TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CÂY XẤU HỔ (MIMOSA PUDICA L.)
1.1.1 Vị trí phân loại của Mimosa pudica L
Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae)
Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)
1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Cây xấu hổ còn có tên gọi khác là cây mắc cỡ, cây thẹn, cây trinh nữ [1] Cây nhỏ, mọc hoang bản địa ở Việt Nam, thân có gai hình móc Lá 2 lần kép lông chim, cụp xuống khi động vào Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, xếp giống như hình chân vịt, có lông trắng cứng Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống [1]
Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1.5mm Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đấu tròn, màu tím hồng; đài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị
Chi Mimosa có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á Ở Việt Nam có 4 loài, trong đó có cây Xấu hổ (M pudica L.) Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi độ cao dưới 1000m.[5]
1.1.3 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L
Trong cây Xấu hổ đã xác định sự có mặt của một số nhóm chất sau: Flavonoid, alcaloid, terpenoid, các hợp chất phenol, saponin, tannin, các acid hữu cơ và acid amin [13]
Cassiaoccidentalin B [13], [16] 5,7,3’,4’-tetrahydroxyl-6-C-[β-D-apiose-(1→4)]- β-D-glucopyranosyl flavon [17], [18]
CÁC HỢP CHẤT PHENOL KHÁC
4-(24’-methoxy-2,4’-methyl-1’-oxo-5’- n-propyl-tetracosanyl)-phenol [19]
Acid caffeic [23] Acid p-hydroxy benzoic [23]
OTHER ORGANIC ACIDS acid jasmonic [13], [19], [23] acid abscisic [13], [19]
Hình 1.1 Công thức cấu tạo các hợp chất trong Mimosa pudica L
Các hợp chất terpenoid: 19-O-trans-feruloyl-labd-8(17)-en-15,19-diol và 19-O[(E)- 3’,4’-dimethyloxy cinnamoyl]-lab-8(17)-en-15,19-diol đã được phân lập từ rễ cây
Các hợp chất acid amin: tyrosin [13]
Các hợp chất protein: tubulin [13]
1.1.4 Tổng quan về tác dụng sinh học của Mimosa pudica L
Nhiều nghiên cứu về Mimosa pudica L tác dụng sinh học đã được thử nghiệm và các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Mimosa pudica L có một số tác dụng như: chữa lành vết thương [28], chống co giật [29], điều trị tiểu đường [30], kháng khuẩn [31]; dịch chiết ethanol lá của Mimosa pudica L có tác dụng giảm đau và chống viêm [32], [33], tác dụng bảo vệ gan [34], và chống tiêu chảy [35], Ngoài ra, ở Cameroon, Mimosa pudica L được sử dụng để điều trị chứng mất ngủ, động kinh, lo lắng và kích động [36]
9 Các tác dụng khác như: Chất chống oxy hóa [34], [37], kháng nọc độc rắn [38], chống sốt rét [39], cũng được tìm thấy trên Mimosa pudica L
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Mimosa pudica L có tác dụng chống viêm tại phổi [6], Điều trị hen phế quản [7] Trên mô hình viêm phổi với Sephacryl S-
200, chiết xuất nước Mimosa pudica L (liều 2.8g / kg trọng lượng cơ thể của chuột) có tác dụng chống viêm rõ ràng; giảm đáng kể trọng lượng phổi, giảm số lượng bạch cầu ái toan trong dịch rửa phế quản phế nang so với nhóm chứng bệnh Tác dụng giảm trọng lượng phổi và giảm số lượng bạch cầu ái toan trong dịch rửa phế quản phế nang của
Mimosa pudica L chiết xuất nước tương đương với tác dụng của dexamethasone
Trong một nghiên cứu tại Việt Nam, kết quả cho thấy chiết xuất nước và chiết xuất ethanol của Mimosa pudica L (5.6g/kg trọng lượng khô) đều có tác dụng ức chế mạnh phản ứng co thắt phế quản do histamine gây ra Tác dụng này tương đương với diphenhydramine (liều 2mg / kg) và aminophylline (liều 6mg / kg) [7].
TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐÍCH CHỐNG VIÊM TRONG HEN SUYỄN
1.2.1 Giới thiệu bệnh hen suyễn
Hen suyễn là một bệnh lý đa dạng, đặc trưng bởi viêm đường thở mãn tính Bệnh được xác định bởi tiền sử các triệu chứng hô hấp như thở khò khè, thở nông, tức ngực và ho Những triệu chứng này thay đổi theo thời gian và cường độ, cùng với sự hạn chế luồng khí thở ra [40]
Cơ chế bệnh sinh của hen suyễn rất phức tạp và có nhiều cơ chế, nhưng cơ chế viêm đường thở là quan trọng nhất Viêm đường thở là một triệu chứng phổ biến cho tất cả các dạng hen suyễn Viêm đường thở trong hen phế quản gồm 3 giai đoạn: Viêm cấp tính – Viêm mạn tính – Tái tạo lại cấu trúc đường thở Có nhiều tế bào và yếu tố liên quan đến viêm đường thở trong hen suyễn, chẳng hạn như cytokine, các yếu tố hóa ứng động, yếu tố tăng trưởng và các phân tử bám dính (adhesion molecules) Tùy thuộc vào giai đoạn phản ứng viêm đường thở, các tế bào khác nhau được tuyển dụng từ máu vào đường thở Một số mục tiêu có thể có trong điều trị hen phế quản được trình bày dưới đây:
1.2.2 Các nhóm đích tác dụng chống viêm
Hướng tới các chất trung gian gây viêm
Các chất trung gian gây viêm đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch của cơ thể Chúng là những chất được giải phóng bởi các loại tế bào khác nhau để đáp ứng với nhiều kích thích khác nhau và chịu trách nhiệm thúc đẩy hoặc ức chế viêm [41],
