đỗ thị thu phân lập đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh pge2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ loài bát giác liên podophyllum difforme hemsl e h wilson họ hoàng liên gai b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THU PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ VÀ ỨC CHẾ SẢN SINH PGE2 IN VITRO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THU

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ

BÀO UNG THƯ VÀ ỨC CHẾ SẢN SINH PGE2 IN

VITRO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC

TỪ THÂN RỄ LOÀI BÁT GIÁC LIÊN

(Podophyllum difforme Hemsl & E.H.Wilson),

HỌ HOÀNG LIÊN GAI (Berberidaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THU

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ

BÀO UNG THƯ VÀ ỨC CHẾ SẢN SINH PGE2 IN

VITRO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC

TỪ THÂN RỄ LOÀI BÁT GIÁC LIÊN

(Podophyllum difforme Hemsl & E.H.Wilson),

HỌ HOÀNG LIÊN GAI (Berberidaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Đỗ Thị Hà

2 PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn

HÀ NỘI 2023

Nơi thực hiện đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

Viện Dược liệu

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các Thầy Cô, các nhà khoa học của Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Dược liệu, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị

Hà và PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn, những người Thầy đã luôn dành thời gian, tâm

huyết hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Thị Thu, ThS Nguyễn Trà My cùng các anh chị tại Khoa Hóa Phân tích – Viện Dược liệu, các Thầy Cô và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dược liệu, Thực vật, Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Nghiên cứu này là một phần kết quả của đề tài được tài trợ kinh phí từ nhiệm vụ khoa học công nghệ theo Nghị định thư Việt Nam với Hàn Quốc do Bộ KH&CN cấp kinh

phí: “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch của một số cây

thuốc Việt Nam, mã số: NĐT.85.KR/20”

Lời sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2023

Học viên

Đỗ Thị Thu

1.1 Tổng quan về chi Podophyllum 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Podophyllum 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Podophyllum 3

1.1.3 Thành phần hóa học của chi Podophyllum 4

1.1.4 Tác dụng sinh học và độc tính của chi Podophyllum 5

1.1.5 Công dụng và một số bài thuốc trong YHCT của chi Podophyllum 7

1.2 Tổng quan về loài Podophyllum difforme 8

1.2.1 Vị trí phân loại của loài P difforme 8

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài P difforme 8

1.2.3 Phân bố và sinh thái của loài P difforme 10

1.2.4 Thành phần hóa học của loài P difforme 11

1.2.5 Tác dụng sinh học và độc tính của loài P difforme 12

1.2.6 Công dụng và các bài thuốc trong YHCT của loài P difforme 13

1.3 Tổng quan giữa tác dụng chống ung thư và tác dụng chống viêm 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Hóa chất, dung môi và dòng tế bào 17

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc 18

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 21

2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro 21

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 in vitro 23

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 Kết quả chiết xuất cao tổng và các phân đoạn từ thân rễ Bát giác liên 26

3.2 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên 27

3.3 Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn EtOAc của thân rễ Bát giác liên 28

3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 30

4.1 Về kết quả phân lập 05 hợp chất từ cao EtOAc của thân rễ Bát giác liên 45

4.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên 45

4.1.2 Về kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 46

4.2 Về kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 của các hợp chất phân lập từ thân rễ Bát giác liên 47

4.2.1 Kết quả ức chế tế bào ung thư 47

4.2.2 Kết quả ức chế sản sinh PGE2 48

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ

breast cancer

Ung thư vú người dạng di căn

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các hợp chất lignan trong một số loài Podophyllum 5

Hình 1.2 Cơ quan sinh dưỡng của cây Bát giác liên [26] 9

Hình 1.3 Cơ quan sinh sản của cây Bát giác liên [26] 10

Hình 1.4 Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên 12

Hình 2.1 Mẫu bát giác liên nghiên cứu 17

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20

Hình 3.1 Tóm tắt quá trình chiết xuất các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên 27

Hình 3.2 Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ thân rễ Bát giác liên 29

Hình 3.3 Hình ảnh sắc kí đồ của các hợp chất phân lập được, trên bản mỏng pha đảo, hệ dung môi aceton: nước (7:3) ……….… 29

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL1 31

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL2 33

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL3 34

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính (→) của hợp chất BGL4 37 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất BGL5 40

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được lên khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 43

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các cao chiết từ

thân rễ Bát giác liên trên các dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2 28

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL1 và α-peltatin 30

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL2 và podophyllotoxin 32

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL3 và kaempferol 33

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL4 và 8,2′-diprenylquercetin 3-methyl ether 35

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL5 và dysoverin D 37

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào MDA-MB-231 41

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào HL60 41

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất trên dòng tế bào HepG2 42

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 của hợp chất BGL1 và BGL2 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vẫn luôn là mối quan tâm hàng đầu trên toàn thế giới Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2020 tình hình mắc ung thư trên thế giới đều có xu hướng tăng Tại Việt Nam, ước tính cứ 100000 người thì có 159 người chẩn đoán mắc mới ung thư và 106 người tử vong do ung thư Các loại ung thư phổ biến gồm ung thư vú, phổi, đại trực tràng, dạ dày và gan Năm 2020, Việt Nam xếp thứ 91/185 về tỷ suất mắc mới và thứ 50/185 về tỷ suất tử vong trên 100.000 người Thứ hạng này tương ứng của năm 2018 là 99/185 và 56/185 Như vậy, có thể thấy là tình hình mắc mới và tử vong do ung thư ở Việt Nam đều đang tăng nhanh Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới có tác dụng điều trị ung thư là cấp thiết, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược và các hợp chất thiên nhiên đang là xu hướng của ngành công nghiệp dược phẩm

