bùi quốc bảo sử dụng docking phân tử để đánh giá tiềm năng chống viêm của một số hợp chất phân lập từ cây xấu hổ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI QUỐC BẢO

SỬ DỤNG DOCKING PHÂN TỬ ĐỂ ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG CHỐNG VIÊM

CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP

TỪ CÂY XẤU HỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI QUỐC BẢO

MÃ SINH VIÊN: 1901066

SỬ DỤNG DOCKING PHÂN TỬ ĐỂ ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG CHỐNG VIÊM

nghệ N2TP

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, với sự kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn

chân thành đến TS Phạm Tuấn Anh – giảng viên bộ môn Dược liệu, Trường Đại học

Dược Hà Nội Thầy là người truyền cảm hứng, luôn sẵn lòng dành thời gian và công sức để chỉ dạy cũng như luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Khóa luận này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ của thầy

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới anh Ths Đỗ

Ngọc Tuấn, giám đốc công ty TNHH giải pháp công nghệ N2TP Anh là người thầy đã

không ngừng đồng hành và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Sự hướng dẫn và giúp đỡ của anh đã đóng góp một phần quan trọng không thể thiếu trong hành trình hoàn thiện khóa luận của tôi Tôi tin chắc rằng, những kiến thức và kinh nghiệm mà anh truyền đạt sẽ là bước đệm vững chắc cho tôi trên con đường sự nghiệp dược sĩ trong tương lai

Tôi cũng muốn gửi lời tri ân đến TS Nguyễn Quỳnh Chi, Phó trưởng bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội và TS Phạm Đức Vịnh, giảng viên bộ môn

Dược Lý, Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô đã luôn sẵn lòng giúp đỡ, đưa ra những lời khuyên hữu ích và giải đáp mọi thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô, anh chị em đang công tác tại bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả các bạn sinh viên đang học tập và nghiên cứu tại bộ môn đã luôn sát cánh cùng tôi, hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu Lời cảm ơn chân thành cũng được gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại Học Dược Hà Nội, cùng các phòng ban và toàn thể quý thầy cô giáo đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi muốn dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, bạn bè và những người thân yêu Sự ủng hộ và động viên của mọi người đã giúp tôi vượt qua những khó khăn trong học tập, nghiên cứu và cuộc sống Tôi xin chân thành cảm ơn!

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những nhận xét và góp ý từ các thầy cô và bạn bè để khóa luận được thêm phần hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn.[1][2][3], [4][5], [6][7]

Hà Nội, tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Bảo Bùi Quốc Bảo

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY XẤU HỔ (MIMOSA PUDICA L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại của Mimosa pudica L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái 2

1.1.3 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L 2

1.1.4 Tổng quan về tác dụng sinh học của Mimosa pudica L 8

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐÍCH CHỐNG VIÊM TRONG HEN SUYỄN 9

1.2.1 Giới thiệu bệnh hen suyễn 9

1.2.2 Các nhóm đích tác dụng chống viêm 9

1.2.3 Tổng quan về đích chống viêm p38 MAPK 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC IN SILICO 12

1.3.1 Phương pháp Molecular docking 12

1.3.2 Phương pháp Molecular dynamics simulations 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Cơ sở dữ liệu 16

2.1.2 Phần mềm 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Molecular docking 18

2.4.1.1 Phương pháp tổng quan về thành phần hóa học của M pudica 18

2.4.1.2 Phương pháp tổng quan về các đích chống viêm 18

2.4.1.3 Phương pháp Molecular docking 18

2.4.2 Phương pháp Molecular dynamics simulation 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả molecular docking 24

3.1.1 Danh sách các hợp chất trong Mimosa pudica L 24

3.1.2 Danh sách các đích chống viêm 25

3.1.3 Kết quả docking 27

3.2 Kết quả molecular dynamics simulation 32

3.3 Bàn luận 39

3.3.1 Về kết quả molecular docking 39

3.3.2 Về kết quả molecular dynamics simulations 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease CXC Cysteine Amino Acid Residues

FEV1 Forced Expiratory Volume

IC50 Half-Maximal Inhibitory Concentration

IK-kB Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa-B

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MDS Molecular Dynamics Simulation MM/PB(GB)SA Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann (Generalized Born)

Surface Area NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NF-kB Nuclear Factor Kappa B

NLRP3 Nucleotide-Binding Domain, Leucine-Rich Repeat Family Pyrin

Domain Containing 3 NPT Conserved Substance (N), Pressure (P) And Temperature (T) NVT Conserved Substance (N), Volume (V) And Temperature (T)

RMSD Root Mean Square Deviation RMSF Root Mean Square Fluctuation TDI Transition Dyspnoea Indices TNF-alpha Tumor Necrosis Factor-Alpha

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách 46 đích chống viêm 25

Bảng 3.2 Kết quả molecular docking của nhóm kinases 27

Bảng 3.3 Kết quả molecular docking của nhóm chemokines và cytokines 28

Bảng 3.4 Kết quả docking của nhóm phosphodiesterases 29

Bảng 3.5 Kết quả docking của nhóm proteases 29

Bảng 3.6 Kết quả docking của các đích chống viêm khác 30

Bảng 3.7 Phân nhóm của các hợp chất chống viêm tiềm năng 32

Bảng 3.8 danh sách 15 hợp chất có năng lượng liên kết tự do nhỏ hơn chứng dương 33 Bảng 3.9 Kết quả molecular dynamics simulation 34

