMR (150 MHz, CDCl3): xem bảng 3.2

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL1 và α -peltatin

5,93 (1H, d, 1,2) 5,94 (1H, d, 1,4) a) CDCl3, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) 500 MHz, e) 125 MHz

Phổ 1 H-NMR cho thấy sự có mặt của 6 proton thuộc về 2 nhóm methoxy tại δ H 3,78 (6H, s); 2 proton ghép cặp germinal thuộc về 1 nhóm methylenedioxy tại δ H 5,94 (1H, d, J = 1,2 Hz), 5,93 (1H, d, J = 1,2 Hz); 3 proton thơm tại δ H 6,23 (1H, s), 6,37 (2H, s) và các proton aliphatic nằm trong vùng δ H 2,450 ~ 4,59 bao gồm 2 nhóm methylen và 3 nhóm methin, gợi ý BGL1 có cấu trúc của một lignan nhóm aryltetralin Phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của 21 carbon, trong đó, tín hiệu tại δ C 175,2 cho biết cấu trúc BGL1 có một vòng lacton trong phân tử Cấu hình tại C-7ʹ và C-8ʹ được xác định là cis thông qua hằng số ghép cặp J 7ʹ,8ʹ = 3,6 Hz Bằng các suy đoán về phổ kết hợp với tham khảo tài liệu [8] và [46], BGL1 được kết luận là α -peltatin (Hình

Hình 3.4.Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL1

Hợp chất BGL2 thu được dưới dạng bột màu trắng.Phổ 1 H-NMR (600 MHz, CDCl3) và phổ 13 C-NMR (150 MHz, CDCl3): xem bảng 3.3

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL2 và podophyllotoxin

Vị trí BGL1 BGL2 Podophyllotoxin [28] a,b δ C a,b δ C a,c δ H a,d δ C a,e δ H

5,96 (1H, d, 1,0) a) CDCl3, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) 500 MHz, e) 125 MHz

Dữ liệu phổ NMR của BGL2 có sự tương đồng với BGL1, ngoại trừ sự vắng mặt của nhóm tín hiệu carbon aliphatic vùng δ C 26-33, thay vào đó các tín hiệu này đã bị dịch về trường thấp hơn δ C 72,4 (C-7) và δ C 40,6 (C-8) trong cấu trúc của BGL2, gợi ý vị trí C-7 có thể đã được gắn thêm nhóm hydroxy Bên cạnh đó, BGL2 xuất hiện thêm tín hiệu của proton thơm dưới dạng singlet tại δ H 7,12, điều đó cho thấy sự vắng mặt của

33 nhóm hydroxy gắn với vòng thơm tại C-2 Ngoài ra, BGL2 cũng xuất hiện thêm 1 nhóm methoxy (δ H 3,78, δ C 60,6) có độ chuyển dịch cao hơn 2 nhóm còn lại ở vị trí C-3ʹ và C- 5ʹ, gợi ý nhóm này liên kết với C-4ʹ Điều này cũng được chứng minh qua sự tương tác giữa proton δ H 3,78 với carbon 137,6 (C-4ʹ) trên phổ HMBC Từ các dữ liệu trên, kết hợp với tham khảo tài liệu [28], hợp chất BGL2 được xác định là podophyllotoxin

Hình 3.5.Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL2

Hợp chất BGL3 thu được dưới dạng bột màu vàng Phổ ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 285,15 [M-H] - và 287,00 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử C15H10O16 Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6) và phổ 13 C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6): xem bảng 3.4

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL3 và kaempferol

5-OH - 12,47 (1H, s) - 12,47 (1H, s) a) DMSO-d 6, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) 500 MHz, e) 125 MHz

Phổ 1 H-NMR của BGL3 xuất hiện cặp tín hiệu doublet tại δ H 6,18 (1H, d, J = 1,8 Hz) và 6,43 (1H, d, J = 1,8 Hz) đặc trưng cho proton H-6, H-8 của vòng thơm A của nhân flavonoid; cặp tín hiệu tại δ H 8,04 (2H, d, J = 9,0 Hz) và 6,92 (2H, d, J = 9,0 Hz) đặc trưng cho vòng B thế para Phổ 13 C-NMR của BGL3 cho 13 tín hiệu carbon, trong đó tín hiệu tại δ C 129,5 và 115,4 cao gấp đôi các tín hiệu còn lại, cho phép xác định có 2 cặp carbon đối xứng, gợi ý cấu trúc BGL3 là một flavonoid Dựa vào các dữ liệu phổ kết hợp tài liệu tham khảo [47], BGL3 được xác định là kaempferol (Hình 3.5)