Bát giác liên có tên khoa học là Podophyllum difforme Hemsl & E.H.Wilson, thuộc chi Podophyllum, họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) [1] Tại Việt Nam, Bát giác liên

phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi phía bắc như: Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Kạn [2] Bát giác liên có công dụng thanh nhiệt giải độc, hóa đàm tán kết Ở Việt Nam, dược liệu này được sử dụng chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian, dùng để điều trị các chứng viêm như: nhọt độc sưng tấy, tràng nhạc, rắn cắn, lao thương, ho hen, nôn ra máu, ung thư… [2] Tuy nhiên, cho đến thời điểm hiện tại các nghiên cứu về loài này còn khá hạn chế Ở Việt Nam, chỉ có một số nghiên cứu của tác giả Cao Thanh Mai (2014) về đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và định tính sơ bộ thành phần hóa học của thân rễ Bát giác liên và nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Dung và Man Thanh Long (2018) về phân lập hợp chất từ thân rễ Bát giác liên, đánh giá tác dụng chống oxy hóa và kháng

ung thư in vitro của loài này Do vậy, để cung cấp thêm tri thức và cơ sở khoa học góp

phần định hướng các nghiên cứu trong tương lai của Bát giác liên, đề tài: “Phân lập,

đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và ức chế sản sinh PGE2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ loài Bát giác liên (Podophyllum difforme Hemsl & E.H.Wilson), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)” đã được thực hiện, với các mục

tiêu:

1 Phân lập và xác định được cấu trúc 05 hợp chất từ phân đoạn được lựa chọn

dựa trên sàng lọc hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro của

thân rễ loài Bát giác liên 2 Đánh giá được hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư và ức chế sản

sinh PGE2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ Bát giác liên

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Podophyllum

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Podophyllum

Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, chi Podophyllum thuộc [3]:

Giới thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta Lớp Ngọc lan: Magnoliosida Bộ Hoàng liên: Ranunculales Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae

Chi: Podophyllum Tuy nhiên: Theo Shaw, chi Dysosma được xếp vào chi Podophyllum Nên theo nhiều tài liệu, một số loài thuộc chi Dysosma cũng được sắp xếp thuộc chi Podophyllum [1]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Podophyllum

Cây thảo, sống lâu năm Thân rễ bò, có nhiều mấu, nhiều rễ con dạng sợi Thân cây (phần trên mặt đất) mọc thẳng, có lá bắc lớn bao quanh gốc Lá hình khiên, chia 3-9 thùy Hoa mọc thành cụm hoặc thành chùm tán Lá đài 6, chia vách Tràng hoa 6, màu đỏ tía Bao phấn dài, hướng trong, tự khai Nhụy hoa đơn độc; bầu 1 ô; nhiều lá noãn; đầu nhụy hình cầu Quả mọng màu đỏ hoặc đỏ tía Hạt nhiều, phần thịt quả ít [1]

Chi Podophyllum có 32 loài [4], trong đó có khoảng 10 loài được tìm thấy ở Trung

Quốc và Việt Nam, trong đó có 7 loài phổ biến ở Trung Quốc (được phân vào chi

Dysosma) và 3 loài (được phân vào chi Podophyllum) [1]

Bảy loài phổ biến bao gồm:

Ba loài hiếm gặp bao gồm:

 Podophyllum glaucescens J M H Shaw

Và một loài Dysosma villosa mới được phát hiện năm 2019 tại Tây Nam, Trung Quốc

[5]

1.1.3 Thành phần hóa học của chi Podophyllum

Thành phần hóa học của chi Dysosma nói riêng và chi Podophyllum nói chung có thể

chia thành 2 nhóm là: lignan và flavonoid Tác dụng chữa bệnh chủ yếu do podophyllin quy định và có thể thu được podophyllin bằng cách chiết dược liệu với ethanol Thành

cạnh đó cũng thu được các lignan khác như demethylpodophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và podophyllotoxon Một số flavonoid cũng đã được phân lập từ nhựa bao gồm astragalin, isorhamnetin, kaempferol và quercetin Những thành phần không tạo thành nhựa là: albumen, calci oxalat, acid gallic, tinh bột, chất béo và chất dễ bay hơi [6]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy từ thân rễ của D aurantiocaulis và D pleianthum

đã phân lập được 10 lignan, bao gồm: picropodophyllin, podophyllotoxin, demethylpodophyllotoxin, diphyllin, dehydropodophyllotoxin, podophyllotoxon,

anthraquinon: physcion và dysoanthraquinon [7] Từ thân rễ loài D versipellis đã xác định được cấu trúc của 15 hợp chất là: β-sitosterol, 4'-demethylpodophyllotoxin, kaempferol, picropodophyllotoxin-4-O-glucosid, cleistanthin-B, kaempferol-3-O-β-D-

icropodophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid, quercetin, daucosterol, podophyllotoxon, acid vanillic, demethyldeoxypodophyllotoxin và sucrose [8], [9], [10]

Ngoài ra từ thân rễ của loài P sikkimensis còn phần lập được hợp chất sikkimotoxin -

một lacton có công thức phân thử C23H26O8 [11]

Hình 1.1.Các hợp chất lignan trong một số loài Podophyllum

1.1.4 Tác dụng sinh học và độc tính của chi Podophyllum

1.1.4.1 Tác dụng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư

Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư là một tác dụng dược lý chính của chi

Podophyllum, trong đó hợp chất podophyllotoxin (PTOX) là một lignan aryl-tetralin