Bảng 3.10 Phân nhóm các hợp chất có ái lực liên kết lớn với p38 MAPK 35

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các hợp chất trong Mimosa pudica L 8

Hình 1.2 Con đường tín hiệu p38 MAPK và phản ứng viêm qua trung gian 11

Hình 1.3 Adezmapimod 12

Hình 1.4 Metergoline 12

Hình 1.5 Withaphysacarpin 12

Hình 1.6 MDS trong quá trình tìm kiếm và phát triển thuốc mới 14

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 17

Hình 2.2 Cấu trúc 3D của protein p38 MAPK 20

Hình 2.3 Chu trình nhiệt động lực học để tính toán năng lượng tự do ràng buộc 21

Hình 3.1 Danh sách tất cả protein có ít nhất 1 tương tác ái lực cao 31

Hình 3.2 RMSD của các hợp chất tiềm năng 36

Hình 3.3 Rgyr của các hợp chất tiềm năng 37

Hình 3.4 RMSF của các hợp chất tiềm năng 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Xấu hổ hay còn được gọi là cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.), là một loài cây

bụi bản địa ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Loài cây này đã được nghiên cứu và đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như kháng khuẩn, cường dương, giải lo âu, chống trầm cảm [8], [9] và đặc biệt là có đặc tính chống viêm [10] Đặc biệt, cây Xấu hổ còn có tác dụng chữa hen, giảm co thắt, trị xơ phổi [6], [10], [11] - một dạng biến chứng nguy hiểm từ covid-19 Một nghiên cứu ban đầu của nhóm nghiên

cứu đã cho thấy chiết xuất nước từ Mimosa pudica thể hiện tác dụng chống viêm và có

thể là một lựa chọn hữu ích trong các bệnh lý liên quan đến phổi [10] Hen phế quản là một bệnh đường thở rất phổ biến đặc trưng bởi viêm hô hấp mãn tính So với các bệnh mãn tính khác, tỷ lệ tử vong do hen suyễn tương đối thấp, nhưng chi phí do hen suyễn gây ra khá cao Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh hen phế quản chiếm 3.9% dân số, tương đương khoảng 4 triệu người [12] Các liệu pháp điều trị hen phế quản hiện nay phụ thuộc rất nhiều vào corticosteroid dạng hít dùng dài ngày và có nhiều tác dụng phụ Do đó, cần thiết phải tìm kiếm một loại thuốc bổ sung và thay thế trong điều trị hen suyễn Với sự tiến bộ của sinh học phân tử, hiện nay trong việc phát hiện ra các loại thuốc mới liên quan đến hen phế quản, 6 nhóm đối tượng chính đã được phát hiện và phân loại, bao gồm: 1/mục tiêu điều hòa các chất trung gian gây viêm, 2/các đích protease, 3/ức chế các đích kinase 4/phosphodiesterase-4 và một số mục tiêu khác

Hướng tới điều trị hen phế quản đa mục tiêu, Mimosa pudica L nổi lên như một loại

dược liệu tiềm năng trong điều trị hen suyễn [6], [10], [11] Câu hỏi đặt ra là, hợp chất nào trong Mimosa pudica L tạo ra tác dụng điều trị hen phế quản đó?

Để trả lời câu hỏi đó, molecular docking - một kỹ thuật mô phỏng với mục đích sàng lọc các hợp chất tiềm năng bằng cách dự đoán khả năng liên kết của protein và phối tử mà không cần tiến hành thí nghiệm - sẽ được sử dụng để nghiên cứu về các cơ

chế và hợp chất gây ra tác dụng chống viêm của Mimosa pudica L Do đó, khóa luận

"Sử dụng docking phân tử để đánh giá tiềm năng chống viêm của một số hợp chất phân lập từ cây xấu hổ" được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Phát hiện được các hợp chất có tiềm năng chống viêm từ cây Xấu hổ bằng

phương pháp docking phân tử

2 Phân tích động học phân tử (Molecular Dynamics) để xác định độ ổn định và

hiệu quả của các hợp chất có tiềm năng chống viêm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY XẤU HỔ (MIMOSA PUDICA L.) 1.1.1 Vị trí phân loại của Mimosa pudica L

Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae) Bộ: Đậu (Fabales)

Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)

Chi: Mimosa

Loài: Mimosa pudica L [2]

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây xấu hổ còn có tên gọi khác là cây mắc cỡ, cây thẹn, cây trinh nữ [1] Cây nhỏ, mọc hoang bản địa ở Việt Nam, thân có gai hình móc Lá 2 lần kép lông chim, cụp xuống khi động vào Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, xếp giống như

hình chân vịt, có lông trắng cứng Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống [1]

Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1.5mm Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đấu tròn, màu tím hồng; đài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn [1]

1.1.2.2 Phân bố, sinh thái

Chi Mimosa có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á Ở Việt Nam có 4 loài, trong đó có cây Xấu hổ (M pudica

L.) Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi độ cao dưới 1000m.[5]

1.1.3 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L

Trong cây Xấu hổ đã xác định sự có mặt của một số nhóm chất sau: Flavonoid, alcaloid, terpenoid, các hợp chất phenol, saponin, tannin, các acid hữu cơ và acid amin [13]