10 [42] Một số đích chống viêm như ức chế receptor cytokine, ức chế receptor chemokine, ức chế NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), ức chế IL-1 beta và TNF-alpha
Protease là các enzyme xúc tác cho sự phân hủy protein thành các peptide hoặc axit amin nhỏ hơn Chúng đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, bao gồm cả phản ứng viêm [43] Một số đích có thể hướng tới là human neutrophil elastase, Proteinase 3 (PR3), cathepsin G và matrix metalloproteinase (MMP)
Hướng tới ức chế các kinases
Hơn 500 gen kinase đã được xác định ở người và kinase đóng vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tăng sinh tế bào, chết theo chu trình và phản ứng viêm Một số đích có thể hướng tới là ức chế IKKβ, ức chế p38 MAPK, ức chế Phosphoinositide-3-kinase và ức chế Epidermal growth factor receptor
Hướng tới ức chế các Phosphodiesterase-4 (PDE4)
Phosphodiesterase (PDEs) được mã hóa bởi 21 gen để tạo ra hơn 100 đồng dạng khác nhau và có thể được chia thành 11 họ isozyme (PDE1−11) PDE4, một trong những họ PDE đặc biệt xúc tác cho sự thoái hóa của cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate (cAMP), qua đó thúc đẩy quá trình viêm Một đích có thể hướng tới trong là ức chế PDE4B
1.2.3 Tổng quan về đích chống viêm p38 MAPK p38 MAPK đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm vì nó là một phần thiết yếu trong việc sản xuất các chất trung gian gây viêm [44] Họ MAPK p38 bao gồm bốn đồng dạng, trong đó p38α được cho là chủ yếu điều chỉnh quá trình viêm [44] p38 có thể hoạt hóa yếu tố phiên mã NF-kB NF-kB được hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa và phân hủy protein ức chế IkB, sau đó NF-kB có thể xâm nhập vào nhân và liên kết với vị trí gắn kết cụ thể trong gen phụ thuộc NF-kB (Hình 1.2) và kích hoạt tăng sinh các chất trung gian gây viêm [45] Vì vậy, việc ngăn chặn tín hiệu MAPK p38 giúp giảm giải phóng chất trung gian gây viêm và do đó ngăn chặn phản ứng viêm [44]
Hình 1.2 Con đường tín hiệu p38 MAPK và phản ứng viêm qua trung gian
MAPK p38 có liên quan mật thiết tới cơ chế bệnh sinh của hen phế quản Mức độ phosphoryl hóa p38 MAPK trong các tế bào biểu mô tăng đáng kể trong đường thở của bệnh nhân hen suyễn nặng so với ở bệnh nhân hen suyễn nhẹ và nhóm chứng không bệnh [46] Đại thực bào phế nang từ bệnh nhân hen suyễn nặng cho thấy tăng kích hoạt p38 MAPK và không nhạy cảm với corticosteroid [47] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất hiệu quả của các sản phẩm tự nhiên trong các mô hình động vật bị hen suyễn do ức chế p38 MAPK [48], [49], [50]
Trong một số thử nghiệm lâm sàng, ức chế p38 MAPK đã được quan sát thấy như một chiến lược điều trị tiềm năng cho bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) [45], [51], [52], [53] Thuốc ức chế p38 cải thiện các thông số chức năng phổi chính và giảm bớt khó thở ở bệnh nhân COPD, như được đánh giá thông qua các phép đo như thể tích thở ra cưỡng bức mỗi giây (FEV1), dung tích sống cưỡng bức (FVC) và chỉ số khó thở chuyển tiếp (TDI) [52]
12 Trong một nghiên cứu gắn kết với đích p38 MAPK, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Chennu MM Prasada Rao đã tiến hành nghiên cứu về các chất ức chế p38 MAPK tiềm năng [54] Nghiên cứu đã tiến hành docking phân tử 1172 hợp chất tiềm năng với đích p38 MAPK và so sánh với chất chuẩn đã được chứng minh tác dụng ức chế p38 MAPK là Adezmapimod (hình 1.3.), sau đó lựa chọn các hợp chất có ái lực liên kết cao để tiến hành nghiên cứu mô phỏng động lực phân tử [54] Nghiên cứu kết luận 2 hợp chất metergoline và withaphysacarpin có ái lực cao với p38α MAPK [54]
TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC IN SILICO
Molecular docking là một phương pháp tính toán được sử dụng trong phát triển thuốc mới và các lĩnh vực sinh học phân tử khác, kỹ thuật này liên quan đến việc mô phỏng tương tác giữa hai phân tử - thường là protein và một phân tử nhỏ được gọi là phối tử (ligand) Mục tiêu là dự đoán hướng và cấu tạo của phối tử tạo ra phức hợp ổn định nhất với protein [55] Có hai loại docking chính: cứng và linh hoạt, trong đó lắp ghép cứng giả định rằng các phân tử là có hình dạng không thay đổi trong quá trình lắp ghép
13 Tuy nhiên, trong thực tế, quá trình tương tác giữa phối tử và protein diễn ra một cách linh hoạt, chúng có thể thay đổi hình dạng để phù hợp tốt nhất với nhau Do đó các nhà khoa học đã đề xuất mô hình lắp ghép linh hoạt, cho phép các phối tử thay đổi hình dạng trong quá trình lắp ghép (docking) Mô hình này có khả năng tiếp cận gần nhất với trạng thái tự nhiên của phân tử và dự đoán được trạng thái kết hợp ổn định nhất
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu và đã thành công trong việc dự đoán sự tương tác giữa thuốc và protein mục tiêu [4], [56]