được tìm thấy trong D versipellis đóng vai trò quan trọng Từ PTOX người ta đã bán

tổng hợp ra etoposid, etopopho và teniposid các hợp chất này được sử dụng trên lâm

sàng để điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư phổi, ung thư bạch cầu, ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và ung thư tinh hoàn [12], [13], [14]

Theo nghiên cứu của Pu và cộng sự dịch chiết từ loài D versipellis có khả năng ức

sự phát triển và xâm lấn của tế bào ung thư thực quản CP-C [15] Ba hợp chất podophyllotoxin, 4'-demethylpodophyllotoxin và deoxypodophyllotoxin được phân lập

từ thân rễ loài D versipellis có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung

Hai hợp chất podophyllotoxon và 4'-demethylpodophyllotoxin được phân lập từ thân rễ

loài D versipellis có tác dụng ức chế mạnh trên ba dòng tế bào PC3 (ung thư biểu mô

tuyến tiền liệt), Bcap-37 (ung thư vú) và BGC-823 (ung thư biểu mô dạ dày) với các

13,2 ± 0,5 μM và 11,5 ± 0,6 μM [10] Trên bào ung thư gan HepG2, 04 hợp chất là:

4'-demethylpodophyllotoxin, α-peltatin, podophyllotoxin và β-peltatin được phân lập từ D

versipellis đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HepG2 với giá trị

IC50 < 50 nM, trong đó β-peltatin thể hiện khả năng ức chế tốt nhất với giá trị IC50 là 5 nM [16]

Ngoài ra trong một nghiên cứu khác, kết hợp phân tử nano bạc với dịch chiết nước từ

thân rễ loài D pleiantha tạo thành hạt nano (AgNPs), sau đó khảo sát khả năng gây độc

tế bào ung thư vú (MDA-MB-231 và MDA-MB-453) và tế bào ung thư dạ dày (AGS) của các hạt AgNPs Kết quả cho thấy, AgNPs có khả năng ức chế sự phát triển và phá

ra, AgNPs cũng thể hiện khả năng gây độc đối với tế bào ung thư dạ dày của người với

sử dụng trong quá trình nghiên cứu phát triển các loại thuốc chống ung thư mới [17]

1.1.4.2 Tác dụng bảo vệ gan

Quercetin và kaempferol được phân lập từ loài P versipellis đã được chứng minh có

tác dụng bảo vệ gan do độc tố podophyllotoxin gây ra Thí nghiệm trên chuột cho thấy, nhóm sử dụng cả podophyllotoxin và flavonoid có tỷ lệ tử vong và tổn thương gan, thận thấp hơn đáng kể so với nhóm chỉ dùng podophyllotoxin Các tác dụng biểu hiện trên

lâm sàng gồm giảm nồng độ transaminase huyết tương, phosphatase kiềm, lactat dehydrogenase, ure huyết tương, creatinin và tăng nồng độ glutathion [13], [18]

1.1.4.3 Tác dụng khác

Podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin và β-peltatin được phân lập từ thân rễ các loài Podophyllum có hoạt tính chống lại virus sởi và virus Herpes simplex I với cơ chế có thể là phá vỡ các tế bào vi khuẩn gây cản trở sự nhân lên của virus [19]

1.1.4.4 Độc tính

Các bộ phận như quả xanh, lá, thân, rễ và thân rễ của cây D pleiantha đều có chứa

lignan gây độc gọi là podophyllotoxin, trong đó thân rễ của cây được coi là một bộ phận

có độc tính cao nhất vì có chứa hàm lượng podophyllotoxin cao Biểu hiện ngộ độc D

pleiantha là kích thích nhu động ruột, rối loạn hấp thu, buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy,

chậm mọc móng, suy yếu thần kinh, tê bì chân tay Liều gây tử vong trên người tính theo podophyllin ước tính là 350 mg [20]

Năm hoạt chất được tìm thấy trong thân rễ loài D versipellis là

podophyllotoxin-4-O-D-glucosid, podorhizol, podophyllotoxin, podophyllotoxon và

3′,4′-O,O-didemethylpodophyllotoxin đều gây ảnh hưởng đến chuyển hóa phenylalanin, chuyển hóa glycerolipid, chuyển hóa năng lượng, do đó gây ra hiện tượng stress, oxy hóa, quá trình chết tế bào, phản ứng viêm và tiêu hao năng lượng, cuối cùng dẫn đến tổn thương

tế bào gan [21] Trong thử nghiệm độc tính cấp của loài D versipellis trên chuột cho

thấy, tế bào cơ tim, tế bào gan, tế bào biểu mô ống thận bị phù nề, cấu trúc của màng tế bào và màng nhân tế bào thần kinh bị phá hủy [22]

1.1.5 Công dụng và một số bài thuốc trong YHCT của chi Podophyllum

1.1.5.1 Công dụng D pleiantha là một trong những loại thuốc cổ truyền lâu đời nhất của Trung Quốc

Thân rễ D pleiantha đem cắt thành lát hoặc đập dập được ngâm với nước hoặc rượu để

làm thuốc ở Đài Loan và Trung Quốc để điều trị rắn cắn, suy nhược, u bã đậu, bệnh nổi

hạch, khối u, áp xe với liều lượng 3-60 g cao khô D pleiantha [17], [20] Ngoài ra, D

pleiantha còn được sử dụng như một loại thuốc long đờm, thuốc giảm đau, chống co

thắt, tác dụng an thần [14]

D versipellis có tác dụng tiêu đờm, giải độc, tiêu huyết ứ, tán kết, chủ yếu được dùng

