Theo Cơ quan quản lý dược phẩm châu Âu EMA: chất đánh dấu marker là các chất đối chiếu được xác định về mặt hóa học có trong dược liệu, có thể có đóng góp hoặc không đóng góp vào tác dụn
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
1.1.1 Vị trí phân loại của Mimosa pudica L
Cây Xấu hổ còn có tên gọi khác là cây Mắc cỡ, cây Thẹn, cây Trinh nữ, Hàm tu thảo [7]
Vị trí phân loại của loài Mimosa pudica L trong hệ thống phân loại thực vật của
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae)
Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) Chi Mimosa
1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái
Cây nhỏ, mọc hoang ở ven đường, thân có gai hình móc Lá 2 lần kép lông chim, nhưng cuống phụ xếp như hình chân vịt; khẽ động vào lá cụp xuống Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống [7]
Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đấu tròn, màu tím hồng; dài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn [9] Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [7]
Chi Mimosa có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á Ở Việt Nam có 4 loài gồm: Mimosa pudica L., M diplotricha C Wright, Mimosa pigra L., Mimosa invisa M [7]
Mimosa pudica L có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau đó du nhập sang các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, Nam Châu Phi, khu vực Đông Nam Á,
Hình 1.1 Bản đồ phân bố toàn cầu của Mimosa pudica L (màu xanh thể hiện các vùng bản địa, màu tím thể hiện các quốc gia mà nó du nhập) [11]
1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
Dùng toàn cây hoặc lá và rễ cây Xấu hổ, thu hái quanh năm, rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi hay sấy khô [7]
1.1.4 Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L
1.1.4.1 Các hợp chất vô cơ
Theo một số nghiên cứu, cây Xấu hổ có hàm lượng selen rất cao, mỗi mùa và vùng thu hái khác nhau, dược liệu có hàm lượng selen ở mỗi bộ phận lại khác nhau Trong lá, hàm lượng Selen là 3000 γ/g vào tháng 8 và đến tháng 12 còn 300 γ/g Trong quả, tháng 8, hàm lượng Selen là 290 γ/g, tháng 12 tăng là 1560 γ/g Xấu hổ thu hái ở Đà Nẵng có hàm lượng selen là lớn nhất, những mẫu thu hái ở Vĩnh Phúc, Hải Phòng có hàm lượng selen ít hơn những nơi khác Đặc biệt, kết quả nghiên cứu mẫu Xấu hổ được thu hái ở Đồng Nai không cho thấy sự có mặt của hợp chất selen.Như vậy lá cây Xấu hổ có hàm lượng selen rất cao vào mùa hè rồi giảm nhanh, trong khi hàm lượng selen ở quả lại tăng [2]
Cả lá, thân và rễ của Xấu hổ đều đã được xác định có chứa một số nguyên tố vô cơ khác: Al, Si, Mg, Ca, Fe, Mn, Ti, Cu, Pb, Na [3]
1.1.4.2 Các hợp chất hữu cơ
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Xấu hổ cho thấy sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ như: flavonoid, alcaloid, saponin, tanin, sterol, các acid amin và acid hữu cơ [1] [3] [2] a Flavonoid
Flavonoid được nhiều nghiên cứu cho thấy là thành phần chính trong Xấu hổ, nhiều hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc trong đó các hợp chất C-glycosid flavonoid chiếm số lượng lớn
Bảng 1.1 Một số hợp chất flavonoid đã được phân lập từ loài M pudica L
STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK
5,7,3’,4’-tetra hydroxyl-6-C-[α- L-rhamno pyranosyl-(1→2) β-D-gluco pyranosyl flavon
7,8,3’,4’- tetra hydroxyl-6-C-[α- L-rhamno pyranosyl- (1→2)β-D- gluco pyranosyl flavon
5,7,3’,4’-tetra hydroxyl-6-C-[β- D-apiose-(1→4)]- β-D- glucopyranosyl flavon
10 5,7,4’-trihydroxy- 8-C-[α-L- rhamnopyranosyl - (1→ 2) β-D- glucopy ranosyl flavon