Hình 3.6.Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL3

Hợp chất BGL4 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt Phổ ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 451,25 [M-H] - và 453,60 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử C26H28O7 Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6) và phổ 13 C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6): xem bảng 3.5

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL4 và 8,2′-diprenylquercetin 3-methyl ether

Vị trí BGL4 8,2′-Diprenylquercetin 3-methyl ether [48] a,b δ C a,c δ H d,e δ C d,f δ H

Vị trí BGL4 8,2′-Diprenylquercetin 3-methyl ether [48] a,b δ C a,c δ H d,e δ C d,f δ H

4ʹ-OH - 8,50 (1H, s) a) DMSO-d 6, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) CD3OD, e) 500 MHz, f) 125 MHz

Phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefinic tại δ H 4,97 (1H, t, J = 7,2 Hz) và 5,02 (1H, t, J = 7,2 Hz); 4 nhóm methyl tại δ H 1,27 (3H, s); 1,42 (3H, s); 1,45 (3H, s) và 1,55 (3H, s); 2 nhóm methylen tại δ H 3,22 (2H, d, J = 7,2 Hz) và 3,28 (2H, d, J = 7,2 Hz), gợi ý sự có mặt của 2 nhóm prenyl Ngoài ra, trên phổ 1 H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 1 nhóm methoxy tại δ H 3,56 (3H, s); 3 proton thơm trong đó có 1 tín hiệu dưới dạng singlet tại δ H 6,30 (1H, s) và 2 proton ở vị trí ortho tại δ H 6,74 (1H, d, J = 8,4 Hz) và 6,76 (1H, d, J = 8,4 Hz) và các tín hiệu của nhóm hydroxy tại δ H 12,59 (1H, s); 10,76 (1H, s); 9,83 (1H, s) và 8,50 (1H, s)

Phổ 13 C-NMR kết với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của 26 carbon, trong đó có 10 carbon (δ C 17,3 ; 17,2 ; 20,9 ; 25,2 ; 25,4 ; 25,5 ; 121,9 ; 122,8 ; 130,1 ; 130,8) thuộc 2 nhóm prenyl; 1 nhóm methoxy (δ C 59,8) và 15 carbon còn lại thuộc khung flavonoid với

Vị trí của nhóm methoxy được xác định tại C-3 thông qua tương tác HMBC giữa proton δ H 3,56 với carbon δ C 138,5 (C-3) Nhóm prenyl thứ nhất được xác định tại C-8 thông qua tương tác HMBC giữa proton H-1ʺ (δ H 3,22) với C-7 (δ C 161,3), C-8 (δ C

105,8), C-9 (δ C 154,2) và giữa proton H-6 (δ H 6,30) với C-5 (δ C 158,9), C-7, C-8 Vị trí của nhóm prenyl thứ 2 ở C-2ʹ cũng được xác định tương tự thông qua tương tác HMBC

37 giữa proton H-1‴ (δ H 3,28) với C-1ʹ (δ C 121,3), C-2ʹ (δ C 127,7), C-3ʹ (δ C 143,1) và giữa proton H-6ʹ (δ H 6,74) với C-2 (δ C 159,4), C-2ʹ (δ C 127,7), C-4ʹ (δ C 146,9)

Từ các dữ liệu trên kết hợp với tài liệu [48], có thể kết luận BGL4 là 8,2′- diprenylquercetin 3-methyl ether (Hình 3.6)

Hình 3.7.Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính (→) của hợp chất BGL4

Hợp chất BGL5 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt Phổ ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 667,25 [M-H] - và 669,50 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử

C36H28O13 Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6) và phổ 13 C-NMR (150 MHz, DMSO- d 6): xem bảng 3.6

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL5 và dysoverin D

4*ʹ-OH - 9,82 (1H, s) - 9,81 (1H, s) a) DMSO-d 6, b) 600 MHz, c) 150 MHz, # tín hiệu bị chồng chập