để điều trị ho, đau họng, đau bìu, nọc độc sưng tấy, rắn cắn, chấn thương do va đập và

[3]

1.1.5.2 Một số bài thuốc trong YHCT

Loài D versipellis được ứng dụng trong một số bài thuốc để điều trị ung thư vú, nhọt

độc sưng tấy, tràng nhạc, rắn cắn Cụ thể: Bài thuốc chữa u vú, nhọt độc sưng tấy: Thân rễ bát giác liên 15 g, Hoàng đỗ quyên 15 g, Tử bối thiên quỳ 30 g ngâm với 500 ml rượu trắng sau 7 ngày, mỗi lần uống 10-15 ml, ngày 2-3 lần, kết hợp dùng ngoài xoa hoặc lá Bát giác liên giã nhỏ hơ nóng đắp vào nơi đau [3], [23]

Bài thuốc chữa tràng nhạc: Thân rễ bát giác liên nghiền thành bột, chế với dấm, đắp vào hạch sưng đau hoặc dùng thân rễ 30 g sắc uống, bã đắp tại chỗ [23]

Bài thuốc chữa rắn cắn: Thân rễ Cước diệp 6-12 g giã vắt lấy nước cốt uống, còn bã đắp vào nơi vết rắn cắn [3], [23]

1.2 Tổng quan về loài Podophyllum difforme

1.2.1 Vị trí phân loại của loài P difforme

Bát giác liên còn có tên gọi khác trong Tiếng Việt là: Pha mỏ (Tày), Độc cước liên,

Quỷ cửu Tên khoa học là: Podophyllum difforme Hemsl & E H Wilson; tên đồng nghĩa là Dysosma difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang ex T S Ying,

Dysosma tonkinensis (Gagnepain) Hiroe, Podophyllum tonkinense Gagnepain; Podophyllum triangulum Handel-Mazzetti) thuộc chi Podophyllum, họ Hoàng liên gai

(Berberidaceae), bộ Hoàng liên (Ranunculales), lớp Ngọc lan (Magnoliosida), ngành

Ngọc lan (Magnoliophyta) [1], [3]

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài P difforme

Cây thảo, sống lâu năm, chiều cao từ 15 cm đến 30 cm Thân rễ hình trụ, cứng, chia nhiều đốt, có nhiều rễ nhỏ hình sợi, nhiều xơ Phần trên mặt đất thẳng, một thân có một lá, có màu đỏ tía hoặc màu xanh lục, thân nhẵn, đường kính 0,5-1 cm Lá mọc xen kẽ so le, thường có 1-2 cái, phiến lá hình khiên chéo, kích thước khác nhau, phần lớn lá không phân thùy Nhánh trên cùng với 1 lá nên có dạng cuống dài Cuống lá khác nhau

về chiều dài, cuống nhẵn, dài 20-40 cm Mặt trên phiến lá có màu đỏ tía kích thước 11 x 7-15 cm, phiến lá mỏng, cả hai bề mặt nhẵn, gốc lá thường tròn Mép lá rải rác có hoặc rất ít răng cưa Hoa mọc từ gần cuống lá, hình chóp thuôn dài (như đèn lồng) Cụm hoa từ 2-5 hoa, cuống dài 1-2 cm, rủ xuống, phủ một lớp lông trắng mỏng Cánh đài hình chữ nhật hoặc mũi mác, dài 2-2,5 cm x 2-5 mm, bên ngoài có lông, bên trong nhẵn, đỉnh nhọn Cánh hoa có màu đỏ tía nhạt hình chữ nhật, kích thước 4-5 x 0,8-1 cm, nhẵn, đầu tròn Nhị khoảng 2 cm, chỉ nhị 0,8 cm Bao phấn dài khoảng 1,2 cm Nhụy khoảng 0,9 cm Bầu hình nhạc, đầu nhụy có hình khiên Quả mọng hình cầu, dài 1,7-2,7 cm, khi chín có màu đen, trong chứa nhiều hạt Mùa hoa: tháng 3-6, mùa quả: tháng 6-10 [24], [1]

5-Hình 1.2.Cơ quan sinh dưỡng của cây Bát giác liên [25]

Chú thích: 1 Cây bát giác liên; 2 Thân rễ; 3 Mặt cắt ngang thân rễ.; 4 Cây non; 5 Lá; 6 Mép lá

Hình 1.3.Cơ quan sinh sản của cây Bát giác liên [25]

Chú thích: 1,2,3 Cụm hoa; 4 Ðài và tràng; 5 Bộ nhị; 6 Bộ nhụy; 7 Bộ nhụy cắt ngang; 8 Quả.; 9 Hạt

1.2.3 Phân bố và sinh thái của loài P difforme

Loài P difforme phân bố rải rác ở một số tỉnh miền trung và nam Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam, Tứ Xuyên…) [1] Ở Việt Nam, P

difforme phân bố ở một số tỉnh vùng núi phía bắc như: Cao Bằng, Bắc Kạn (Ba Bể), Hà

Nội (Ba Vì), Hòa Bình (Chợ Bờ), Lạng Sơn (núi Khau Cú) Bát giác liên là cây ưa ẩm và ưa sáng, mọc rải rác dưới tán rừng, bên khe suối, hốc đá Phần trên mặt đất lụi hằng năm vào mùa khô, vào tháng 3 từ phần thân rễ sẽ mọc lên 3 chồi là những thân giả mang lá sau 30-45 ngày, khi lá đạt đến độ trưởng thành cây bắt đầu ra hoa [2], [24] Thân rễ

có khả năng phân nhánh, sau mỗi năm, phần trên mặt đất tàn lụi, đồng thời tạo thành một “đốt củ” ở thân rễ Căn cứ vào số đốt củ trên trục chính của thân rễ, có thể ước tính được tuổi của cây