FLAVONOID

C-glycosid flavonoid

rhamnopyranosyl-(1→2)β-D-

5,7,3’,4’-tetrahydroxyl-6-C-[α-L-glucopyranosyl flavon [14]

rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosyl

7,8,3’,4’-tetrahydroxyl-6-C-[α-L-flavon [14]

2’’-O-rhamnosyl orientin [15] Isoorientin 2''-O-rhamnoside [15]

Cassiaoccidentalin B [13], [16]

5,7,3’,4’-tetrahydroxyl-6-C-[β-D-apiose-(1→4)]-β-D-glucopyranosyl flavon [17], [18]

glucopyranosyl flavon [17], [19]

5,7,4’-trihydroxy-8-C-β-Z-(1→ 2) β-D-glucopyranosyl flavon [14]

5,7,4’-trihydroxy-8-C-[α-L-rhamnopyranosyl-Isoorientin [13], [18]

5,7,3’,4’-tetrahydroxyl-8-C-[β-D-apiose-(1→4)]-β-D-glycopyranosyl flavon [20]

rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-

6,7,3’,4’-tetrahydroxyl-8-C-[α-L-glucopyranosyl flavon [20]

Orientin [13], [18]

O-glycosid flavonoid

Isoquercitrin [13] Avicularin [13], [21] Apigenin-7-O-β-D-glucosid

[13], [22]

Flavonoid aglycon

2’-hydroxy flavon [23] 6-hydroxy flavon [23]

7’,3’,4’-trihydroxy-3,8-dimethoxy flavon [22] Catechin [23]

Acid caffeic [23] Acid p-hydroxy benzoic [23]

Acid gallic [13], [23] Ethyl gallat [23]

Acid chlorogenic [23]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các hợp chất trong Mimosa pudica L

1.1.4 Tổng quan về tác dụng sinh học của Mimosa pudica L

Nhiều nghiên cứu về Mimosa pudica L tác dụng sinh học đã được thử nghiệm và các nhà khoa học đã chỉ ra rằng Mimosa pudica L có một số tác dụng như: chữa lành

vết thương [28], chống co giật [29], điều trị tiểu đường [30], kháng khuẩn [31]; dịch

chiết ethanol lá của Mimosa pudica L có tác dụng giảm đau và chống viêm [32], [33], tác dụng bảo vệ gan [34], và chống tiêu chảy [35], Ngoài ra, ở Cameroon, Mimosa pudica L được sử dụng để điều trị chứng mất ngủ, động kinh, lo lắng và kích động [36]

Các tác dụng khác như: Chất chống oxy hóa [34], [37], kháng nọc độc rắn [38], chống

sốt rét [39], cũng được tìm thấy trên Mimosa pudica L Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Mimosa pudica L có tác dụng chống

viêm tại phổi [6], Điều trị hen phế quản [7] Trên mô hình viêm phổi với Sephacryl

S-200, chiết xuất nước Mimosa pudica L (liều 2.8g / kg trọng lượng cơ thể của chuột) có

tác dụng chống viêm rõ ràng; giảm đáng kể trọng lượng phổi, giảm số lượng bạch cầu ái toan trong dịch rửa phế quản phế nang so với nhóm chứng bệnh Tác dụng giảm trọng lượng phổi và giảm số lượng bạch cầu ái toan trong dịch rửa phế quản phế nang của

Mimosa pudica L chiết xuất nước tương đương với tác dụng của dexamethasone

(0.5mg/kg) [6] Trong một nghiên cứu tại Việt Nam, kết quả cho thấy chiết xuất nước và chiết xuất

ethanol của Mimosa pudica L (5.6g/kg trọng lượng khô) đều có tác dụng ức chế mạnh

phản ứng co thắt phế quản do histamine gây ra Tác dụng này tương đương với diphenhydramine (liều 2mg / kg) và aminophylline (liều 6mg / kg) [7]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐÍCH CHỐNG VIÊM TRONG HEN SUYỄN 1.2.1 Giới thiệu bệnh hen suyễn

Hen suyễn là một bệnh lý đa dạng, đặc trưng bởi viêm đường thở mãn tính Bệnh được xác định bởi tiền sử các triệu chứng hô hấp như thở khò khè, thở nông, tức ngực và ho Những triệu chứng này thay đổi theo thời gian và cường độ, cùng với sự hạn chế luồng khí thở ra [40]

Cơ chế bệnh sinh của hen suyễn rất phức tạp và có nhiều cơ chế, nhưng cơ chế viêm đường thở là quan trọng nhất Viêm đường thở là một triệu chứng phổ biến cho tất cả các dạng hen suyễn Viêm đường thở trong hen phế quản gồm 3 giai đoạn: Viêm cấp tính – Viêm mạn tính – Tái tạo lại cấu trúc đường thở Có nhiều tế bào và yếu tố liên quan đến viêm đường thở trong hen suyễn, chẳng hạn như cytokine, các yếu tố hóa ứng động, yếu tố tăng trưởng và các phân tử bám dính (adhesion molecules) Tùy thuộc vào giai đoạn phản ứng viêm đường thở, các tế bào khác nhau được tuyển dụng từ máu vào đường thở Một số mục tiêu có thể có trong điều trị hen phế quản được trình bày dưới đây:

1.2.2 Các nhóm đích tác dụng chống viêm Hướng tới các chất trung gian gây viêm

Các chất trung gian gây viêm đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch của cơ thể Chúng là những chất được giải phóng bởi các loại tế bào khác nhau để đáp ứng với nhiều kích thích khác nhau và chịu trách nhiệm thúc đẩy hoặc ức chế viêm [41],