Kỹ thuật mô phỏng tương tác phân tử cho phép mô tả hoạt động của phối tử trong vùng hoạt động của protein (đã được xác định tọa độ) mục tiêu cũng như làm sáng tỏ các quy trình hóa sinh cơ bản ở mức độ phân tử Kết quả quá trình mô phỏng tương tác phân tử thể hiện dựa qua giá trị năng lượng liên kết “binding energy” Năng lượng liên kết càng nhỏ thể hiện ái lực liên kết giữa phối tử và protein càng lớn
Tuy là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi vì tính nhanh và tiết kiệm chi phí, mô phỏng tương tác phân tử vẫn có những khó khăn riêng, đặc biệt là trong việc xác định vị trí và hướng của phối tử và xác định trung tâm hoạt động của protein đích Đồng thời kỹ thuật này còn có nhược điểm là chưa tính đến ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và áp suất Để có thể xóa nhòa nhược điểm này, chúng ta cần phải sử dụng tới kỹ thuật mô phỏng động lực phân tử (molecular dynamics simulation)
1.3.2 Phương pháp Molecular dynamics simulations
Mô phỏng động lực phân tử là một kỹ thuật mô phỏng được sử dụng để nghiên cứu sự biến đổi theo thời gian của hệ tương tác nhiều vật Hệ tương tác ban đầu được xác định thế năng tương tác giữa các vật trong hệ Từ biểu diễn của thế năng và vị trí ban đầu của các nguyên tử, ta có thể xác định được lực tương tác lên từng nguyên tử trong hệ và phương trình chuyển động của các vật Việc giải phương trình chuyển động sẽ cho ra những kết quả chi tiết về cấu hình của hệ tại mỗi thời điểm, từ đó tìm hiểu được chuyển động riêng của mỗi phần tử trong hệ thống theo thời gian
Khác với phương pháp mô phỏng trước đây như phương pháp mô phỏng ngẫu nhiên Monte-Carlo, thay vì sử dụng di chuyển ngẫu nhiên thì phương pháp MDS di chuyển nguyên tử bằng cách giải phương trình chuyển động Các phương trình chuyển động đó được xây dựng từ các định luật Newton [57]
Hình 1.6 MDS trong quá trình tìm kiếm và phát triển thuốc mới
Mô phỏng động lực học phân tử đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tìm kiếm và phát triển các loại thuốc mới MDS giúp chúng ta nhanh chóng sàng lọc và xác định các hợp chất tiềm năng, từ đó giảm thiểu chi phí tiến hành nghiên cứu
Thuật toán cơ bản của mô phỏng MD bao gồm việc chia thời gian thành các bước riêng biệt, thường không quá vài femto giây (10 -15 giây) mỗi bước [58] Tại mỗi bước thời gian, các lực tác dụng lên mỗi nguyên tử được tính toán bằng trường lực cơ học phân tử Sau đó, vị trí và vận tốc của mỗi nguyên tử được cập nhật bằng các định luật chuyển động của Newton [58]
MDS là một phương pháp phổ biến, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu y sinh, khoảng một phần ba tài nguyên siêu máy tính của Hoa Kỳ là dùng để mô phỏng MDS của các phân tử sinh học [58]
Quá trình Molecular dynamics simulation
Chuẩn bị hệ thống Đây là bước chuẩn bị ban đầu và khác nhau đối với từng phần mềm Có rất nhiều phần mềm để chọn lựa, bao gồm GROMACS, NAMD, AMBER, CHARMM, Desmond, và OpenMM [59] Tất cả các gói phần mềm này đều thực hiện các phép tính tương tự nhưng khác nhau về tính năng được hỗ trợ và mức độ hiệu quả của chúng [59]
Thông thường, file protein đích được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PDB http://www.rcsb.org ở cấu trúc 3D dưới định dạng PDB Sau đó, protein được tối ưu hóa bằng cách loại nước và các cấu tử khác (nếu có), thêm các nguyên tử còn thiếu (bao gồm
15 hydro) rồi được đưa vào phần mềm để tạo ra file topology (topol.top), một file quy định mối quan hệ trong không gian của các đối tượng gần nhau Tiến hành xây dựng mô hình topology của phối tử (ligand) tương tự, sau đó tạo ra mô hình topology của phức hợp protein-ligand
Tiếp đó xác định hộp dung môi của phức hợp protein-ligand, sau đó tiến hành thêm vào các phân tử “dung môi” như nước, ion muối để trung hòa điện tích và lipid (trong trường hợp tiến hành với protein màng) [59]
Hệ protein-phối tử được giản hóa năng lượng để đảm bảo không có xung đột không gian trong hệ, sau đó tiếp tục tiến hành cân bằng hệ để đưa hệ tới điểm cân bằng trước khi tiến hành chạy MDS Các bước này có thể được thực hiện trong phần mềm chạy
MDS như GROMACS, NAMD, AMBER, CHARMM, Desmond, và OpenMM.[59]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
Cơ sở dữ liệu về các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L được thu thập từ các tạp chí và bài báo khoa học từ Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier cùng với các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L mà nhóm nghiên cứu đã phân lập trong các nghiên cứu trước đây
Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L và ChemID của chúng được thu thập từ cơ sở dữ liệu PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Cơ sở dữ liệu về các mục tiêu chống viêm được thu thập từ Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)
Phần mềm được sử dụng để vẽ cấu trúc hóa học: Pymol 2.5.5
Phần mềm được sử dụng để tính toán và xử lý dữ liệu: Microsoft Excel 2016