Bát giác liên là loại cây thuốc thuộc diện quý hiếm ở Việt Nam, cần được ưu tiên nghiên cứu bảo tồn [2]

1.2.4 Thành phần hóa học của loài P difforme

Theo Trung dược chí I (1993) và Trung dược từ hải I (1993) thân rễ Bát giác liên chứa khoảng 2-4% nhựa, chủ yếu là podophylotoxin (0,4-0,8%), picropodophylotoxin Ngoài ra còn có desoxypodophylotoxin, kaempferol và quercetin [2]

Jie Zhang (2014) cùng các cộng sự đã xác định được 05 hợp chất có hoạt tính sinh

học từ thân rễ loài D diformis là: quercetin, kaempferol, rutin và quercitrin và

podophyllotoxin [26] Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Cao Thanh Mai (2014) đã mô tả được các đặc

điểm thực vật và dự đoán mẫu nghiên cứu có thể là 1 trong 3 loài: D pleiantha (Hance) Woodson (P pleianthum Hance) hoặc D majoensis (Gagnepain) M Hiroe (P majoense Gagnepain) và D difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang ex T S Ying (P

tonkinense Gagnepain) và sơ bộ xác định thành phần hóa học của thân rễ mẫu nghiên

cứu có các nhóm: flavonoid, saponin, coumarin, glycosid tim, đường khử, trong đó nhiều nhất là flavonoid [27] Năm 2018, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã công bố 07

hợp chất từ P difforme là podophylotoxin, deoxypodophylotoxin, α-peltatin, quercetin,

rutin, kaempferol và nicotiflorin [28]

Hình 1.4.Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên

1.2.5 Tác dụng sinh học và độc tính của loài P difforme

Các nghiên cứu khác tác dụng dược lý của loài P difforme còn hạn chế Một số nghiên

cứu cho thấy, tác dụng nổi bật nhất của loài là ức chế tế bào ung thư

 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Podophylotoxin phân lập từ P difforme có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư

như: tế bào ung thư bạch cầu cấp tính, tế bào adenocarcinoma, melanoma… [2]

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Dung (2018) cho thấy, α-peltatin được phân lập từ thân rễ loài P difforme có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư

bạch cầu cấp (Jukat), bào ung thư tủy xương (K562), ung thư vú (MCF-7) và ung thư

[25]

 Tác dụng khác Hợp chất α-peltatin được phân lập từ thân rễ loài P difforme có tác dụng chống oxy

Các chất thuộc nhóm flavonoid như kaempferol và quercetin có trong loài P difforme

có tác dụng giảm ho, lợi đờm trong viêm phế quản mạn tính [2]

 Độc tính Một số thành phần trong Bát giác liên (P difforme) gây kích thích tim ếch, làm tim

ngừng đập ở thời kỳ tâm thu, làm giãn mạch máu tai thỏ, gây co bóp nhẹ với mách máu thận của thỏ, mạch máu chi sau của ếch Nhựa Bát giác liên có tác dụng gây nôn, tiêu chảy và gây tử vong cho mèo trên thực nghiệm Podophyllotoxin gây tiêu chảy nặng, đau bụng, đi ngoài ra máu, nghiêm trọng hơn có thể dẫn đến suy sụp kiệt sức Dùng bằng đường tiêm xuất hiện tác dụng kích thích thần kinh trung ương Do có độc tính lớn nên podophyllotoxin không được sử dụng trực tiếp trên lâm sàng Vì vậy, người ta đã cải tiến cấu trúc hóa học của podophyllotoxin, dùng các dẫn chất có độ độc thấp hơn và đã được ứng dụng trên lâm sàng trong điều trị một số bệnh ung thư [2]

1.2.6 Công dụng và các bài thuốc trong YHCT của loài P difforme

ngày hoặc chế thành hoàn tán Cây tươi giã nát đắp tại chỗ hoặc rễ mài lấy nước bôi Lưu ý, phụ nữ có thai không dùng được

1.2.6.3 Bài thuốc trong YHCT [2]

 Chữa tràng nhạc: Rễ bát giác liên nghiền thành bột, điều chế với giấm, đắp vào hạch sưng đau, hoặc dùng thân rễ 30 g sắc nước uống, còn bã đắp tại chỗ

 U vú: Bát giác liên, hoàng đỗ quyên mỗi vị 15 g, tử bối kì 30 g ngâm trong 500 ml rượu trắng trong 7 ngày Mỗi ngày uống 2-3 lần, 10-15 ml/lần Dùng ngoài xoa

1.3 Tổng quan giữa tác dụng chống ung thư và tác dụng chống viêm

Từ thế kỉ XIX, mối tương quan giữa chứng viêm và ung thư đã được tìm ra Những người có tình trạng viêm mãn tính dễ mắc một số loại ung thư như: ung thư vú, ung thư gan, ruột, bàng quang, tiết niệu, tuyến tiền liệt, niêm mạc dạ dày, buồng trứng và ung thư da Tình trạng viêm mạn gây ra sự biến đổi sinh lý và chiếm khoảng 15% tổng số ca ung thư trên toàn thế giới [29] Điển hình như viêm gan virus B, viêm gan virus C nếu không được điều trị và kiểm soát tốt có thể dẫn đến ung thư gan Tương tự một số tình trạng viêm như viêm thực quản, viêm tụy mãn tính, viêm túi mật… mãn tính lâu ngày cũng có thể dẫn niên ung thư thực quản, tuyến tụy và túi mật [30] Viêm mãn tính thường đặc trưng bởi tổn thương mô, sự tăng sinh của tế bào, tế bào lympho và đại thực bào tại ổ viêm được kích thích sản xuất ra các chất trung gian gây viêm như: ROS, cytokine, NF-kB, tăng hoạt tính COX-2 (tăng sinh PGE2)… dẫn đến ức chế quá trình chết của tế bào và kích thích tăng sinh tế bào [31]