[42] Một số đích chống viêm như ức chế receptor cytokine, ức chế receptor chemokine, ức chế NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), ức chế IL-1 beta và TNF-alpha

Hướng tới các proteases

Protease là các enzyme xúc tác cho sự phân hủy protein thành các peptide hoặc axit amin nhỏ hơn Chúng đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, bao gồm cả phản ứng viêm [43] Một số đích có thể hướng tới là human neutrophil elastase, Proteinase 3 (PR3), cathepsin G và matrix metalloproteinase (MMP)

Hướng tới ức chế các kinases

Hơn 500 gen kinase đã được xác định ở người và kinase đóng vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tăng sinh tế bào, chết theo chu trình và phản ứng viêm Một số đích có thể hướng tới là ức chế IKKβ, ức chế p38 MAPK, ức chế Phosphoinositide-3-kinase và ức chế Epidermal growth factor receptor

Hướng tới ức chế các Phosphodiesterase-4 (PDE4)

Phosphodiesterase (PDEs) được mã hóa bởi 21 gen để tạo ra hơn 100 đồng dạng khác nhau và có thể được chia thành 11 họ isozyme (PDE1−11) PDE4, một trong những họ PDE đặc biệt xúc tác cho sự thoái hóa của cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate (cAMP), qua đó thúc đẩy quá trình viêm Một đích có thể hướng tới trong là ức chế PDE4B

1.2.3 Tổng quan về đích chống viêm p38 MAPK

p38 MAPK đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm vì nó là một phần thiết yếu trong việc sản xuất các chất trung gian gây viêm [44] Họ MAPK p38 bao gồm bốn đồng dạng, trong đó p38α được cho là chủ yếu điều chỉnh quá trình viêm [44] p38 có thể hoạt hóa yếu tố phiên mã NF-kB NF-kB được hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa và phân hủy protein ức chế IkB, sau đó NF-kB có thể xâm nhập vào nhân và liên kết với vị trí gắn kết cụ thể trong gen phụ thuộc NF-kB (Hình 1.2) và kích hoạt tăng sinh các chất trung gian gây viêm [45] Vì vậy, việc ngăn chặn tín hiệu MAPK p38 giúp giảm giải phóng chất trung gian gây viêm và do đó ngăn chặn phản ứng viêm [44]

Hình 1.2 Con đường tín hiệu p38 MAPK và phản ứng viêm qua trung gian

MAPK p38 có liên quan mật thiết tới cơ chế bệnh sinh của hen phế quản Mức độ phosphoryl hóa p38 MAPK trong các tế bào biểu mô tăng đáng kể trong đường thở của bệnh nhân hen suyễn nặng so với ở bệnh nhân hen suyễn nhẹ và nhóm chứng không bệnh [46] Đại thực bào phế nang từ bệnh nhân hen suyễn nặng cho thấy tăng kích hoạt p38 MAPK và không nhạy cảm với corticosteroid [47] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất hiệu quả của các sản phẩm tự nhiên trong các mô hình động vật bị hen suyễn do ức chế p38 MAPK [48], [49], [50]

Trong một số thử nghiệm lâm sàng, ức chế p38 MAPK đã được quan sát thấy như một chiến lược điều trị tiềm năng cho bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) [45], [51], [52], [53] Thuốc ức chế p38 cải thiện các thông số chức năng phổi chính và giảm bớt khó thở ở bệnh nhân COPD, như được đánh giá thông qua các phép đo như thể tích thở ra cưỡng bức mỗi giây (FEV1), dung tích sống cưỡng bức (FVC) và chỉ số khó thở chuyển tiếp (TDI) [52]

Trong một nghiên cứu gắn kết với đích p38 MAPK, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Chennu MM Prasada Rao đã tiến hành nghiên cứu về các chất ức chế p38 MAPK tiềm năng [54] Nghiên cứu đã tiến hành docking phân tử 1172 hợp chất tiềm năng với đích p38 MAPK và so sánh với chất chuẩn đã được chứng minh tác dụng ức chế p38 MAPK là Adezmapimod (hình 1.3.), sau đó lựa chọn các hợp chất có ái lực liên kết cao để tiến hành nghiên cứu mô phỏng động lực phân tử [54] Nghiên cứu kết luận 2 hợp chất metergoline và withaphysacarpin có ái lực cao với p38α MAPK [54]

Hình 1.3 Adezmapimod

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC IN SILICO

1.3.1 Phương pháp Molecular docking

Molecular docking là một phương pháp tính toán được sử dụng trong phát triển thuốc mới và các lĩnh vực sinh học phân tử khác, kỹ thuật này liên quan đến việc mô phỏng tương tác giữa hai phân tử - thường là protein và một phân tử nhỏ được gọi là phối tử (ligand) Mục tiêu là dự đoán hướng và cấu tạo của phối tử tạo ra phức hợp ổn định nhất với protein [55] Có hai loại docking chính: cứng và linh hoạt, trong đó lắp ghép cứng giả định rằng các phân tử là có hình dạng không thay đổi trong quá trình lắp ghép