6,7,3’,4’-tetra hydroxyl-8-C-[α- L-rhamno pyranosyl-(1→2)]- β-D-gluco pyranosyl flavon
5,7,3’,4’-tetra hydroxyl-8-C-[β- D-apiose-(1→4)]- β-D- glycopyranosyl flavon
19 Apigenin - 7 - O - β - D - glucosid [44] b Các hợp chất phenol khác
Bảng 1.2 Công thức cấu tạo một số hợp chất phenol khác
STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK
4-(24’-methoxy-2,4’- methyl-1’-oxo-5’-n- propyl-tetracosanyl)- phenol
Bảng 1.3 Công thức cấu tạo một số hợp chất sterol
STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK
4 β-sitosterol [8] c Các hợp chất hữu cơ khác
- Alcaloid: Phần lớn các nghiên cứu từ loài Mimosa pudica L đã phân lập được một alcaloid có tên là mimosin [9]
- Chất béo, chất nhầy: có mặt trong lá và hạt [9]
- Crocetin, crocetin dimethylester [9], α-tocoferol, lutein, betulaprenol-9 [3], 1- triacontanol, phytol, diisooctyl phtalat [8]
1.1.5 Tác dụng dược lý của loài Mimosa pudica L
Nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học đã được thử nghiệm trên Mimosa pudica L.Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng M pudica L có một số tác dụng như: tác dụng bảo vệ gan [29], [43], chống viêm [25], [42], [51], kháng khuẩn [13], [15], [32], giảm đau [16], [24], trị đái tháo đường [38], [45], [56], giải lo âu, chống oxy hóa, hạ lipid, chống sốt rét và bảo vệ thần kinh….[11] Ở Ấn Độ, nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan: dịch chiết nước và dịch chiết cồn cây Xấu hổ (với liều tương đương lần lượt là 50, 100, 200 mg/kg tính theo dược liệu khô) đều có tác dụng giảm phù chân do carrageenan Tác dụng này tương đương indomethacin (liều 10 mg/kg) [21]
Trên mô hình gây viêm tại phổi bằng Sephacryl S-200, dịch chiết nước Xấu hổ (liều 2,8g/kg thể trọng chuột) có tác dụng chống viêm rõ rệt: làm giảm có ý nghĩa trọng lượng phổi, giảm số lượng bạch cầu ưa acid trong dịch rửa phế quản so với lô chứng bệnh Tác dụng làm giảm trọng lượng phổi và làm giảm số lượng bạch cầu ưa acid trong dịch rửa phế quản của dịch chiết nước Xấu hổ tương đương tác dụng của dexamethason (0,5mg/kg) [1]
Luteolin, một hợp chất nhóm flavonoid được phân lập từ cây Xấu hổ có nhiều tác dụng dược lý đã được ghi nhận, trong đó tác dụng chống viêm là một tác dụng điển hình Luteolin có thể ức chế sản xuất NO do LPS gây ra ở các dòng tế bào khác nhau Trong các tế bào RAW 264,7 được kích hoạt bằng LPS, luteolin thể hiện hoạt động chống viêm mạnh bằng cách giảm sản xuất NO và prostaglandin E2 [46] Ngoài ra, luteolin còn làm giảm nồng độ IL-1β, IL-6 và TNF-α trong huyết thanh và điều chỉnh tăng FOXP3, điều này có thể liên quan đến sự gia tăng tế bào T điều hòa trong phổi của mô hình chuột T điều hòa sản xuất IL-10, một cytokine chống viêm có khả năng ngăn chặn phản ứng viêm thông qua việc thúc đẩy sự phân cực của đại thực bào M2 [48], [50].Trên hệ thân kinh, luteolin làm giảm tình trạng viêm vùng đồi thị bằng cách ức chế stress của lưới nội chất trong tế bào hình sao giúp bảo tồn chức năng của hệ thần kinh Cơ chế này kích hoạt sự cải thiện khả năng học tập không gian và cải thiện tình trạng thiếu hụt trí nhớ ở chuột [28], [31]