Phổ 1 H-NMR của BGL5 cũng xuất hiện các tín hiệu tương tự như BGL4 với các tín hiệu của proton hydroxy phenolic tại δ H 12,55, 10,85 và 8,88; 2 proton ở vị trí ortho [δ H

7,09 (1H, d, J = 8,4 Hz) và 7,14 (1H, d, J = 8,4 Hz)]; các tín hiệu thuộc nhóm prenyl [δ H

3,10 (1H, d, J = 9,6 Hz), 3,32 (1H), 4,95 (1H, brs), 1,25 (3H, s) và 1,37 (3H, s)] và 2 proton ở vị trí meta tại δ H 6,22 (1H, d, J = 1,8 Hz), 6,34 (1H, d, J = 1,8 Hz), gợi ý một phần cấu trúc tương tự như podoverin A [49] Tín hiệu của 2 proton cũng ở vị trí meta tại δ H 5,97 (1H, d, J = 2,4 Hz), 5,98 (1H, d, J = 2,4 Hz) và 2 cặp tín hiệu của hệ AAʹBBʹ tại δ H 7,48 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,76 (2H, d, J = 8,4 Hz), gợi ý 1 phần cấu trúc tương tự như kaempferol (BGL3) Các dữ liệu trên phổ proton cho thấy BGL5 là 1 dimer flavonoid

Phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của 36 carbon cũng cho thấy,

BGL5 là 1 dimer flavonoid Tín hiệu tại δ C 99,9 (C-2*) và 90,3 (C-3*) chuyển dịch về trường cao hơn so với các carbon tương ứng của kaempferol [δ C 146,8 (C-2), 135,6 (C- 3)], gợi ý dimer flavonoid này được tạo thành thông qua liên kết dioxan giữa vòng C của kaempferol và vòng B của podoverin A, cụ thể là sự liên kết của C-3ʹ-C-3*/ C-4ʹ- C-2*

Từ các dữ liệu phổ thu được, kết hợp với tài liệu [49] có thể xác định BGL5 là dysoverin D (Hình 3.7)

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL5

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2 được trình bày ở bảng 3.7 - 3.9

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào MDA-MB-231

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào HL60

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml)

Nhận xét: Các hợp chất phân lập được từ phân đoạn EtOAc của thân rễ loài Bát giác liờn khi được thử nghiệm với hai dải nồng độ 0,8; 0,16; 0,032; 0,0064 và 0,00128 àg/ml (đối với BGL1 và BGL2) và 100; 20; 4; 0,8 àg/ml (đối với BGL4 và BGL5) đó ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư (MDA-MB-231, HL60 và HepG2) ở các mức độ khác nhau, khả năng ức chế tăng dần theo chiều tăng nồng độ, nghĩa là càng tăng nồng độ thì khả năng ức chế càng tăng Khả năng ức chế 3 dòng tế bào ung thư của 4 hợp chất được xếp theo thứ tự giảm dần là: BGL1 > BGL2 > BGL4 > BGL5 Cụ thể như sau:

- Hợp chất BGL1 và BGL2 thể hiện hoạt tính rất mạnh trên cả 3 dòng tế bào nghiên cứu (MDA-MB-231, HL60 và HepG2) với giá trị IC50 lần lượt là 0,0023 ± 0,0002; 0,0013 ± 0,0001 và 0,0017 ± 0,0001 àg/ml (đối với hợp chất BGL1) và 0,092 ± 0,009; 0,0035 ± 0,0002 và 0,0059 ± 0,0004 àg/ml (đối với hợp chất BGL2), và mạnh hơn so với chất đối chứng dương ellipticin (giá trị IC50 lần lượt là 0,47 ± 0,02; 0,30 ± 0,02 và 0,35 ± 0,01 àg/ml)

- Hợp chất BGL4 và BGL5 cũng thể hiện hoạt tính trên cả 3 dòng tế bào nghiên cứu (MDA-MB-231, HL60 và HepG2) với giá trị IC50 lần lượt là 7,86 ± 0,43; 1,68 ± 0,06;

43 2,14 ± 0,05 àg/ml (đối với BGL4) và 12,30 ± 0,68; 1,86 ± 0,11; 6,41 ± 0,14 àg/ml (đối với BGL5) Như vậy, có thể thấy, hai hợp chất BGL4 và BGL5 thể hiện tác dụng yếu hơn trên dòng tế bào MDA-MB-231.