Phần mềm dùng để tiến hành Molecular Docking: Auto dock 4.2.6, MGLTools 1.5.7, Open Babel GUI, Anaconda, Jupyternotebook, Google COLAB
Phần mềm dùng để tiến hành Molecular dynamics simulation: GROMACS 2021.4, AutoDockFR, Meeko
Máy tính: CPU - Intel Core i9 14900F; GPU - NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti; 64GB
3200 MHz RAM; SSD Samsung 980 Pro 2TB.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau đây:
Thu thập thông tin về thành phần hóa học của cây Xấu hổ
Thu thập thông tin về các đích chống viêm
Sử dụng công cụ docking phân tử để dự đoán khả năng tương tác của các hợp chất từ cây Xấu hổ với các mục tiêu protein liên quan đến quá trình viêm, tập trung vào cơ chế viêm ở các đích tại phổi
Phân tích dữ liệu docking để tìm ra các hợp chất có khả năng ức chế mạnh nhất và so sánh chúng với các chất chống viêm đã biết
Sử dụng mô phỏng động học phân tử (Molecular dynamics) để xác định khả năng tương tác lâu dài của các hợp chất chống viêm tiềm năng với các mục tiêu protein trong môi trường sinh lý
Phân tích các thông số động học như RMSD, RMSF, và Rgyr để đánh giá độ ổn định trong môi trường sinh lý của các hợp chất.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu bao gồm 4 giai đoạn: Tổng quan lựa chọn protein và sàng lọc phối tử, chuẩn bị protein và phối tử, tiến hành mô phỏng tương tác phân tử và mô phỏng động học phân tử
Các hợp chất tiềm năng
Các đích tiềm năng Các đích chống viêm
Tổng quan: Xác định mục tiêu tìm kiếm là các đích phân tử protein chống viêm và các hợp chất hóa học từ cây xấu hổ
Chuẩn bị protein và phối tử:
Chuẩn bị protein: Protein tiềm năng sẽ được tải xuống dưới dạng cấu trúc 3D từ cơ sở dữ liệu PDB, sau đó tiến hành tối ưu hóa (loại nước, thêm hydro và điện tích Kollman) và lưu dưới dạng PDBQT
Chuẩn bị phối tử: Phối tử sau sàng lọc được tải xuống ở cấu trúc 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem dưới định dạng SDF, sau đó chuyển sang định dạng pdbqt bằng phần mềm PyMol hoặc Open Babel GUI
Mô phỏng tương tác phân tử: Protein và phối tử được đưa vào Auto Dock 4.2.6 dưới định dạng phù hợp Quá trình mô phỏng sẽ cho ra kết quả là năng lượng liên kết tự do phối tử - protein
Mô phỏng động học phân tử: Protein và phối tử được đưa vào phần mềm GROMACS 2021.4 dưới định dạng phù hợp Tiến hành quá trình chuẩn bị hệ thống và chạy mô phỏng động học phân tử trong 100ns Kết quả thu được sẽ được phân tích để tính toán Binding Free Energy, RMSD (Độ lệch), Rgyr (Bán kính xoay vòng) và RMSF (dao động).
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.1 Phương pháp tổng quan về thành phần hóa học của M pudica
Thành phần hóa học của các cây xấu hổ được thu thập từ cơ sở dữ liệu Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier với từ khóa tìm kiếm là “medicinal constituents”,
“medicinal composition”, “phytochemical”, “Chemistry”, kèm theo tên La tinh của cây Xấu hổ Mimosa pudica L
2.4.1.2 Phương pháp tổng quan về các đích chống viêm
Thông tin về các đích chống viêm được thu thập từ cơ sở dữ liệu Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier với từ khóa tìm kiếm là "pathogenetic", "target*",
"inflamm*", "inhibit*", "receptor", “asthma”, “airway” “lung” Tập trung vào những đích chống viêm tại phổi
Tiến hành quá trình mô phỏng tương tác phân tử giữa các hợp chất hóa học trong cây Xấu hổ và các đích chống viêm Quá trình mô phỏng tương tác được thực hiện qua 3 bước: lựa chọn và chuẩn bị protein; lựa chọn và chuẩn bị phối tử và mô phỏng tương tác Phần mềm Autodock 4.2.6 được chọn để mô phỏng tương tác giữa protein và hợp chất hóa học (Protein-ligand docking)
Lựa chọn và chuẩn bị protein: Các mục tiêu protein phân tử với cấu trúc xác định được thu thập từ Protein Data Bank (PDB), một cơ sở dữ liệu về cấu trúc 3D của nhiều hợp chất sinh học, trong đó có protein
Cấu trúc 3D của từng mục tiêu protein được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PDB dưới định dạng PDB, sau đó tiến hành loại các phối tử trong cấu trúc (nếu có), loại nước, thêm các nguyên tử còn thiếu (bao gồm cả nguyên tử hydro), gắn trường lực Kollman và làm tròn điện tích và được lưu dưới định dạng PDBQT
Lựa chọn và chuẩn bị phối tử: Các phối tử phù hợp ở cấu trúc 3D được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Pubchem dưới định dạng SDF Sau đó, các phối tử được đưa vào phần mềm Open Babel GUI hoặc PyMol để chuyển từ định dạng SDF sang định dạng PDBQT nhằm chuẩn bị cho quá trình Docking
Quy trình mô phỏng tương tác phân tử protein – phối tử (protein – ligand interaction) được thực hiện bởi AutodockTools 1.5.7 và Auto Dock phiên bản 4.2.6
Gridbox (hộp) được cài đặt sao cho bao trùm được trung tâm hoạt động của protein Gridbox được xác định bằng giá trị trung bình của các nguyên tử của phối tử được gắn sẵn trong protein