Ngoài luteolin, một số flavonoid khác được tìm thấy ở Xấu hổ cũng thể hiện tác dụng chống viêm mạnh như agigenin, isoorientin, orientin, … Đánh giá tác dụng chống viêm của apigenin trên mô hình tổn thương cơ tim do LPS gây ra cho thấy apigenin làm giảm tổn thương bằng cách ức chế quá trình oxy hóa và các cytokine gây viêm như TNF-α, IL-1β, MIP-1α và MIP-2 thông qua điều hòa NF-κB [33] Đối với hợp chất isoorientin, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng isoorientin có thể làm giảm các phản ứng gây viêm do LPS gây ra bao gồm ức chế giải phóng NO, COX-2 và các cytokine gây viêm như TNF-α và IL-1β, thông qua việc điều chỉnh giảm đường truyền tín hiệu MAPK/NF-κB trong tế bào BV-2 [27] Isoorientin ức chế con đường JAK2/STAT3, làm giảm tình trạng viêm trên mô hình tổn thương phổi cấp tính do các tác dụng như trên, ở nước ta hiện nay còn có một loài Mimosa khác là Mimosa diplotricha C Wright ex Sa (thường được gọi là Trinh nữ móc, Trinh nữ thân vuông) có đặc điểm thực vật, sinh thái gần giống loài Mimosa pudica L Đây là loài nằm trong danh mục các loài ngoại lai xâm hại, thường mọc gần loài Mimosa pudica L và phát triển rất nhanh Về thành phần hóa học, loài M diplotricha C.Wright cũng chứa các nhóm chất hữu cơ: flavonoid, alcaloid, sterol, đường khử, acid amin [4], saponin [26] như M pudica Các hợp chất flavonoid phân lập được ở loài M diplotricha
C.Wright chủ yếu là methoxy flavonoid như: 2-hydroxy-3,7,4′,8,5′- pentamethoxyflavon, 7,3′,4′-trihydroxy-3,8-dimethoxyflavon, 2-hydroxy-3,7,8,4,5- pentamethoxyflavon [41], 2′,5′-dihydroxy-3,7,8,4′-tetramethoxyflavon, 3′-hydroxy- 3,7,8,4′- tetramethoxyflavon, 2′-hydroxy-3,7,8,4′-tetramethoxyflavon [36],…
Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số hợp chất flavoid của M diplotricha C.Wright
Và hiện nay, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh về tác dụng của loài này
1.3 Lựa chọn chất đánh dấu hóa học trong kiểm soát chất lượng dược liệu
Các khái niệm theo quan điểm của Tổ chức y tế thế giới WHO [49]:
Thành phần có tác dụng điều trị đã biết (Constituents with known therapeutic activities): là chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đóng góp vào tác dụng của dược liệu/chế phẩm
Thành phần có tác dụng dược lý (sinh học) được ghi nhận (Constituents with recognized pharmacological (biological) activities): là các chất hóa học đặc trưng (chất hoặc nhóm chất) được xác định về hóa học, sự liên quan giữa tác dụng dược lý của chúng tới hiệu quả điều trị hoặc độc tính của dược liệu/chế phẩm chưa được thiết lập đầy đủ
Thành phần đặc trưng (Characteristic constituents): là các chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đặc trưng cho một dược liệu nào đó hoặc một loài/chi/họ thực vật
Lựa chọn chất đánh dấu hóa học trong kiểm soát chất lượng dược liệu
Các khái niệm theo quan điểm của Tổ chức y tế thế giới WHO [49]:
Thành phần có tác dụng điều trị đã biết (Constituents with known therapeutic activities): là chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đóng góp vào tác dụng của dược liệu/chế phẩm
Thành phần có tác dụng dược lý (sinh học) được ghi nhận (Constituents with recognized pharmacological (biological) activities): là các chất hóa học đặc trưng (chất hoặc nhóm chất) được xác định về hóa học, sự liên quan giữa tác dụng dược lý của chúng tới hiệu quả điều trị hoặc độc tính của dược liệu/chế phẩm chưa được thiết lập đầy đủ
Thành phần đặc trưng (Characteristic constituents): là các chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đặc trưng cho một dược liệu nào đó hoặc một loài/chi/họ thực vật
Thành phần có độc tính (Toxic constituents): là các chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học có độc tính, mặc dù chúng có thể góp phần vào tác dụng điều trị của dược liệu/chế phẩm
Chất đối chiếu (Reference substance): là những chất xác định về hóa học (thích hợp với mục đích sử dụng để chuẩn hóa hoặc kiểm soát chất lượng cao dược liệu) [49]
1.3.2 Marker tiêu chuẩn hóa Định nghĩa marker:
- Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) [49]: Chất đánh dấu (marker) là các chất đối chiếu được xác định về mặt hóa học có trong dược liệu Các chất này có thể có đóng góp hoặc không đóng góp vào tác dụng điều trị Trường hợp có đóng góp vào tác dụng điều trị cũng chưa có đủ bằng chứng để chứng minh đây là thành phần duy nhất quyết định hiệu quả lâm sàng
- Theo Dược điển châu Âu [17]: Chất đánh dấu (marker) là các chất hoặc nhóm chất của dược liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm dược liệu, được xác định về hóa học được dùng để kiểm soát chất lượng không phụ thuộc vào việc các chất/nhóm chất này có tác dụng điều trị hay không Có hai loại marker:
+ Marker có hoạt tính (active marker): là các chất hoặc nhóm chất được chấp nhận là có tham gia vào tác dụng điều trị
+ Marker phân tích (analytical marker): là các chất hoặc nhóm chất chỉ được dung cho mục đích phân tích
1.3.3 Lựa chọn chất đánh dấu (marker) định tính, định lượng
Do sự phức tạp vốn có về thành phần, việc kiểm soát chất lượng dược liệu thực sự là một thách thức Rất khó để định tính và định lượng dược liệu, chưa kể việc phát hiện các trường hợp giả mạo đòi hỏi phải phối hợp toàn diện nhiều biện pháp WHO đã có hướng dẫn về lựa chọn chất đối chiếu trong định tính và định lượng dược liệu [49] Thứ tự ưu tiên trong lựa chọn marker như sau: (1) Thành phần có tác dụng điều trị đã biết, (2) Thành phần có tác dụng dược lý đã được ghi nhận (đã được nghiên cứu) và (3) Thành phần đặc trưng
Marker cho phân tích định lượng nên có độ tinh khiết cao như yêu cầu bởi các quy và tính chọn lọc sử dụng các phương pháp phân tích cụ thể; nên có hàm lượng vết trong phân tích định tính hoặc đủ lớn cho phân tích định lượng; nên dễ kiếm, ổn định trong điều kiện bảo quản xác định; nên dễ phát hiện và dễ phân tích định lượng [49] Mục đích và vai trò, yêu cầu và tiêu chí lựa chọn các chất đánh dấu cụ thể cho từng nhóm thành phần trong dược liệu được trình bày ở Bảng 1.6
Bảng 1.4 Hướng dẫn của WHO trong lựa chọn chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng thuốc dược liệu [49]
Mục đích và vai trò Yêu cầu Tiêu chí lựa chọn
Chất đánh dấu của nhóm thành phần có tác dụng điều trị đã biết Định tính, định lượng
- Sẵn có (Ví dụ: là chất đối chiếu quốc tế hoặc dược điển) Các chất đánh dấu khác chỉ có thể lựa chọn khi không có sẵn các chất đối chiếu kia Trong trường hợp đó, cần có hồ sơ chi tiết về việc nhận diện và đặc tính của chúng;
- Nên dễ phân tách hoặc phân biệt với các thành phần có cấu trúc tương tự trong dược liệu khi phân tích;
- Nên được phát hiện và định lượng bằng các phương pháp phân tích dụng cụ (TLC, HPTLC, GC, HPLC);
- Các chất đánh dấu khác nhau có thể được lựa chọn cho cùng một thuốc từ dược liệu phụ thuộc vào phương pháp phân tích dụng cụ sẵn có
Chất đánh dấu của nhóm thành phần có tác dụng dược lý đã được ghi nhận Định tính, định lượng
- Sẵn có với hàm lượng đủ lớn;
- Chất đánh dấu định lượng: nên đại diện cho thông tin dược lý hoặc điều trị chính;
- Chất đánh dấu định tính: nên đặc hiệu cho một dược liệu hoặc cho một số loài và chi thực vật Nếu không, các chất đánh dấu khác nên được lựa chọn để nhận diện đặc hiệu;
- Nên được phát hiện và định lượng bằng các phương pháp phân tích dụng cụ sẵn có (TLC, HPTLC, GC, HPLC) hoặc bằng phương pháp phân tích liên quan khác;
- Nhiều chất đánh dấu khác nhau có thể được lựa chọn cho một dược liệu phụ thuộc vào các dạng khác nhau của các chế phẩm từ dược liệu (ví dụ cao cồn và cao nước) hoặc các chỉ định điều trị khác nhau;