Tuy nhiên, trong thực tế, quá trình tương tác giữa phối tử và protein diễn ra một cách linh hoạt, chúng có thể thay đổi hình dạng để phù hợp tốt nhất với nhau Do đó các nhà khoa học đã đề xuất mô hình lắp ghép linh hoạt, cho phép các phối tử thay đổi hình dạng trong quá trình lắp ghép (docking) Mô hình này có khả năng tiếp cận gần nhất với trạng thái tự nhiên của phân tử và dự đoán được trạng thái kết hợp ổn định nhất

Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu và đã thành công trong việc dự đoán sự tương tác giữa thuốc và protein mục tiêu [4], [56]

Kỹ thuật mô phỏng tương tác phân tử cho phép mô tả hoạt động của phối tử trong vùng hoạt động của protein (đã được xác định tọa độ) mục tiêu cũng như làm sáng tỏ các quy trình hóa sinh cơ bản ở mức độ phân tử Kết quả quá trình mô phỏng tương tác phân tử thể hiện dựa qua giá trị năng lượng liên kết “binding energy” Năng lượng liên kết càng nhỏ thể hiện ái lực liên kết giữa phối tử và protein càng lớn

Tuy là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi vì tính nhanh và tiết kiệm chi phí, mô phỏng tương tác phân tử vẫn có những khó khăn riêng, đặc biệt là trong việc xác định vị trí và hướng của phối tử và xác định trung tâm hoạt động của protein đích Đồng thời kỹ thuật này còn có nhược điểm là chưa tính đến ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và áp suất Để có thể xóa nhòa nhược điểm này, chúng ta cần phải sử dụng tới kỹ thuật mô phỏng động lực phân tử (molecular dynamics simulation)

1.3.2 Phương pháp Molecular dynamics simulations

Mô phỏng động lực phân tử là một kỹ thuật mô phỏng được sử dụng để nghiên cứu sự biến đổi theo thời gian của hệ tương tác nhiều vật Hệ tương tác ban đầu được xác định thế năng tương tác giữa các vật trong hệ Từ biểu diễn của thế năng và vị trí ban đầu của các nguyên tử, ta có thể xác định được lực tương tác lên từng nguyên tử trong hệ và phương trình chuyển động của các vật Việc giải phương trình chuyển động sẽ cho ra những kết quả chi tiết về cấu hình của hệ tại mỗi thời điểm, từ đó tìm hiểu được chuyển động riêng của mỗi phần tử trong hệ thống theo thời gian

Khác với phương pháp mô phỏng trước đây như phương pháp mô phỏng ngẫu nhiên Monte-Carlo, thay vì sử dụng di chuyển ngẫu nhiên thì phương pháp MDS di chuyển nguyên tử bằng cách giải phương trình chuyển động Các phương trình chuyển động đó được xây dựng từ các định luật Newton [57]

Hình 1.6 MDS trong quá trình tìm kiếm và phát triển thuốc mới

Mô phỏng động lực học phân tử đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tìm kiếm và phát triển các loại thuốc mới MDS giúp chúng ta nhanh chóng sàng lọc và xác định các hợp chất tiềm năng, từ đó giảm thiểu chi phí tiến hành nghiên cứu

Thuật toán cơ bản của mô phỏng MD bao gồm việc chia thời gian thành các bước riêng biệt, thường không quá vài femto giây (10-15 giây) mỗi bước [58] Tại mỗi bước thời gian, các lực tác dụng lên mỗi nguyên tử được tính toán bằng trường lực cơ học phân tử Sau đó, vị trí và vận tốc của mỗi nguyên tử được cập nhật bằng các định luật chuyển động của Newton [58]

MDS là một phương pháp phổ biến, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu y sinh, khoảng một phần ba tài nguyên siêu máy tính của Hoa Kỳ là dùng để mô phỏng MDS của các phân tử sinh học [58]

Quá trình Molecular dynamics simulation

Chuẩn bị hệ thống

Đây là bước chuẩn bị ban đầu và khác nhau đối với từng phần mềm Có rất nhiều phần mềm để chọn lựa, bao gồm GROMACS, NAMD, AMBER, CHARMM, Desmond, và OpenMM [59] Tất cả các gói phần mềm này đều thực hiện các phép tính tương tự nhưng khác nhau về tính năng được hỗ trợ và mức độ hiệu quả của chúng [59]

Thông thường, file protein đích được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PDB http://www.rcsb.org ở cấu trúc 3D dưới định dạng PDB Sau đó, protein được tối ưu hóa bằng cách loại nước và các cấu tử khác (nếu có), thêm các nguyên tử còn thiếu (bao gồm

hydro) rồi được đưa vào phần mềm để tạo ra file topology (topol.top), một file quy định mối quan hệ trong không gian của các đối tượng gần nhau Tiến hành xây dựng mô hình topology của phối tử (ligand) tương tự, sau đó tạo ra mô hình topology của phức hợp protein-ligand

Tiếp đó xác định hộp dung môi của phức hợp protein-ligand, sau đó tiến hành thêm vào các phân tử “dung môi” như nước, ion muối để trung hòa điện tích và lipid (trong trường hợp tiến hành với protein màng) [59]

Cân bằng hệ

Hệ protein-phối tử được giản hóa năng lượng để đảm bảo không có xung đột không gian trong hệ, sau đó tiếp tục tiến hành cân bằng hệ để đưa hệ tới điểm cân bằng trước khi tiến hành chạy MDS Các bước này có thể được thực hiện trong phần mềm chạy MDS như GROMACS, NAMD, AMBER, CHARMM, Desmond, và OpenMM.[59]