Các phối tử được mô phỏng các trạng thái tương tác với vùng gridbox đã chọn và cho các giá trị năng lượng liên kết khác nhau Giá trị năng lượng liên kết nhỏ nhất sẽ được chọn làm giá trị liên kết cho cặp chất đó [61] Đánh giá kết quả: Kết quả mô phỏng tương tác được đánh giá dựa trên giá trị năng lượng liên kết (binding energy) giữa phối tử và protein Năng lượng liên kết càng nhỏ (càng âm) đồng nghĩa giá trị năng lượng liên kết giữa phối tử - protein càng lớn, tương tác càng có ý nghĩa Các cặp chất có điểm docking nhỏ hơn -8.0 được coi là có ái lực liên kết lớn, mốc điểm docking này được lựa chọn sau khi tham khảo các nghiên cứu tương tự đã được tiến hành [9], [54], [62], [63], [64] Các hợp chất chống viêm tiềm năng là các hợp chất có ái lực liên kết lớn với ít nhất 1 đích chống viêm
2.4.2 Phương pháp Molecular dynamics simulation
Trong số các đích chống viêm tiềm năng, dựa vào các thông tin của các đích chống viêm tiềm năng và nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu [10], lựa chọn ra 1 đích chống viêm tiềm năng nhất để chuẩn bị tiến hành mô phỏng động lực phân tử (p38 MAPK) Tiến hành redock đích chống viêm tiềm năng được chọn với chứng dương (Adezmapimod) [54] để có mức so sánh
Hình 2.2 Cấu trúc 3D của protein p38 MAPK
Tiến hành quá trình mô phỏng động lực phân tử giữa các hợp chất hóa học trong cây Xấu hổ có ái lực liên kết lớn đích chống viêm tiềm năng p38 MAPK Quá trình mô phỏng tương tác được thực hiện qua 2 bước:
1 Molecular Dynamics Simulations: Tư thế gắn tốt nhất từ Molecular Docking sẽ được đưa vào chạy Molecular Dynamics Phức hợp Ligand-Receptor sẽ được mô phỏng bằng cách sử dụng GROMACS với trình tự sau:
Xây dựng cấu trúc GROMACS topology của protein p38 MAPK bằng amber99sb-ildn forcefield và spc/e water molecules
Xây dựng mô hình GROMACS topology của ligand bằng amberGAFF forcefield
Xây dựng mô hình topology phức hợp protein-ligand, xác định hộp dung môi và thêm các ions để trung hòa hệ thống
Tối ưu hóa năng lượng của hệ thống
Cân bằng phức hợp protein-phối tử trong hệ NVT (số hạt không đổi N, thể tích
V không đổi và nhiệt độ dao động xung quanh giá trị cân bằng)
Cân bằng phức hợp protein-phối tử trong hệ NPT (Hệ đẳng áp-đẳng nhiệt)
Chạy MDS của phức hợp protein-phối tử trong 100ns
2 Phân tích: Tính toán năng lượng liên kết tự do, RMSD (Độ lệch), Rgyr (Bán kính xoay vòng) và RMSF (độ dao động) của từng cặp chất
Năng lượng liên kết tự do được định nghĩa là sự khác biệt năng lượng tự do giữa các trạng thái liên kết và không liên kết Trạng thái không liên kết có thể là bất kỳ trạng thái nào trong đó tương tác giữa protein và phối tử là không đáng kể.[65]
Năng lượng liên kết tự do là một đại lượng quan trọng phản ánh khả năng liên kết với protein của phối tử Năng lượng liên kết tự do càng nhỏ, ái lực liên kết giữa phối tử và protein càng lớn Để tính toán năng lượng liên kết tự do, chúng ta có thể sử dụng phương pháp MM/PB(GB)SA (Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann (Generalized Born) Surface Area)
Hình 2.3 Chu trình nhiệt động lực học để tính toán năng lượng liên kết tự do
Năng lượng liên kết tự do cho một phức hợp có thể được ước tính như sau:
∆G 𝑏𝑖𝑛𝑑 = 〈𝐺 𝐶𝑂𝑀 〉 − 〈𝐺 𝑅𝐸𝐶 〉 − 〈𝐺 𝐿𝐼𝐺 〉 trong đó mỗi số hạng bên phải trong phương trình được cho bởi:
〈G x 〉 = 〈𝐸 𝑀𝑀 〉 + 〈𝐺𝑠𝑜𝑙〉 − 〈𝑇𝑆〉 Đồng thời, ∆G bind cũng có thể được biểu diễn dưới dạng:
∆G bind = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆 Trong đó ∆𝐻 tương ứng với entanpy của liên kết và −𝑇∆𝑆 tương ứng với entropy cấu trúc sau khi liên kết phối tử Khi loại bỏ entropic, giá trị tính toán là năng lượng tự do hiệu dụng, thường đủ để so sánh năng lượng liên kết tự do tương đối của các phối tử liên quan với nhau ∆𝐻 có thể được phân tách thành:
= (∆E bond + ∆E angle + ∆E dihedral ) + (∆E ele + ∆E vdW )
Năng lượng tự do của pha khí (∆E MM ) được tính bởi lệnh |sander| nằm trong AmberTools package theo trường lực được sử dụng trong mô phỏng MD
∆G sol thì được tính như sau: ∆G sol = ∆G pol + ∆G non−pol = ∆G PB/GB + ∆G non−pol Trong đó: ∆G non−polar = NP TENSION ∗ ∆SASA + NP OFFSET hay,
∆G non−pol = ∆G disp + ∆G cavity = ∆G disp + (CAVITY TENSION ∗ ∆SASA + CAVITY OFFSET )
RMSD là một tham số được sử dụng để tính toán sự khác biệt giữa protein-phối tử ở vị trí ban đầu và vị trí trong quá trình mô phỏng Giá trị RMSD lớn chỉ ra rằng protein/phối tử đã di chuyển xa hơn khỏi vị trí ban đầu của nó Đặc biệt nếu giá trị RMSD của phối tử có sự nhảy đột ngột và thiết lập trạng thái cân bằng mới, có thể hiểu rằng phối tử đã rời khỏi vị trí liên kết ban đầu và gắn lại ở một vị trí mới có liên kết bền hơn trạng thái ban đầu
v là vị trí của protein/phối tử ban đầu
w là vị trí của protein/phối tử trong quá trình mô phỏng
Rgyr (Radius of Gyration) là một tham số được sử dụng để tính toán sự phân bố khối lượng hoặc năng lượng xung quanh một trục quay Rgyr đại diện cho sự nén của cấu trúc protein Giá trị Rgyr lớn có thể được hiểu là protein nở ra so với ban đầu
M = ∑ 𝑁 𝑖=1 𝑚 𝑖 là tổng khối lượng của protein có N nguyên tử