- Một nhóm các chất đánh dấu có thể được lựa chọn nếu một chất đánh dấu không đủ để đánh giá
Chất đánh dấu của nhóm thành phần đặc trưng Định tính, định lượng
Chất đánh dấu định tính:
- Nên đặc hiệu cho một thực vật Nếu không nên đặc hiệu cho một loài, chi, họ thực vật nhất định
- Nếu không đặc hiệu cho một thực vật, thì nên đặc hiệu ít nhất cho một nguyên liệu từ dược liệu hoặc chế phẩm từ dược liệu trong chế phẩm từ dược liệu hỗn hợp hoặc thuốc từ dược liệu hỗn hợp
- Nên gồm một hoặc một nhóm các chất hoặc dạng đặc trưng của các chất
(Lưu ý: Một dạng của các chất mà đặc trưng cho
- Nên có hàm lượng đủ lớn;
- Nên có sẵn một chất đối chiếu được giám định;
- Dữ liệu phổ của chất đánh dấu nên được ghi trong thư viện hoặc cơ sở dữ liệu có sẵn;
- Dữ liệu TLC hoặc các phép định tính bằng phân tích khác nên được minh họa trong một nguồn dữ liệu sẵn có;
- Nên có các thí nghiệm định tính và định lượng được mô tả cho chất đánh dấu đó hoặc lớp chất hóa học của nó;
- Nên có đủ bằng chứng thực nghiệm rằng chất đánh dấu hoặc các chất đánh dấu lựa
Chất đánh dấu định lượng: Cần có sẵn với hàm lượng đủ lớn để định lượng
Chất đánh dấu của nhóm thành phần độc tính
Xác định hàm lượng tối đa cho phép của các thành phần độc tính
Cần có giới hạn chấp nhận trên xác định cho các mục đích ứng dụng và liều dự kiến
Cần có các đánh giá độc tính, nhưng kinh nghiệm sử dụng theo cổ truyền cũng cần được xem xét
Khi thiết lập các tiêu chí độc tính, cần cân nhắc các độc tính trên gen, đột biến và ung thư
Cần có quy trình phát hiện ở mức phân tích cho các giới hạn chấp nhận được thiết lập
Các yêu cầu này nên luôn cần đạt được với các thành phẩm từ dược liệu dùng cho người, bởi vì quá trình xử lý và chuyển dạng có thể làm thay đổi độc tính
- Nên có sẵn các chất đối chiếu thích hợp;
- Để nhận diện, tính đặc hiệu và tính chọn lọc là những đặc trưng quan trọng;
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho các thuốc nghiên cứu cần cụ thể;
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu, thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ được thu hái ở Thanh Trì (Hà Nội) vào tháng
7 năm 2023 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Mimosa pudica L., họ Đậu Fabaceae Tiêu bản được lưu trữ tại Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số HNIP/18722/23
Xử lý mẫu sau thu hái: phần trên mặt đất của cây Xấu hổ sau khi thu hái được cắt nhỏ thành đoạn 5-6 cm, sấy khô ở 60 o C Dược liệu thu được có độ ẩm dưới 12%
Xử lý dược liệu trước khi chiết: xay thô dược liệu, bảo quản trong túi PE, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng
Hình 2.1 Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.)
2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu
Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:
- Hóa chất: ethyl acetat, acid formic, acid acetic, v.v
- Hóa chất định tính: thuốc thử diphenylboryloxyethylamin (NP), polyethylen glycol-4000 (PEG)
- Dung môi hữu cơ: methanol, ethanol
- Lipopolysaccharide (LPS) và N(omega)-nitro-L-arginin methyl ester (L-NAME) được mua từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)
- Thuốc thử Griess được mua từ Promega (Madison, WI, USA)
- Môi trường nuôi cấy DMEM và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech (Aidenbach, Germany)
- Thuốc thử 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromid (MTT) được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA)
- Dimethyl sulfoxide (DMSO) được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)
- Bản mỏng tráng sẵn TLC silicagel 60 F254 của hãng MERCK (Đức).
- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (giấy lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống ly tâm, bình nón, pipet…) và các dụng cụ khác (mao quản, bình khai triển sắc ký, cột sắc ký có van điều chỉnh…)
2.1.2.2 Phương tiện và máy móc
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột:
Phương tiên và máy móc:
- Bể siêu âm Daihan Scientific (Hàn Quốc)
- Cân phân tích Precisa, độ chính xác 0.1 mg (Thụy Sỹ)
- Cân xác định hàm ẩm Ohaus (Trung Quốc)
- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: hệ thống chấm sắc ký tự động Linomat V, buồng chụp sắc ký Visualizer có kết nối máy tính với phần mềm VisionCATs, bình khai triển sắc ký
- Hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cây Xấu hổ
- Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây Xấu hổ.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cây Xấu hổ
Phân lập hợp chất flavonoid từ cây Xấu hổ sử dụng phương pháp sắc ký cột với quy trình phân lập gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu Xấu hổ: chiết bằng phương pháp chế hợp chất phân lập được bằng sắc ký cột Sephadex LH-20
Các phân đoạn được kiểm tra thành phần bằng sắc ký lớp mỏng với điều kiện sắc ký như sau:
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ
Hệ 1: Ethyl acetat - acid acetic - acid formic - nước (10:0,3:0,3:0,1)
Hệ 2: Ethyl acetat - acid formic - nước (82:9:9)
- Thuốc thử hiện màu: NP/PEG và quan sát dưới sánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ66nm
2.3.2 Xác định cấu trúc của chất phân lập được
Cấu trúc chất phân lập được được xác định dựa trên các dữ liệu phổ UV, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố
2.3.3 Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây Xấu hổ
Hợp chất isoorientin được hòa tan trong DMSO với nồng độ gốc 50 mM và bảo quản ở -20 o C Khi cần ủ với tế bào, chất thử được pha loãng trông môi trường nuôi cấy đến các nồng độ thích hợp
Dòng đại thực bào chuột nhắt Raw 264.7 từ ATCC được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% FBS và 1% kháng sinh (streptomycin/penicillin) Tế bào được duy trì trong tủ nuôi cấy 37 o C với 5% CO2 Tế bào được cấy chuyển mỗi khi đạt mật độ 70-80%
2.3.3.3 Đánh giá độc tính tế bào
Nguyên tắc của mô hình:
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) là một tetrazol màu vàng Succinodehydrogenase trong ty thể của tế bào sống có thể cho phép, khử muối terazolium hơi vàng (MTT ngoại sinh) thành formazan tính thể màu tím không tan trong nước với cực đại hấp thụ 570nm Lượng formazan tạo ra tương quan với số lượng tế bào còn sống Vì vậy sau phản ứng tiến hành đo quang ở bước sóng 570 nm để định lượng formazan từ đó tính được tỷ lệ tế bào sống
Tế bào được cấy trong một đĩa 96-well thành trong ở mật độ 4×104 tế bào/giếng trong môi trường đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, tế bào được ủ với môi trường chứa các mẫu thử ở nồng độ thớch hợp trong 24 giờ Kết thỳc thời gian ủ, 10 àL dung dịch MTT
5 mg/mL được thêm trực tiếp vào môi trường và ủ trong 2 giờ Môi trường sau đó được loại bỏ để thu các tinh thể kết kinh màu tím ở đáy đĩa Tinh thể được hòa tan trong 100 àl DMSO trước khi được đo độ hấp thụ ở bước súng 570 nm
Kết quả: mẫu thử được coi là không có độc tính nếu tỷ lệ sống sót tế bào so với lô chứng ≥80%
2.3.3.4 Đo giải phóng Nitric oxide (NO)
Nguyên tắc: Các tế bào RAW 264.7 được tiến hành kích thích phản ứng viêm bằng
LPS với nồng độ và thời gian thích hợp Với tác nhân là LPS, kích thích tế bảo đại thực bào RAW 264.7 giải phóng ra chất trung gian hóa học (PGE2, NO) và các cytokin viêm (TNF, IL-6, IL-1β)
Lượng NO giải phóng vào mỗi trường nuôi cấy được định lượng qua độ hấp thụ của chất chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy đại thực bào ở bước sóng 535nm Thuốc được coi là có tác dụng chống viêm khi làm giảm giải phóng NO so với mẫu chứng