Giản hóa năng lượng: Cấu hình ban đầu của hệ thống thường khác xa trạng thái cân bằng và năng lượng được giản hóa để đưa hệ thống đến gần trạng thái cân bằng [60]

Cân bằng hệ thường được tiến hành theo hai giai đoạn Giai đoạn đầu tiên được tiến hành trong điều kiện NVT (Số lượng hạt, Thể tích và Nhiệt độ không đổi) hay còn được gọi là "đẳng nhiệt-đẳng tích" Thông thường, 50–100 ps là đủ để hệ đạt đến trạng thái ổn định về nhiệt độ [60]

Sau khi ổn định nhiệt độ của hệ thống, áp suất hệ thống là tiêu chí tiếp theo cần ổn định Việc cân bằng áp suất được tiến hành trong điều kiện NPT hay còn gọi là "đẳng nhiệt-đẳng áp" và gần giống nhất với các điều kiện thí nghiệm [60]

Sau khi hệ thống đã được cân bằng và đạt được độ ổn định, tiến hành thực hiện MDS để thu thập dữ liệu

Tiến hành molecular dynamics simulations và phân tích

Sau khi có được một hệ protein-ligand ổn định, đẳng nhiệt và đẳng áp, tiến hành chạy MDS và phân tích kết quả

Việc phân tích kết quả thu được là một công việc khó khăn bởi độ lớn của dữ liệu, đồng thời phải biết cách chọn lọc ra những dữ liệu cần thiết cho nghiên cứu [59].Trong một số trường hợp, người ta chỉ quan tâm đến một đại lượng cụ thể được xác định rõ ràng, chẳng hạn như năng lượng tương tác giữa phối tử và protein (Binding Free Energy) Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp - ví dụ, khi giải mã một cơ chế chức năng tạo ra tác dụng của thuốc thì rất khó để xác định các đại lượng cần thiết [59]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu về các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L được thu thập từ các tạp

chí và bài báo khoa học từ Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier cùng với

các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L mà nhóm nghiên cứu đã phân lập trong

các nghiên cứu trước đây

Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên trong Mimosa pudica L và ChemID của

chúng được thu thập từ cơ sở dữ liệu PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) Cơ sở dữ liệu về các mục tiêu chống viêm được thu thập từ Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)

2.1.2 Phần mềm

Phần mềm được sử dụng để vẽ cấu trúc hóa học: Pymol 2.5.5 Phần mềm được sử dụng để tính toán và xử lý dữ liệu: Microsoft Excel 2016 Phần mềm dùng để tiến hành Molecular Docking: Auto dock 4.2.6, MGLTools 1.5.7, Open Babel GUI, Anaconda, Jupyternotebook, Google COLAB

Phần mềm dùng để tiến hành Molecular dynamics simulation: GROMACS 2021.4, AutoDockFR, Meeko

Máy tính: CPU - Intel Core i9 14900F; GPU - NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti; 64GB 3200 MHz RAM; SSD Samsung 980 Pro 2TB

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau đây:  Thu thập thông tin về thành phần hóa học của cây Xấu hổ  Thu thập thông tin về các đích chống viêm

 Sử dụng công cụ docking phân tử để dự đoán khả năng tương tác của các hợp chất từ cây Xấu hổ với các mục tiêu protein liên quan đến quá trình viêm, tập trung vào cơ chế viêm ở các đích tại phổi

 Phân tích dữ liệu docking để tìm ra các hợp chất có khả năng ức chế mạnh nhất và so sánh chúng với các chất chống viêm đã biết

 Sử dụng mô phỏng động học phân tử (Molecular dynamics) để xác định khả năng tương tác lâu dài của các hợp chất chống viêm tiềm năng với các mục tiêu protein trong môi trường sinh lý

 Phân tích các thông số động học như RMSD, RMSF, và Rgyr để đánh giá độ ổn định trong môi trường sinh lý của các hợp chất

2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu bao gồm 4 giai đoạn: Tổng quan lựa chọn protein và sàng lọc phối tử, chuẩn bị protein và phối tử, tiến hành mô phỏng tương tác phân tử và mô phỏng động học phân tử

SO SÁNH VỚI CHỨNG DƯƠNG

Các hợp chất tiềm năng

LỰA CHỌN

Hợp chất trong

M pudica

Các đích tiềm năng

Các đích chống viêm

46 đích

Docking

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chọn ra 1 đích (p38 MAPK)

Molecular dynamics simulation 38 hợp chất

15 hợp chất tiềm năng

 Tổng quan: Xác định mục tiêu tìm kiếm là các đích phân tử protein chống viêm và các hợp chất hóa học từ cây xấu hổ

 Chuẩn bị protein và phối tử: Chuẩn bị protein: Protein tiềm năng sẽ được tải xuống dưới dạng cấu trúc 3D từ cơ sở dữ liệu PDB, sau đó tiến hành tối ưu hóa (loại nước, thêm hydro và điện tích Kollman) và lưu dưới dạng PDBQT

Chuẩn bị phối tử: Phối tử sau sàng lọc được tải xuống ở cấu trúc 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem dưới định dạng SDF, sau đó chuyển sang định dạng pdbqt bằng phần mềm PyMol hoặc Open Babel GUI

 Mô phỏng tương tác phân tử: Protein và phối tử được đưa vào Auto Dock 4.2.6 dưới định dạng phù hợp Quá trình mô phỏng sẽ cho ra kết quả là năng lượng liên kết tự do phối tử - protein