𝑁∑ 𝑁 𝑖=1 𝑟 𝑖 là trung tâm của protein có N nguyên tử
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả molecular docking
3.1.1 Danh sách các hợp chất trong Mimosa pudica L
Sử dụng phương pháp được nêu trong phần 2.4.1.1, danh sách 38 hợp chất có trong
Mimosa pudica L thu được được trình bày trong bảng sau:
STT HỢP CHẤT NHÓM TLTK
3.1.2 Danh sách các đích chống viêm
Tiến hành tìm kiếm thông tin về các mục tiêu chống viêm bằng phương pháp được mô tả trong phần 2.4.1.2 Danh sách 46 mục tiêu chống viêm được trình bày chi tiết trong bảng sau:
Bảng 3.1 Danh sách 46 đích chống viêm
STT TÊN ĐÍCH CHỐNG VIÊM NHÓM TLTK
42 Tumor Necrosis Factor Receptor-1 Death
Sử dụng phương pháp molecular docking được mô tả trong Phần 2.4.1.3, thu được kết quả mô docking của 38 hợp chất với 46 mục tiêu chống viêm Điểm docking càng nhỏ, ái lực liên kết giữa hợp chất hóa học và mục tiêu chống viêm càng mạnh Với tiêu chí năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn hoặc bằng -8.0 được coi là có ái lực liên kết lớn, chọn các hợp chất chống viêm tiềm năng bằng cách chọn các hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn hoặc bằng -8.0 với ít nhất 1 mục tiêu chống viêm mang lại kết quả trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2 Kết quả molecular docking của nhóm kinases
Bảng 3.3 Kết quả molecular docking của nhóm chemokines và cytokines
ID HỢP CHẤT BINDING FREE ENERGY (KCAL/MOL)
CCR5 CXCR2 CXCR1 CCR2 CCR1 5-LO
Bảng 3.4 Kết quả docking của nhóm phosphodiesterases
ID HỢP CHẤT BINDING FREE ENERGY (KCAL/MOL)
PDE4B PDE4A PDE4D PDE3B PDE3A
Bảng 3.5 Kết quả docking của nhóm proteases
Bảng 3.6 Kết quả docking của các đích chống viêm khác
BINDING FREE ENERGY (KCAL/MOL)
NK1R CRTH2 SIRT1 P2RX7 A2AR SHIP
Trong số 46 mục tiêu chống viêm được chọn để mô phỏng động học phân tử, 28 mục tiêu có ái lực liên kết cao với ít nhất 1 hợp chất Danh sách tên protein và số lượng tương tác mạnh của 28 mục tiêu tiềm năng được trình bày trong Hình 3.1
Hình 3.1 Danh sách tất cả protein có ít nhất 1 tương tác ái lực cao
Trong số 38 hợp chất đã được đem vào docking, 31 hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn -8.0 kcal /mol cho ít nhất 1 đích chống viêm, được phân thành 4 nhóm cấu trúc và được trình bày trong bảng sau:
Epidermal Growth Factor Receptor tyrosine kinase domain p38 alpha HUMAN PHOSPHODIESTERASE 3B
Human Phosphodiesterase 4B Neurokinin 1 receptor (Substance P receptor)
PDE4A PDE3A-SLFN12 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1 prostaglandin D2 receptor CRTH2 Human Phosphodiesterase 4D P2X PURINOCEPTOR 7 HUMAN A2a Receptor CCR5 Chemokine Receptor soluble epoxide hydrolase human CXC chemokine receptor 2
ROCK 1 ROCK2 human SHIP SH2 domain Stable-5-Lipoxygenase human CXCR1 in phospholipid bilayers
Cathepsin-G human Vasoactive intestinal polypeptide receptor 2 human Macrophage Elastase MMP-12 Human CCR2 Membrane-Proximal C-Terminal Region…
G6PD HUMAN PROCATHEPSIN S Apo CCR1-Gi complex
SỐ TƯƠNG TÁC ÁI LỰC CAO
Bảng 3.7 Phân nhóm của các hợp chất chống viêm tiềm năng
Cassiaoccidentalin B, Apigenin-7-O-β-D-glucosid, 2’’-O-rhamnosyl orientin, Rhamnosylisoorientin, 2’-hydroxy flavon, Isoquercitrin, Orientin, Avicularin, Quercetin, Isoorientin 2’'-O- rhamnoside, Isoorientin, 6-hydroxy flavon, Catechin, 7’,3’,4’-trihydroxy-3,8-dimethoxy flavon, 2’-hydroxy flavanon, Apigenin, Luteolin, Butin, echinaticin, 3-methylquercetin
Ergosterol, Stigmasterol, Beta-Sitosterol, α- spinasterol, Betulinic acid, Stigmastanol, Ergosterol peroxide
3 ACID HỮU CƠ Acid abscisic, Crocetin
Kết quả molecular dynamics simulation
Sử dụng phương pháp được mô tả trong phần 2.4.2, trong số 46 đích chống viêm được sàng lọc bằng docking phân tử (Bảng 3.3.), Dịch chiết xuất toàn cây của Mimosa pudica có thể ức chế đích chống viêm p38 MAPK in vitro, theo một nghiên cứu mới được công bố của nhóm nghiên cứu [10] Do đó, khóa luận này đã chọn đích chống viêm p38 MAPK để tiến hành phân tích mô phỏng động lực học phân tử để tìm ra các hợp chất tạo ra tác dụng ức chế p38 MAPK trong Mimosa pudica Để chuẩn bị cho phân tích, tiến hành re-dock đích chống viêm p38 MAPK với chất chuẩn - chứng dương đã có tác dụng ức chế p38 MAPK là Adezmapimod [54] Kết quả thu được danh sách 15 hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn chứng dương, kết quả được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.8 danh sách 15 hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn chứng dương STT HỢP CHẤT
BINDING FREE ENERGY (KCAL/MOL)
Nhận xét: Kết quả mô phỏng tương tác phân tử với đích p38 MAPK của chứng dương (Adezmapimod) là -8.673, nhỏ hơn -8.0 và như vậy được coi là có ái lực liên kết lớn Như vậy mốc điểm docking -8.0 được chọn là phù hợp
Sử dụng phương pháp đã mô tả ở mục 2.4.2, tiến hành mô phỏng động lực phân tử với
15 chất trong cây Xấu hổ có ái lực liên kết lớn nhất với p38 MAPK Kết quả thu được trình bày trong bảng sau:
NĂNG LƯỢNG LIÊN KẾT TỰ DO
Bảng 3.9 Kết quả molecular dynamics simulation
BINDING FREE ENERGY (KCAL/MOL)
Nhận xét: Có thể nhận thấy sự khác nhau về kết quả năng lượng liên kết tự do giữa
2 phương pháp docking phân tử và mô phỏng động lực phân tử Sự sai khác này là do trong mô phỏng động lực phân tử đã tính toán tới các ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và áp suất Như vậy năng lượng liên kết tự do được tính toán bằng phương pháp mô phỏng động lực phân tử sẽ chính xác hơn và đánh giá được sự ổn định của các hợp chất trong môi trường sinh lý và sự tương tác lâu dài của chúng với các mục tiêu protein
Trong số 15 chất tiến hành mô phỏng động lực phân tử với đích chống viêm tiềm năng p38α MAPK, có 7 chất cho kết quả có ái lực liên kết (năng lượng liên kết tự do nhỏ) với đích chống viêm p38α MAPK lớn hơn ái lực liên kết của chứng dương, bao gồm: cassiaoccidentalin B, ergosterol peroxide, ergosterol, luteolin, α-spinasterol, stigmastanol, catechin Trong 7 chất đó, chất có ái lực liên kết lớn nhất là catechin và chất có ái lực liên kết nhỏ nhất là ergosterol peroxide Trong số 7 chất đó, có 3 chất là Flavonoids và 4 chất là các Phytosterol (Bảng 3.10)
Bảng 3.10 Phân nhóm các hợp chất có ái lực liên kết lớn với p38 MAPK
2 PHYTOSTEROLS Ergosterol peroxide, Ergosterol, α- spinasterol, Stigmastanol
Nhận xét: Mặc dù nhìn qua có thể thấy rằng số lượng hợp chất thuộc nhóm phytosterol nhiều hơn flavonoid, nhưng trong nhóm flavonoid, chúng ta có hợp chất ái lực liên kết mạnh nhất, đó là catechin; Trong khi trong nhóm phytosterol, chúng ta có ái lực liên kết yếu nhất trong số 7 hợp chất, đó là ergosterol peroxide Để nghiên cứu sâu hơn về động học của tương tác giữa các hợp chất tiềm năng và đích p38 MAPK, khóa luận đã tiến hành phân tích các thông số RMSD, Rgyr và RMSF của
7 hợp chất tiềm năng Kết quả được trình bày dưới đây:
RMSD - ROOT MEAN SQUARE DEVIATION:
Hình 3.2 RMSD của các hợp chất tiềm năng
Nhận xét: RMSD - độ lệch bình phương trung bình gốc là thước đo tính di động của chất trong quá trình mô phỏng Như vậy các giá trị RMSD lớn sẽ được hiểu là có sự mất ổn định nghiêm trọng liên quan đến thay đổi trong cấu trúc của phân tử RMSD của protein dưới 0,35 nm và RMSD của phối tử dưới 0,2 nm có thể được coi là ổn định trong quá trình mô phỏng [108], [109]
Có thể thấy rằng tất cả các protein, ngoại trừ ergosterol peroxide, đều có RMSD dưới ngưỡng 0,35nm Đối với RMSD của các phối tử, RMSD của catechin, stigmastanol, luteolin và α-spinasterol ổn định dưới 0,2 nm trong khi 4 hợp chất còn lại có RMSD dao động quanh mốc 0,2 nm
Hình 3.3 Rgyr của các hợp chất tiềm năng
Nhận xét: Rgyr – radius of gyration đo lường khoảng cách của các phần tử trong protein đến trọng tâm của nó Rgyr là một tham số đại diện cho "sự nén" của cấu trúc protein trong quá trình mô phỏng Một biến động lớn trong Rgyr có thể chỉ ra rằng protein đang trải qua những thay đổi đáng kể về hình dạng [110] Rgyr ổn định dưới 2.3 nm có thể coi là protein có cấu trúc ổn định [108]
Có thể thấy rằng Rgyr của ergosterol peroxide và stigmastanol thay đổi đáng kể so với các hợp chất khác Phức hợp stigmastanol - p38 MAPK có Rg không ổn định trong suốt thời gian mô phỏng, đạt cực đại ở 10ns với 2.30nm trước khi giảm xuống đáy 2.175nm ở 40 ns và đạt cực đại khác 2.275nm ở 60 ns
Giá trị Rg của phức hợp Ergosterol peroxide - p38 MAPK cũng không ổn định trong suốt thời gian mô phỏng Nó đạt cực đại ở 10ns với 2,35nm trước khi giảm xuống 2,20nm ở 60ns
RMSF - ROOT MEAN SQUARE FLUCTUATION:
Hình 3.4 RMSF của các hợp chất tiềm năng
Nhận xét: RMSF - Biến động bình phương trung bình gốc là một thông số đặc trưng cho mức độ dao động của từng axit amin trong protein RMSF tính toán sự biến động của từng axit amin trong protein, từ axit amin 1 đến axit amin cuối cùng (axit amin 366) RMSF được sử dụng để hiểu rõ hơn về tính ổn định của các axit amin trong protein
Về độ linh hoạt của các phần tử trong protein, hầu hết tất cả các axit amin đều có giá trị ΔRMSF dưới 0,3nm Giá trị RMSF của tất cả các axit amin dao động trong phạm vi 0,15-0,40 nm trong toàn bộ thời gian mô phỏng với cùng một mô hình.
Bàn luận
3.3.1 Về kết quả molecular docking
Khóa luận đã xác định thành công 38 hợp chất trong Mimosa pudica L., bao gồm flavonoid, ancaloit, axit hữu cơ và các hợp chất phenolic Khóa luận này cũng cung cấp thông tin về 46 mục tiêu chống viêm, đặc biệt tập trung vào những mục tiêu liên quan đến viêm tại phổi
Khóa luận này đã sử dụng docking phân tử để dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất trong Mimosa pudica L trên nhiều đích chống viêm khác nhau, thu được danh sách 31 hợp chất chống viêm tiềm năng (Bảng 3.7.), Phần lớn trong số đó là flavonoid và phytosterol Như vậy, khóa luận đã hoàn thành mục tiêu đầu tiên: "Phát hiện được
40 các hợp chất có tiềm năng chống viêm từ cây Xấu hổ bằng phương pháp docking phân tử."