Kết quả đánh giá tác dụng ức chế sản sinh PGE2 in vitro của các hợp chất phân lập được

3.6.1 Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được đến khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7

Hai hợp chất tinh khiết (BGL1 và BGL2) được phân lập từ phân đoạn EtOAc của thân rễ loài Bát giác liên được đánh giá mức độ ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 theo phương phỏp MTT, với liều thử nghiệm là 3 àM Kết quả thể hiện ở hình 3.8

Hình 3.9.Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được lên khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 Nhận xột: Kết quả cho thấy, cỏc hợp chất BGL1 và BGL2 ở nồng độ 3 àM hầu như không làm ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào RAW 264.7 (tỉ lệ sống sót của tế bào đều trên 80%) Như vậy, nồng độ 3 μM đối với các hợp chất tinh khiết BGL1 và BGL2 là an toàn để thực hiện các thí nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 in vitro trên tế bào RAW 264.7

DMSO LPS 5 ng/ml LPS+ BGL1 LPS+ BGL2

Tỷ lệ sống sót của tế bào RAW 264.7

3.6.2 Kết quả đánh giá mức độ ức chế sản sinh PGE2 của các hợp chất tinh khiết

Kết quả đánh giá mức độ ức chế sản sinh PGE2 của các hợp chất phân lập được từ thân rễ Bát giác liên được trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 của hợp chất BGL1 và BGL2

Tờn mẫu Nồng độ (àM)

Tên mẫu Nồng độ (nM)

- Hai hợp chất phân lập được từ phân đoạn EtOAc của thân rễ loài Bát giác liên khi được thử nghiệm với nồng độ 0,1; 0,3; 1 và 3 àM đó ức chế sự sản sinh PGE2 trờn tế bào RAW 264.7 ở các mức độ khác nhau, khả năng ức chế tăng dần theo chiều tăng nồng độ, nghĩa là càng tăng nồng độ thì khả năng ức chế càng tăng

- Hợp chất BGL1 (IC50 là 1,58 ± 0,18 àM) thể hiện hoạt tớnh ức chế sản sinh PGE2 mạnh hơn BGL2 (IC50 là 3,52 ± 0,28àM)

Bát giác liên có tên khoa học là Podophyllum difforme Hemsl & E H Wilson thuộc chi Podophyllum thuộc họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) [1], [3] Loài P difforme phân bố đặc hữu ở Trung Quốc và Việt Nam Ở Việt Nam, Bát giác liên (P difforme) là loại cây thuốc thuộc diện quý hiếm, cần được ưu tiên nghiên cứu bảo tồn [2] Bát giác liên đã được sử dụng để chữa các bệnh như lao thương, ho, hen, nôn ra máu, viêm họng, đau dạ dày, tràng nhạc, mụn nhọt, áp xe vết thương, rắn cắn, sưng tấy, mụn nhọt… [2], [24] Theo các nghiên cứu trước đó, Bát giác liên chứa các nhóm chất lignan, flavonoid, saponin [26], [27], [28] Tuy nhiên, cho đến thời điểm hiện tại, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của loài P difforme còn rất hạn chế Do vậy, với mục tiêu phân lập từ 05 hợp chất từ thân rễ loài P difforme và đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 in vitro của các cao chiết và các hợp chất phân lập được, luận văn góp phần làm sáng tỏ giá trị sử dụng và làm giàu thêm tri thức khoa học về loài cây này, đồng thời đóng góp cung cấp thêm cơ sở dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu về loài P difforme trong tương lai.

Về kết quả phân lập 05 hợp chất từ cao EtOAc của thân rễ Bát giác liên

4.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên

Trong nghiên cứu này, các hợp chất được phân lập theo định hướng tác dụng sinh học ức chế tế bào ung thư, nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào đơn lớp của Skekan và phương pháp nuôi cấy tế bào dạng hỗn dịch của Tim Mosmann, dùng elliptcin và doxorubicin làm chất đối chứng dương Đây là mô hình có độ tin cậy cao, được ứng dụng để sàng lọc dược liệu cũng như các hợp chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro, phân đoạn EtOAc thể hiện tác dụng mạnh nhất với giá trị IC50 trên 3 dòng tế bào ung thư MDA-MB-231, HL60 và HepG2 lần lượt là 6,93 ± 1,05; 5,90 ± 0,93 và 8,68 ± 1,13 àg/ml Ngoài ra, cỏc chiết cũn lại bao gồm cao ethanol 70%, cao n-hexan và cao BuOH cũng thể hiện hoạt tính tốt trên các dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2 với giá trị IC50 ≤ 20 μg/ml Kết quả này làm sáng tỏ giá trị sử dụng của Bát giác liên theo góc nhìn của khoa học hiện đại và góp phần khẳng định Bát giác liên là một dược liệu quý, có thể được lựa chọn là đối tượng cho các nghiên cứu về đánh giá tác dụng liên quan đến ung thư trong tương lai