Các bệnh ung thư liên quan đến virus papilloma ở người (HPV), đặc biệt là ung thư cổ tử cung nguyên nhân chính là kích thích trực tiếp bởi các gen gây ung thư của HPV Ngoài ra, những dạng ung thư này cũng có thể được kích thích gián tiếp bởi tình trạng viêm mãn tính do HPV gây ra Viêm mãn tính có liên quan đến tổn thương mô lặp đi lặp lại và phát triển các đột biến ở các gen ức chế khối u quan trọng do làm tăng sự biểu hiện của cyclooxygenase COX-2 và PGE2, (được cho là nguyên nhân chính gây ra tình trạng viêm do HPV) [32] Trong số các chất trung gian gây viêm, prostaglandin E2 (PGE2) hỗ trợ sự xâm lấn của khối u biểu mô bằng một số cơ chế, như: bao gồm thúc

đẩy tế bào ung thư tăng trưởng, thoát khỏi apoptosis, kích thích hoạt hóa các thụ thể của yếu tố tăng trưởng tyrosine kinase và tạo ra sự hình thành mạch Hơn nữa, PGE2 là một nhân tố quan trọng trong môi trường vi mô khối u, PGE2 giúp tế bào ung thư ngăn chặn và né tránh khả năng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tăng sự tiến triển của khối u[33] Trong khi các cytokine và chemokine tiền viêm điều chỉnh sự phát triển của ung thư, thì các bằng chứng mới đã chỉ ra rằng việc tăng sản xuất PGE2 thúc đẩy sự khởi đầu, tiến triển, xâm lấn, di căn và tái phát của ung thư đường tiêu hóa [34]

Sự biểu hiện quá mức của COX-2 liên quan việc tăng cường hình thành mạch và gây ung thư thông qua việc ức chế tế bào T, tế bào B, tăng sinh tế bào NK, tăng khả năng vận động và xâm lấn của khối u Như vậy có thể thấy viêm và ung thư có mối liên hệ chặt chẽ với nhau và bằng cách hạn chế tình trạng viêm mãn tính có thể kiểm soát ung thư ở một mức độ nào đó tốt hơn Một số nghiên cứu đã chứng minh sử dụng các thuốc NSAIDs (aspirin, celecoxib, diclofenac, diflunisal, naproxen, piroxicam…) trong viêm mạn tính giúp giảm tỉ lệ mặc bệnh lý ác tính và ung thư

Các chất đã được chứng minh vừa có tác dụng chống ung thư vừa có tác dụng chống viêm như: 8-anilinoimidazopyridine ức chế hoạt động của MEK kinase, chiết xuất sụn vi cá mập có tác dụng chống viêm, ức chế quá trình tạo mạch và hình thành khối u, kết hợp curcumin với một NSAIDS trong chế phẩm điều trị ung thư và viêm, các dẫn xuất imidazole có hoạt tính chống ung thư và ức chế cytokine trong viêm cột sống, viêm xương, viêm khớp… Một số hợp chất có nguồn gốc từ thực vật được chứng minh có hiệu quả trong việc ức chế tế bào ung thư thông qua ức chế quá trình viêm như: tinh bột nghệ (curcuma longa) kích thích đào thải các chất chuyển hóa gây viêm của oxy, berberin kiểm soát các gen chết theo chu trình Casp5 GADD45A tác dụng tốt trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt, apigenin (cam, hoa cúc, hành tây) kiểm soát protein pro-apototic tác dụng trên tế bào A549 và H1299, piperin ức chế surviving và p65 có tác dụng trên tế bào MDA-MB-231 và MDA-MB-468, quercetin tác dụng lên apotosis có tác dụng trên các dòng tế bào MCF-7, BT-20… [35]

Như vậy có thể thấy, viêm thường liên quan đến sự phát triển và tiến triển của bệnh ung thư Viêm bên ngoài khối u được gây ra bởi nhiều yếu tố, bao gồm nhiễm trùng do

vi khuẩn và virus, bệnh tự miễn, béo phì, hút thuốc lá, phơi nhiễm amiăng và uống quá nhiều rượu, tất cả đều làm tăng nguy cơ ung thư và kích thích tiến triển ác tính Ngược lại, tình trạng viêm do ung thư hoặc do ung thư gây ra có thể được kích hoạt bởi các đột biến khởi phát ung thư và có thể góp phần vào sự tiến triển ác tính thông qua việc tuyển dụng và kích hoạt các tế bào viêm Cả tình trạng viêm bên ngoài và bên trong đều có thể dẫn đến ức chế miễn dịch, do đó tạo nền tảng thuận lợi cho sự phát triển của khối u Các tế bào gây ra tình trạng viêm liên quan đến ung thư ổn định về mặt di truyền và hạn chế được tình trạng kháng thuốc; do đó, việc nghiên cứu các chế phẩm vừa có tác dụng chống viêm vừa có tác dụng chống ung thư là một chiến lược có nhiều hứa hẹn tốt cho việc phòng ngừa ung thư và điều trị ung thư trong tương lai [36]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân rễ của loài Bát giác liên thu hái tại xã Quyết Tiến, huyện

Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vào tháng 7 năm 2022 (Hình 2.1) Ước tính tuổi cây từ 15-20

năm Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Podophyllum difforme Hemsl &

E H Wilson Tiêu bản thực vật Bát giác liên được lưu tại phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP), Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là

HNIP/18694/23 (Phụ lục 1)

bảo quản trong túi nilon đến khi làm thực nghiệm

Hình 2.1.Mẫu bát giác liên nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất, dung môi và dòng tế bào

(EtOH), methanol (MeOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), dichloromethan (DCM), aceton, n-butanol (BuOH),

và silica gel pha đảo YMC (30-50 mm; Fujisilisa Chemical Ltd., Nhật Bản)

 Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản

 Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc

MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt), có bổ sung thêm

Bovine Serum), Trypsin-EDTA (0.05%); dung dịch đệm PBS

(phosphate buffered saline), ellipticin, SRB (sulforhodamin B), acid acetic v.v

GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp: MDA-MB-231: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma); HepG2: Ung thư gan ở người (human hepatocellular carcinoma) và HL60: Ung thư bạch cầu cấp ở người (human leukemia)

2.1.3 Trang thiết bị và máy móc

đong, phễu thủy tinh…

Sỹ)

Hóa học, VAST)

hiệu năng ghép cao kết nối với 2 lần khối phổ LC-MS/MS và detector DAD (Shimadzu, Nhật Bản)

học Dược Hà Nội

 Máy quay vortex

dụng cụ thí nghiệm thông thường

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu để ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Nội dung 1: Chiết xuất cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ thân rễ

loài Bát giác liên

 Nội dung 2: Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro của

cao chiết toàn phần và cao phân đoạn từ thân rễ loài Bát giác liên

 Nội dung 3: Phân lập, đo phổ và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân

đoạn được lựa chọn của thân rễ loài Bát giác liên

 Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư và ức chế sản

sinh PGE2 in vitro của các hợp chất phân lập được từ thân rễ loài Bát giác liên

Thiết kế nghiên cứu của luận văn được tóm tắt ở sơ đồ hình 2.2

Hình 2.2.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Phân đoạn

n-butanol

Phân đoạn Nước

Phân đoạn tiềm năng

03-05 hợp chất tinh khiết

Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng trế bào ung thư và

ức chế sản sinh PGE2 in vitro củac các hợp chất phân lập

được

1 Chiết nóng với EtOH 70% 3 lần, 3h/lần, tỉ lệ dm/dl: 6/1 (tt/kl) 2 Gộp dịch chiết, thu hồi dung môi

1 Phân tán cao vào nước và chiết lỏng – lỏng

lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol

3 Thu hồi các dung môi dưới áp xuất giảm

Đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế

bào ung thư in vitro của các phân đoạn

Phân lập bằng sắc kí cột

Xác định cấu trúc các hợp chất

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Phương pháp chiết xuất

Dược liệu Bát giác liên được chiết xuất với EtOH 70% bằng phương pháp chiết nóng sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần

Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết phân đoạn lần lượt với dung

môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần với tỉ lệ

1:1, v/v) thu được các phân đoạn tương ứng

2.2.2.2 Phương pháp phân lập

Các hợp chất được phân lập bằng sắc ký cột pha thường và pha đảo Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và phát hiện các chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 365 nm và quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử

TLC với các hệ dung môi phù hợp [37]

2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng

hợp so sánh với tài liệu tham khảo

2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư in vitro

2.2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp – thử trên 02 dòng tế bào: MDA-MB-231 và HepG2

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện

in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan [38] và Monks [39]

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng SRB Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

 Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm Tiến hành đưa 190 µL tế bào vào đĩa 96 giếng để thử nghiệm

 Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100% để có nồng độ ban đầu (stock) là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào (không có FBS) thành các dãy nồng độ từ cao xuống thấp

chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng acid Trichloracetic – TCA 20%

độ phòng

quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek)

2.2.3.2 Phương pháp MTT để xác định hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào đối với tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch – thử trên dòng tế bào HL60

Phương pháp này được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological

Methods năm 1983 [40] và Alley MC trên tạp chí Cancer research năm 1988 [41] Tác

giả sử dụng muối tetrazolium (MTT - (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ

thể như sau:

 Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100% để có nồng độ ban đầu (stock) là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào

(không có FBS) thành các dãy nồng độ từ cao xuống thấp Tiến hành đưa 10 µL/giếng mẫu thử đã pha loãng vào các giếng của đĩa thí nghiệm

của khay 96 giếng đã có 10 µL chất thử Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10% Giếng không có tế bào và mẫu thử, chỉ có môi trường nuôi cấy được xem là giếng blank

48 giờ

100% Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ BioTek

2.2.3.3 Xử lý số liệu

qua công thức sau:

𝑂𝐷(𝐷𝑀𝑆𝑂) − 𝑂𝐷(𝑛𝑔à𝑦 0)

sử dụng như là chất đối chứng tham khảo

phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

tốt khi IC50  10 μM [42]

2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 in vitro

2.2.4.1 Nuôi cấy tế bào RAW 264.7

Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường RPMI có bổ sung huyết thanh bò FBS 10%, 100 đơn vị/mL penicillin

2.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 bằng phương pháp MTT

Đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến khả năng sống sót của tế bào RAW 264.7 bằng phương pháp MTT được thực hiện tương tự như mục 2.2.3 Trong đó, nồng độ thử của chất tinh khiết là 3 µM