 Mô phỏng động học phân tử: Protein và phối tử được đưa vào phần mềm GROMACS 2021.4 dưới định dạng phù hợp Tiến hành quá trình chuẩn bị hệ thống và chạy mô phỏng động học phân tử trong 100ns Kết quả thu được sẽ được phân tích để tính toán Binding Free Energy, RMSD (Độ lệch), Rgyr (Bán kính xoay vòng) và RMSF (dao động)

2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Molecular docking

2.4.1.1 Phương pháp tổng quan về thành phần hóa học của M pudica

Thành phần hóa học của các cây xấu hổ được thu thập từ cơ sở dữ liệu Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier với từ khóa tìm kiếm là “medicinal constituents”, “medicinal composition”, “phytochemical”, “Chemistry”, kèm theo tên La tinh của cây

Xấu hổ Mimosa pudica L

2.4.1.2 Phương pháp tổng quan về các đích chống viêm

Thông tin về các đích chống viêm được thu thập từ cơ sở dữ liệu Google Scholar, Pubmed, Sciencedirect, Elsevier với từ khóa tìm kiếm là "pathogenetic", "target*", "inflamm*", "inhibit*", "receptor", “asthma”, “airway” “lung” Tập trung vào những đích chống viêm tại phổi

2.4.1.3 Phương pháp Molecular docking

Tiến hành quá trình mô phỏng tương tác phân tử giữa các hợp chất hóa học trong cây Xấu hổ và các đích chống viêm Quá trình mô phỏng tương tác được thực hiện qua 3 bước: lựa chọn và chuẩn bị protein; lựa chọn và chuẩn bị phối tử và mô phỏng tương tác Phần mềm Autodock 4.2.6 được chọn để mô phỏng tương tác giữa protein và hợp chất hóa học (Protein-ligand docking)

 Lựa chọn và chuẩn bị protein: Các mục tiêu protein phân tử với cấu trúc xác định được thu thập từ Protein Data Bank (PDB), một cơ sở dữ liệu về cấu trúc 3D của nhiều hợp chất sinh học, trong đó có protein

Cấu trúc 3D của từng mục tiêu protein được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PDB dưới định dạng PDB, sau đó tiến hành loại các phối tử trong cấu trúc (nếu có), loại nước, thêm các nguyên tử còn thiếu (bao gồm cả nguyên tử hydro), gắn trường lực Kollman và làm tròn điện tích và được lưu dưới định dạng PDBQT

 Lựa chọn và chuẩn bị phối tử: Các phối tử phù hợp ở cấu trúc 3D được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Pubchem dưới định dạng SDF Sau đó, các phối tử được đưa vào phần mềm Open Babel GUI hoặc PyMol để chuyển từ định dạng SDF sang định dạng PDBQT nhằm chuẩn bị cho quá trình Docking

 Mô phỏng tương tác: Quy trình mô phỏng tương tác phân tử protein – phối tử (protein – ligand interaction) được thực hiện bởi AutodockTools 1.5.7 và Auto Dock phiên bản 4.2.6

Gridbox (hộp) được cài đặt sao cho bao trùm được trung tâm hoạt động của protein Gridbox được xác định bằng giá trị trung bình của các nguyên tử của phối tử được gắn sẵn trong protein

Các phối tử được mô phỏng các trạng thái tương tác với vùng gridbox đã chọn và cho các giá trị năng lượng liên kết khác nhau Giá trị năng lượng liên kết nhỏ nhất sẽ được chọn làm giá trị liên kết cho cặp chất đó [61]

Đánh giá kết quả: Kết quả mô phỏng tương tác được đánh giá dựa trên giá trị năng

lượng liên kết (binding energy) giữa phối tử và protein Năng lượng liên kết càng nhỏ (càng âm) đồng nghĩa giá trị năng lượng liên kết giữa phối tử - protein càng lớn, tương tác càng có ý nghĩa Các cặp chất có điểm docking nhỏ hơn -8.0 được coi là có ái lực liên kết lớn, mốc điểm docking này được lựa chọn sau khi tham khảo các nghiên cứu tương tự đã được tiến hành [9], [54], [62], [63], [64] Các hợp chất chống viêm tiềm

năng là các hợp chất có ái lực liên kết lớn với ít nhất 1 đích chống viêm

2.4.2 Phương pháp Molecular dynamics simulation

Trong số các đích chống viêm tiềm năng, dựa vào các thông tin của các đích chống viêm tiềm năng và nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu [10], lựa chọn ra 1 đích chống viêm tiềm năng nhất để chuẩn bị tiến hành mô phỏng động lực phân tử (p38 MAPK) Tiến hành redock đích chống viêm tiềm năng được chọn với chứng dương (Adezmapimod) [54] để có mức so sánh

Hình 2.2 Cấu trúc 3D của protein p38 MAPK

Tiến hành quá trình mô phỏng động lực phân tử giữa các hợp chất hóa học trong cây Xấu hổ có ái lực liên kết lớn đích chống viêm tiềm năng p38 MAPK Quá trình mô phỏng tương tác được thực hiện qua 2 bước:

1 Molecular Dynamics Simulations: Tư thế gắn tốt nhất từ Molecular Docking sẽ

được đưa vào chạy Molecular Dynamics Phức hợp Ligand-Receptor sẽ được mô phỏng bằng cách sử dụng GROMACS với trình tự sau:

 Xây dựng cấu trúc GROMACS topology của protein p38 MAPK bằng amber99sb-ildn forcefield và spc/e water molecules

 Xây dựng mô hình GROMACS topology của ligand bằng amberGAFF forcefield  Xây dựng mô hình topology phức hợp protein-ligand, xác định hộp dung môi và

thêm các ions để trung hòa hệ thống  Tối ưu hóa năng lượng của hệ thống  Cân bằng phức hợp protein-phối tử trong hệ NVT (số hạt không đổi N, thể tích

V không đổi và nhiệt độ dao động xung quanh giá trị cân bằng)  Cân bằng phức hợp protein-phối tử trong hệ NPT (Hệ đẳng áp-đẳng nhiệt)  Chạy MDS của phức hợp protein-phối tử trong 100ns

2 Phân tích: Tính toán năng lượng liên kết tự do, RMSD (Độ lệch), Rgyr (Bán

kính xoay vòng) và RMSF (độ dao động) của từng cặp chất

Năng lượng liên kết tự do được định nghĩa là sự khác biệt năng lượng tự do giữa các

trạng thái liên kết và không liên kết Trạng thái không liên kết có thể là bất kỳ trạng thái nào trong đó tương tác giữa protein và phối tử là không đáng kể.[65]

Năng lượng liên kết tự do là một đại lượng quan trọng phản ánh khả năng liên kết với protein của phối tử Năng lượng liên kết tự do càng nhỏ, ái lực liên kết giữa phối tử và protein càng lớn

Để tính toán năng lượng liên kết tự do, chúng ta có thể sử dụng phương pháp MM/PB(GB)SA (Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann (Generalized Born) Surface Area)

Hình 2.3 Chu trình nhiệt động lực học để tính toán năng lượng liên kết tự do

Năng lượng liên kết tự do cho một phức hợp có thể được ước tính như sau:

∆G𝑏𝑖𝑛𝑑 = 〈𝐺𝐶𝑂𝑀〉 − 〈𝐺𝑅𝐸𝐶〉 − 〈𝐺𝐿𝐼𝐺〉

trong đó mỗi số hạng bên phải trong phương trình được cho bởi:

∆H = ∆EMM + ∆Gsol

Trong đó:

∆EMM = ∆Ebonded + ∆En𝑜𝑛bonded

= (∆Ebond + ∆Eangle + ∆Edihedral) + (∆Eele + ∆EvdW)

Năng lượng tự do của pha khí (∆EMM) được tính bởi lệnh |sander| nằm trong AmberTools package theo trường lực được sử dụng trong mô phỏng MD

∆Gsol thì được tính như sau: ∆Gsol = ∆Gpol + ∆Gnon−pol = ∆GPB/GB + ∆Gnon−polTrong đó: ∆Gnon−polar = NPTENSION ∗ ∆SASA + NPOFFSET

hay, ∆Gnon−pol = ∆Gdisp + ∆Gcavity = ∆Gdisp + (CAVITYTENSION ∗ ∆SASA + CAVITYOFFSET)

RMSD là một tham số được sử dụng để tính toán sự khác biệt giữa protein-phối tử ở vị

trí ban đầu và vị trí trong quá trình mô phỏng Giá trị RMSD lớn chỉ ra rằng protein/phối tử đã di chuyển xa hơn khỏi vị trí ban đầu của nó

Đặc biệt nếu giá trị RMSD của phối tử có sự nhảy đột ngột và thiết lập trạng thái cân bằng mới, có thể hiểu rằng phối tử đã rời khỏi vị trí liên kết ban đầu và gắn lại ở một vị trí mới có liên kết bền hơn trạng thái ban đầu

Công thức:

Trong đó:  v là vị trí của protein/phối tử ban đầu  w là vị trí của protein/phối tử trong quá trình mô phỏng

Rgyr (Radius of Gyration) là một tham số được sử dụng để tính toán sự phân bố khối

lượng hoặc năng lượng xung quanh một trục quay Rgyr đại diện cho sự nén của cấu trúc protein Giá trị Rgyr lớn có thể được hiểu là protein nở ra so với ban đầu

Công thức:

Trong đó:  M = ∑𝑁𝑖=1𝑚𝑖 là tổng khối lượng của protein có N nguyên tử  R = 1

𝑁∑𝑁𝑖=1𝑟𝑖 là trung tâm của protein có N nguyên tử

RMSF (Biến động bình phương trung bình gốc) là một số liệu đo lường sự dao động ở

vị trí trung bình của mỗi nguyên tử trong protein trong quá trình mô phỏng động lực học phân tử Nó được tính toán cho từng nguyên tử riêng lẻ, và sau đó các giá trị này có thể được tính trung bình trên các nhóm nguyên tử (chẳng hạn như mỗi axit amin trong protein) để đưa ra thước đo tính di động của các axit amin khác nhau của protein Công thức:

ρi = √〈(𝑥𝑖 − 〈𝑥𝑖〉)2〉Trong đó:

 xi là tọa độ của phân tử i  〈𝑥𝑖〉 là vị trí trung bình của phân tử i trong toàn bộ thời gian mô phỏng Dựa trên giá trị RMSF, chúng ta xác định vị trí nào của protein chuyển động không ngừng, được biểu thị bằng giá trị RMSF cao Từ đó, xác định xem các axit amin nào thường xuyên chuyển động