46 Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Dung và cộng sự (2018) [28] cũng cho thấy, Bát giác liên là dược liệu giàu flavonoid và lignan - một nguồn chống ung thư tiềm năng [50], [51], [52], [53] Các nhóm chất này tập trung chủ yếu ở cao EtOAc Điều đó có thể giải thích phần nào tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh của cao chiết này so với các cao chiết còn lại Do đó, cao EtOAc đựa lựa chọn để phân lập các hợp chất So với các nghiên cứu trước đây, nghiên cứu này tiếp cận theo hướng định hướng tác dụng sinh học thường cho hiệu quả và xác suất thành công cao hơn so với quá trình phân lập và sàng lọc tác dụng ngẫu nhiên, không dựa trên mục tiêu cụ thể

4.1.2 Về kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Bằng phương pháp sắc ký cột pha thường và pha đảo RP-18 kết hợp với TLC, 05 hợp chất đã được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat Cấu trúc của các hợp chất được xác định dựa trên các dữ liệu phổ, bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1D- và 2D- NMR), phổ khối (ESI-MS) và so sánh với tài liệu tham khảo Các hợp chất được xác định là: α-peltatin (BGL1), podophyllotoxin (BGL2), kaempferol (BGL3), 8,2ʹ- diprenylquercetin-3-methyl ether (BGL4) và dysoverin D (BGL5) Trong đó, hợp chất

BGL1 và BGL2 thuộc nhóm lignan, 3 hợp chất còn lại (BGL3 - BGL5) thuộc nhóm flavonoid Kết quả này góp phần khẳng định flavonoid và lignan là những thành phần hóa học chính trong loài Bát giác liên (P difforme) nói riêng và chi Podophyllum nói chung Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về thành phần hóa học của Bát giác liên trong và ngoài nước So với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Dung [28] về loài Bát giác liên thu hái tại Sapa thì nghiên cứu của chúng tôi về loài Bát giác liên thu hái tại

Hà Giang cũng thu được 03 hợp chất: α-peltatin, podophyllotoxin và kaempferol Điểm khác biệt ở nghiên cứu này là lần đầu phân lập được 02 hợp chất là 8,2ʹ- diprenylquercetin-3-methyl ether và podoverin D từ thân rễ loài Bát giác liên Vì vậy đây là đóng góp mới của đề tài, góp phần cung cấp thêm tri thức mới về thành phần hóa học của loài Bát giác liên P difforme, đồng thời cũng gợi ý rằng thân rễ là bộ phận có giá trị sử dụng tốt nhất của Bát giác liên

Các hợp chất BGL1 và BGL2 thuộc nhóm lignan là một trong những nhóm chính của chi Podophyllum Trong các báo cáo trước đây, hai hợp chất này cũng được tìm thấy trong một số loài thuộc chi Podophyllum, như: P peltatum [54], [55], D versipellis [8],

P emodi [56], P hexandrum [57] Ngoài ra, hai hợp chất này còn được tìm thấy trong

47 loài Linum mucronatum [58], Sinopodophylli Fructus [59] Đây là hai hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh α-Peltatin và podophyllotoxin được chứng minh có tác dụng trên tế bào lymphosarcoma 1, lymphosarcoma 2, ung thư biểu mô tuyến vú, ung thư da (melanoma S-91) [60] Bên cạnh đó, α-peltatin còn có tác dụng tốt trên các dòng tế bào A549, Jukat, K562, MCF-7 và KB [25], dẫn xuất glucosid của podophyllotoxin có tác dụng gây độc tế bào với 5 dòng tế bào ung thư HL60, SMMC-7721, A-549, MCF-7 và SW480 [61], [62] Ngoài tác dụng gây độc tế bào ung thư, α-peltatin và podophyllotoxin còn có tác dụng kháng virus Sindbis, murine cytomegalovirus (MCMV) [63], bảo vệ tế bào gan [64] Podophyllotoxin được sử dụng trong điều trị mụn cóc sinh dục [65], [66]