2.2.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế sản sinh PGE2 trên tế bào RAW 264.7 bằng xét nghiệm ELISA [43], [44], [45]

a) Nguyên tắc

Nguyên tắc ELISA cạnh tranh là phản ứng cạnh tranh xảy ra giữa kháng nguyên (trong mẫu thử) cạnh tranh với kháng nguyên (được đánh dấu) để liên kết với một lượng kháng thể giới hạn, mà trước đó kháng thể này đã được đưa lên một pha rắn Sau khi phản ứng cân bằng, rửa sạch các kháng nguyên không liên kết và đo tín hiệu từ phần đánh dấu

Các bước thử được thực hiện theo hướng dẫn của kit thử

b) Chuẩn bị mẫu Các mẫu thử được pha bằng DMSO và lắc vortex ở tốc độ 300 - 500 rpm trong 1 - 2 phút cho đến khi dịch đồng đều Các mẫu thử tiếp tục được pha loãng trong PBS đến nồng độ thử thích hợp Thể tích mẫu thử là 2,5 μL

độ 5 ng/mL) và được thêm dexamethason nồng độ 100 nM c) Tiến hành

Tế bào RAW 264.7 sau khi nuôi cấy 6 ngày, được tách ra, rửa và pha lại trong môi

vào các giếng mẫu cần thử với nồng độ thích hợp trong 24 giờ LPS và dexamethason được sử dụng là chất đối chứng Sau 24 giờ ủ với các chất thử, môi trường nuôi cấy

miễn dịch ELISA đo ở bước sóng 450 nM d) Xử lý số liệu

thử với mật độ quang của mẫu chứng viêm Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kế theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel

Kết quả thí nghiệm được hiển thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả chiết xuất cao tổng và các phân đoạn từ thân rễ Bát giác liên

4,5 kg thân rễ Bát giác liên sau khi sấy khô và xay nhỏ được chiết nóng với EtOH

(kg/l)) Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất

giảm thu được cao chiết EtOH 70% (PDT, 855 g) Phân tán 535 g cao chiết EtOH 70%

trong nước nóng và chiết lỏng-lỏng lần lượt với n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung

môi 3 lần, tỉ lệ 1 :1) Dịch chiết các phân đoạn được gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm thu được các cao tương ứng: cao n-hexan (PDH, 7,4 g), cao EtOAc (PDE,

65,6 g), cao BuOH (PDB, 115,3 g) và cắn nước (PDW, 295,3 g) Quá trình chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn được tóm tắt trong hình 3.1

Hình 3.1.Tóm tắt quá trình chiết xuất các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên

3.2 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ

thân rễ Bát giác liên

Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ thân rễ

Bát giác liên trên một số dòng tế bào được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của các cao chiết từ thân rễ Bát giác liên trên các dòng tế bào MDA-MB-231, HL60 và HepG2

± 1,05 µg/ml (trên dòng tến bào MDA-MB-231) và 8,68 ±1,13 µg/ml (trên dòng tế bào

nằm trong khoảng 12,70 - 19,06 µg/ml Ngoài ra, tác dụng ức chế các dòng tế bào ung

thư của các phân đoạn theo mức độ như sau: PDE > PDB > PDT > PDH Do đó, phân

đoạn EtOAc được lựa chọn để phân lập các hợp chất

3.3 Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn EtOAc của thân rễ Bát giác liên

Cao ethyl acetat (63,6 g) được phân tách bằng cột sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng

(E1 - E6) và hai hợp chất BGL1 (194,5 mg) và BGL3 (324,6 mg)

Phân đoạn E2 (24,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi dichloromethan - aceton (15:1 - 1:1, v/v) thu được 10 phân đoạn (E2.1 - E2.10) Phân đoạn E2.6 (5,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton - nước

(6:4, v/v) thu được 2 hợp chất BGL2 (18 mg) và BGL4 (12 mg) Phân lập phân đoạn

E2.7 (4,1 g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton - nước (6:4, v/v) thu được

hợp chất BGL5 (14 mg) Quá trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc ở sơ đồ

hình 3.2

Quá trình phân lập các hơp chất được tóm tắt trong hình 3.2

Hình 3.2.Tóm tắt quá trình phân lập các hợp chất từ thân rễ Bát giác liên

Hình ảnh sắc kí của các hợp chất phân

lập được ở đèn 254nm

Hình ảnh sắc kí của các hợp chất phân lập được sau khi phun H2SO4 10% ở

đèn 365nm

Hình 3.3 Hình ảnh sắc kí đồ của các hợp chất phân lập được, trên bản mỏng pha

đảo, hệ dung môi aceton:nước (7:3)

3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

3.4.1 Hợp chất BGL1

ion giả phân tử tại m/z 399,30 [M-H]- phù hợp với công thức phân tử C21H20O8

4,48 (1H, dd, 8,6; 6,2) 4,00 (1H, dd, 10,5; 8,6)

Vị trí BGL1 α-Peltatin

a,bδCa,cδHa,dδC [8] a,eδH [46]

a) CDCl3, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) 500 MHz, e) 125 MHz

cho biết cấu trúc BGL1 có một vòng lacton trong phân tử Cấu hình tại C-7ʹ và C-8ʹ

phổ kết hợp với tham khảo tài liệu [8] và [46], BGL1 được kết luận là α-peltatin (Hình

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất BGL2 và podophyllotoxin

a) CDCl3, b) 600 MHz, c) 150 MHz, d) 500 MHz, e) 125 MHz

Dữ liệu phổ NMR của BGL2 có sự tương đồng với BGL1, ngoại trừ sự vắng mặt của

C-7 có thể đã được gắn thêm nhóm hydroxy Bên cạnh đó, BGL2 xuất hiện thêm tín