Khóa luận cũng tổng quan thông tin của 46 mục tiêu protein có tác dụng chống viêm được chứng minh bởi các nghiên cứu in silico, in vitro và in vivo trước đó Thông qua sàng lọc khả năng liên kết giữa protein và phối tử, 28 mục tiêu chống viêm tiềm năng có khả năng liên kết đáng kể với nhiều hợp chất trong Mimosa pudica đã được tìm thấy
Trong tất cả các nhóm mục tiêu đó, Mimosa pudica L tương tác nhiều nhất với nhóm kinase, nhóm phosphodiesterase và nhóm cytokine và chemokine Nhóm protease tương tác ít nhất với Mimosa pudica L khi mỗi mục tiêu trong nhóm có ít hơn 10 hợp chất có tương tác mạnh
Viêm là một phản ứng quan trọng trong cơ thể và có thể xảy ra bởi nhiều cơ chế và liên quan đến nhiều mục tiêu Do đó, việc tác dụng đồng thời trên nhiều mục tiêu chống viêm sẽ giúp ức chế quá trình viêm hiệu quả hơn, mang lại giá trị cho người bệnh
Liên quan đến các nghiên cứu khác đã tiến hành trước đó, trong số 31 hợp chất chống viêm tiềm năng, các hợp chất quercetin, isoquercetin, isoorientin, apigenin, beta- sitosterol, stigmasterol và luteolin là những hợp chất đã cho thấy tiềm năng trong điều trị hen suyễn bằng trên thực nghiệm Trong đó quercetin làm giảm viêm đường thở do hen suyễn thông qua việc ngăn chặn con đường TGF-β1/Smad [111], [112] Isoorientin cải thiện hen suyễn do ovalbumin trong mô hình hen suyễn ở chuột [113] Apigenin làm giảm viêm đường thở trong hen suyễn dị ứng thông qua con đường MAPK [114] β- Sitosterol ức chế viêm liên quan đến hen suyễn do ovalbumin [115] Stigmasterol làm giảm viêm đường thở dị ứng và tăng đáp ứng đường thở ở chuột hen suyễn[116] và luteolin làm giảm hen suyễn bằng cách ức chế con đường MAPK [117]
3.3.2 Về kết quả molecular dynamics simulations
Về mô hình động lực học phân tử, khóa luận đã chọn mục tiêu p38 MAPK để tiến hành nghiên cứu động học phân tử vì các nguyên nhân chính sau:
MAPK p38 có đóng góp đáng kể vào quá trình viêm, sinh bệnh học của hen suyễn p38 MAPK điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều gen viêm, chẳng hạn như cytokine TNF-α, IL-6 và IL-1β, và chemokine IL-8, có liên quan đến bệnh hen suyễn
Một số nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra hiệu quả của thuốc ức chế p38 MAPK ở bệnh nhân COPD
Trong một nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu, Dịch chiết toàn phần Mimosa pudica L đã chứng minh khả năng ức chế p38 MAPK in vitro
MAPK p38 là một trong những mục tiêu có nhiều tương tác có ái lực liên kết cao với các hợp chất trong Mimosa pudica L
Khóa luận đã chọn 15 hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn chứng dương để tiến hành mô phỏng động lực học phân tử với p38 MAPK Để tính toán ái lực liên kết giữa phối tử và protein, khóa luận đã tính toán tổng năng lượng liên kết tự do bằng phương pháp MM/PBSA Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.9 Khóa luận đã tìm thấy
7 hợp chất tiềm năng có ái lực liên kết lớn với mục tiêu MAPK p38, đó là: cassiaoccidentalin B, luteolin, catechin, ergosterol peroxide, ergosterol, α-spinasterol và stigmastanol 7 hợp chất này thuộc 2 nhóm cấu trúc: flavonoid và phyto-steroid
Sau đó, khóa luận này đã tính toán một số thông số động học như RMSD, RMSF và Rgyr để tìm hiểu thêm về tính ổn định của các tương tác đó và xác định các hợp chất tiềm năng nhất
RMSD - root mean square deviation: Một giá trị RMSD lớn thể hiện sự thay đổi lớn trong quá trình mô phỏng Một giá trị RMSD lớn sẽ được liên kết với sự mất ổn định nghiêm trọng, liên quan đến những thay đổi trong cấu trúc của phân tử Trong Hình 3.2., chúng ta có thể quan sát thấy rằng protein của tất cả các phức hợp duy trì giá trị RMSD thấp trong suốt quá trình mô phỏng, ngoại trừ ergosterol peroxide
Khóa luận cũng tính toán các giá trị RMSD cho mỗi phối tử Kết quả cho thấy catechin, stigmastanol, luteolin và α-spinasterol có RMSD ổn định < 0,2 nm (Hình 3.2), thể hiện sự ổn định của liên kết trong suốt quá trình mô phỏng
Rgyr - bán kính xoay vòng là một tham số khác đo lường sự thay đổi của protein trong quá trình mô phỏng Độ nén của cấu trúc protein được đặc trưng bằng Rgyr Một giá trị Rgyr lớn có thể được hiểu là protein đang "mở rộng", có thể dẫn đến việc mở vị trí hoạt động, làm giảm sự ức chế của phối tử Trong Hình 3.3, tất cả các phức hợp đều mang lại quỹ đạo Rgyr ổn định, ngoại trừ stigmastanol và ergosterol peroxide
RMSF - Biến động bình phương trung bình gốc: Ảnh hưởng của từng axit amin đối với sự thay đổi cấu trúc của protein được nghiên cứu qua thông số RMSF, trong đó các đỉnh riêng lẻ biểu thị các vùng dao động nhất của protein trong quá trình mô phỏng Kết quả được thể hiện trong Hình 3.3., giá trị RMSF của tất cả các axit amin dao động trong phạm vi 0,15-0,40 nm trong toàn bộ thời gian mô phỏng với cùng một mô hình Trong protein có sự thay đổi tương đối lớn ở ba vùng, đó là: axit amin 100–110, axit amin 170–