Ba hợp chất BGL3 - BGL5 thuộc nhóm flavonoid Cùng với lignan, flavonoid là nhóm chất chính được tìm thấy trong chi Podophyllum [6] BGL3 được tìm thấy trong các loài D pleiantha [67], P emodi [68], D versipellis [8], [13], P hexandrum [69] Các nghiên cứu gần đây cho thấy, kaempferol có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như: ung thư tuyến tụy [70], ung thư vú MDA-MB-231 [71], [72],[73], ung thư tuyến tiền liệt và bàng quang [74], ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày [75], ung thư gan HepG2 [76], [77], ung thư buồng trứng A2780 [78], ung thư bạch cầu HL60 [79], [80]…., ngoài ra kaempferol còn có tác dụng chống viêm trong tế bào mô ruột [81], viêm dây thần kinh [82], [83], viêm đường thở do hen suyễn [84], chống loãng xương [85], giảm nguy vơ xơ vữa động mạch [86], bảo vệ tế bào gan, giảm tổn thương gan [84],[87], giảm tình trạng xơ hóa gan [88], [89]… 8,2’-Diprenylquercetin-3-methyl ether (BGL4) được tìm thấy trong loài Sinopodophyllum hexandrum [90] và có tác dụng nổi bật trong ức chế tế bào ung thư vú [90], [91] Dysoverin D (BGL5) được tìm thấy trong loài D versipellis [8], [49] và chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của hợp chất này.

Về kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 của các hợp chất phân lập từ thân rễ Bát giác liên

4.2.1 Kết quả ức chế tế bào ung thư

Dựa trên các nghiên cứu trước đây về tác dụng chống thư của các hợp chất đã phân lập, nhóm nghiên cứu lựa chọn 04 hợp chất α-peltatin, podophyllotoxin, 8,2ʹ- diprenylquercetin-3-methyl ether và dysoverin D để đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro trên 03 dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2 Kết quả cho thấy, cả

04 hợp chất đều có hoạt tính trên 03 dòng tế bào ung thư, trong đó α-peltatin (BGL1) và podophyllotoxin (BGL2) thể hiện tác dụng rất mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0,0023 ± 0,0002; 0,0013 ± 0,0001 và 0,0017 ± 0,0001 àg/ml (BGL1) và 0,092 ± 0,009; 0,0035 ± 0,0002 và 0,0059 ± 0,0004 àg/ml so với chất đối chứng dương ellipticin (lần lượt là 0,47 ± 0,02; 0,30 ± 0,02 và 0,35 ± 0,01 àg/ml) Kết quả của nghiờn cứu cho thấy BGL1 và BGL2 tác dụng tốt trên 03 dòng tế bào ung thư vú di căn, ung thư bạch cầu và ung thư gan ở người, đặc biệt giá trị IC50 rất thấp, mạnh hơn cả chứng dương chứng tỏ 02 hợp chất có tác dụng rất mạnh và rất đáng quan tâm Các dẫn chất của podophylotoxin được sử dụng để tổng hợp nên các etoposide và teniposid dùng điều trị các bệnh ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư tinh hoàn, bệnh bạch cầu, u lympho … với kết quả này đề tài đã cung cấp thêm thêm tri thức khoa học về 02 hợp chất BGL1 và BGL2 được phân lập từ loài P difforme có tác dụng tốt trên các dòng MDA-MB-231, HL60 và HepG2, khẳng định đây là nguồn dược liệu quý cung cấp podophylotoxin từ tự nhiên cho việc nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thư từ dẫn xuất podophylotoxin tự nhiên trong tương lai

4.2.2 Kết quả ức chế sản sinh PGE2

Viêm được đánh giá là dấu hiệu đặc trưng của bệnh ung thư và hiện nay người ta đã công nhận rộng rãi rằng có sự tồn tại mối liên hệ trực tiếp giữa viêm và khối u Trong số các chất trung gian gây viêm, prostaglandin E2 (PGE2), sản phẩm chính của cyclooxygenase (COX), đóng vai trò then chốt trong sự tiến triển của khối u Nhiều bằng chứng cho thấy các loại thuốc như aspirin và thuốc chống viêm không steroid (NSAID) ức chế sản xuất PGE2, có thể có tác dụng bảo vệ chống lại sự hình thành khối u và có thể đóng vai trò trong quá trình phát triển khối u Trên thực tế, một số nghiên cứu cho thấy, PGE2 làm tăng sự phát triển và xâm lấn của khối u, giảm quá trình chết theo chương trình, tăng sự di căn và hình thành mạch, đồng thời ngăn chặn khả năng miễn dịch chống ung thư [33] Do đó, trong nghiên cứu này, đề tài đã đánh giá tác dụng ức chế sản sinh PGE2 của 2 hợp chất α-peltatin và podophyllotoxin

PGE2 là protanoid được tạo ra từ quá trình oxy hóa của acid béo thiết yếu (có chứa

20 carbon có trong màng phospholipid) PGE2 cùng với 4 prostanoid khác (PGF2α, PGD2, PGI2 và thromboxan A2) được tạo ra từ PGH2từ con đường chuyển hóa acid arachidonic bằng cyclooxygenase (COX) [92], [93] Trong giai đoạn đầu của phản ứng

49 viêm, PGE2 và các chất có liên quan đến protanoid như PGI2, hoạt động giống như chất giãn mạch tạo điều kiện cho dòng mô bạch cầu trung tính, đại thực bào và tế bào mast từ máu dẫn đến sưng và phù ở vị trí nhiễm trùng hoặc mô bị tổn thương Ngoài ra, PGE2 còn tác động kích thích các dây thần kinh cảm giác làm tăng phản ứng đau và tác động lên các tế bào thần kinh ở khu vực trước giao thoa thị giác để thúc đẩy tác dụng gây sốt [94] Như vậy, PGE2 đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành phản ứng viêm, từ đó ức chế sản xuất PGE2 có thể làm giảm khả năng gây viêm cũng như các triệu chứng của viêm như: sưng, nóng, sốt Do PGE2 có bản chất là protein nên có thể được định tính và định lượng dựa trên nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể

Kết quả thử nghiệm cho thấy cả 02 hợp chất đều có tác dụng ức chế sự sản sinh PGE2 trên tế bào RAW 264.7 ở các mức độ khác nhau, khả năng ức chế tăng dần theo chiều tăng nồng độ, nghĩa là càng tăng nồng độ thì khả năng ức chế càng tăng và α-peltatin thể hiện tác dụng ức chế sản sinh PGE2 mạnh hơn podophyllotoxin Cụ thể, α-peltatin ức chế sản sinh PGE2 với giỏ trị IC50 là 1,58 ± 0,18 àM mà khụng làm ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 Hợp chất podophyllotoxin cũng thể hiện hoạt tớnh ức chế sản sinh PGE2 với giỏ trị IC50 là 3,52 ± 0,28 àM Như vậy, kết quả thử nghiệm này cho thấy sự phù hợp với kinh nghiệm sử dụng Bát giác liên trong dân gian dùng trong các trường hợp: lao, ho, hen, viêm họng, đau dạ dày, mụn nhọt, áp xe vết thương, rắn cắn, sưng tấy Đồng thời góp phần cung cấp thêm thông tin khoa học về tác dụng chống viêm của Bát giác liên Hiện nay, tình trạng kháng thuốc điều trị ung thư ngày càng tăng, thì mục tiêu điều trị ung thư với hướng tiếp cận từ tác dụng ức chế phản ứng viêm được xem là một biện pháp có tiềm năng lớn vì các tế bào gây ra tình trạng viêm liên quan đến ung thư ổn định về mặt di truyền và hạn chế được tình trạng kháng thuốc Do đó, kết quả nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm thông tin hữu ích cho các nghiên cứu định hướng phát triển nghiên cứu các thuốc có tác dụng điều trị cả viêm và ung thư trong tương lai

Bên cạnh đó, trong số 05 hợp chất phân lập được, BGL1 (α-peltatin) là một lignan vừa có hàm lượng lớn, vừa có tác dụng gây độc tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 tốt Do đó, hợp chất này có thể đưa vào nghiên cứu làm chất đánh dấu trong các nghiên

50 cứu về tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu và các sản phẩm từ Bát giác liên trong tương lai