Tế bào được cấy trong một đĩa nuôi cấy 96 giếng (Corning) thành trong ở mật độ 4×104 tế bào/giếng trong môi trường đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, môi trường cũ được loại bỏ và tế bào được ủ với môi trường mới chứa các mẫu thử ở nồng độ thích hợp trong 2 giờ, sau đó tiếp tục ủ với môi trường chứa LPS 100 ng/mL thêm 24 giờ nữa Mụi trường trong mỗi giếng (50 àL) được hỳt chuyển sang một đĩa 96 giếng mới Sau đú, thờm 50 àL dung dịch sulfanilamid và ủ ở nhiệt độ phũng, trong búng tối trong 5 phỳt trước khi thờm 50 àL N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid vào hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 535 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)
Nồng độ NO trong mỗi mẫu được tính toán dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn Natri nitrit Tỷ lệ phần trăm ức chế giải phóng NO của mẫu thử được tính theo công thức:
Trong đó: CLPS và Cthử lần lượt là nồng độ NO của tế bào được xử lý với LPS đơn độc và LPS kết hợp với isoorientin
Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Graphpad 8.0.2 sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cao toàn phần
3.1.1 Giai đoạn 1: Chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu Xấu hổ
Chuẩn bị cao cho quá trình phân lập: Ngâm trương nở 1kg dược liệu khô đã xay thô trong vòng 30 phút với 3 lít ethanol 90% Cho dược liệu đã ngâm trương nở vào bình ngâm lạnh đã khóa van và được lót giấy lọc ở đáy bình, đổ thêm ethanol 90% đến khi dung môi cao hơn bề mặt dược liệu khoảng 5cm Bọc kín và đậy nắp bình chiết lạnh, ngâm trong 48 giờ Sau 48 giờ, mở van, rút dịch chiết vào bình Dịch chiết được lọc hút bằng phễu lọc buchner rồi đem đi cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở 50-60°C đến thể chất lỏng sánh Chuyển dịch chiết đậm đặc ra cốc có mỏ, tráng bình bằng ethanol, cô cách thủy ở 80°C sau đó chuyển vào tủ sấy ở 60°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm không quá 20%)
Kết thúc quá trình, từ 1kg dược liệu ban đầu thu được 118g cao Xấu hổ để sử dụng cho quá trình phân lập
3.1.2 Giai đoạn 2: Phân đoạn bằng sắc ký cột rây phân tử Sephadex LH-20
- Cột sắc ký có van điều chỉnh tốc độ chảy dung môi pha động, đường kính 3 cm, dài 80cm
- Chất nhồi cột: Sephadex LH-20
- Hệ dung môi pha động: methanol - nước (8:2)
- Tiến hành phân lập với khoảng 1g cao đặc toàn phần mỗi lần (tiến hành 5 lần) thu được từ quy trình chiết xuất
Mô tả quá trình phân lập:
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol và để khô tự nhiên Sau đó lắp và cố định cột thẳng đứng trên giá, khóa van cột, lót một miếng bông mỏng ngay phía trên van sao cho các hạt Sephadex LH-20 sau khi nhồi không bị chảy ra khỏi cột
Nhồi cột: Sử dụng phương pháp nhồi cột ướt
Ngâm ngập khoảng 50,0g Sephadex LH-20 trong methanol trong 24 giờ Sau 24 giờ, khuấy đều để tạo hỗn dịch, rót từ từ và liên tục vào cột (dùng đũa thủy tinh giúp rót hỗn dịch lên thành cột, tránh tạo bọt khí) Mở khóa van cột để dung môi chảy ra từ từ, hứng dung môi và đổ ngược trở lại cột, tránh để cột khô Cho dung môi chảy liên tục như trên cho đến khi cột ổn định Khóa van cột, chú ý đảm bảo dung môi luôn ngập trên mặt cột Dùng một miếng giấy lọc (có đường kính vừa với lòng cột) thả trên mặt thoáng của dung môi để bảo vệ mặt cột
Hoạt hóa cột bằng methanol 80 trước khi đưa mẫu lên cột: Mở khóa van cột, rửa cột bằng methanol 80 với thể tích tối thiểu bằng thể tích khối cột nhồi để toàn bộ dung môi trong cột sắc ký đều là methanol 80 Khóa van cột, chú ý đảm bảo dung môi luôn ngập trên mặt cột
Chuẩn bị mẫu: Hòa tan khoảng 1g cao đặc toàn phần đã chuẩn bị ở trên trong 6 ml methanol Lọc, thu dịch lọc Đưa mẫu lên cột: Mở khóa van, khi dung môi gần chạm vào bề mặt giấy lọc, dùng pipet đưa mẫu lên cột (đưa pipet xuống gần bề mặt cột nhất có thể và nhỏ từ từ và trải đều quanh thành cột để tránh gây xáo động lớp chất nhồi trong cột) Chờ khi dung môi đến bề mặt giấy lọc còn khoảng 0,2 cm, dùng pipet hút dung môi rửa giải tráng vòng quanh thành cột nhiều lần, vừa tráng vừa mở khóa van để chất không bị khuếch tán ngược trở lại bên trên, điều chỉnh tốc độ rửa giải là 2,5 ml/phút
Hứng dịch rửa giải và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng: dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm thể tích 30ml, đánh số các ống nghiệm từ 1 đến hết, mỗi ống hứng với thể tích từ 10-12 ml
Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng để phát hiện phân đoạn chứa hợp chất flavonoid glycosid cần phân lập
Chấm 5àl mỗi dung dung dịch dược liệu đối chiếu và dung dịch thử lờn bản mỏng, khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô, phun thuốc thử NP/PEG và quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng UV 366nm
Gộp các ống nghiệm có xuất hiện vết hợp chất flavonoid glycosid cần phân lập Đem đi cô cách thủy đến cắn, gọi là cắn A
Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập bằng Sephadex LH-20
Kết thúc quá trình rửa giải, thể tích dung môi đã sử dụng trong quá trình rửa giải là 550ml và thu được sắc ký đồ như hình dưới đây:
Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn sau khi qua cột Sephadex LH-20
Hòa tan 1,0g cao trong 10ml methanol Lọc
Gộp tất cả các ống nghiệm có chứa chất nghiên cứu từ ống nghiệm số 17 đến ống nghiệm số 21 đem cô cách thủy đến cắn thu được cắn A
Nhận xét: Cột sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20, sử dụng dung môi là methanol
80 là bước đầu để loại bỏ các chất có kích thước phân tử lớn ra sớm và một số tạp còn bị lưu giữ trên cột, rửa giải nhanh phân đoạn có chứa chất nghiên cứu Dịch rửa giải thu được đã loại bớt được nhiều tạp chất
3.1.3 Giai đoạn 3: Phân lập flavonoid glycosid bằng sắc ký cột silicagel pha đảo và tinh chế hợp chất phân lập được bằng sắc ký cột Sephadex LH-20
3.1.3.1 Phân lập flavonoid glycosid bằng sắc ký cột silicagel pha đảo
- Cột sắc ký có van điều chỉnh tốc độ chảy dung môi pha động, đường kính 1,5 cm, dài 80 cm
- Chất nhồi cột: Silicagel pha đảo
- Hệ dung môi pha động: Acetonitril - acid formic 0,1% (2:8)
Mô tả quá trình phân lập:
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol và để khô tự nhiên Sau đó lắp và cố định cột thẳng đứng trên giá, khóa van cột, lót một miếng bông mỏng ngay phía trên van sao cho các hạt sau khi nhồi không bị chảy ra khỏi cột
Nhồi cột: Sử dụng phương pháp nhồi cột ướt
Ngâm ngập 60g silicagel pha đảo trong methanol trong 24 giờ Sau 24 giờ, khuấy đều để tạo hỗn dịch, rót từ từ và liên tục vào cột (dùng đũa thủy tinh giúp rót hỗn dịch lên thành cột, tránh tạo bọt khí) Mở khóa van cột để dung môi chảy ra từ từ, hứng dung môi và đổ ngước trở lại cột, tránh để cột khô Cho dung môi chảy liên tục như trên cho đến khi cột ổn định Khóa van cột, chú ý đảm bảo dung môi luôn ngập trên mặt cột
Hoạt hóa cột bằng hệ dung môi pha động acetonitril - acid formic 0,1% (2:8) trước khi đưa mẫu lên cột: Mở khóa van cột, rửa cột bằng hệ acetonitril - acid formic 0,1%
(2:8) với thể tích tối thiểu bằng thể tích khối cột nhồi để toàn bộ dung môi trong cột sắc ký đều là acetonitril - acid formic 0,1% (2:8) Khóa van cột, chú ý đảm bảo dung môi luôn ngập trên mặt cột
Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn lượng cắn A thu được trong lượng tối thiểu methanol Đưa mẫu lên cột: Mở khóa van, khi dung môi gần chạm vào bề mặt giấy lọc thì khóa van, dùng pipet chuyển mẫu lên cột (đưa pipet xuống gần bề mặt cột nhất có thể không bị khuếch tán ngược trở lại bên trên, điều chỉnh tốc độ rửa giải là 1,2 ml/phút
Hứng dịch rửa giải và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng: Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm thể tích 10ml đã đánh số thứ tự, mỗi ống hứng với thể tích từ 4-5ml Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng để phát hiện phân đoạn chứa hợp chất flavonoid C-glycosid cần tìm
Chấm 5àl mỗi dung dịch thử lờn bản mỏng, khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô, phun thuốc thử NP/PEG và quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng UV 366nm
Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt giai đoạn phân lập bằng silicagel pha đảo
Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây Xấu hổ
3.2.1 Độc tính của hợp chất flavonoid glycosid trên đại thực bào phúc mạc
Chú thích: ns: p>0,05 Hình 3.7 Ảnh hưởng của isoorientin đến tỷ lệ sống của đại thực bào
Nhận xột: Isoorientin ở hai mức nồng độ 100 àM và 300 àM đều cho tỉ lệ sống của tế bào > 80% và sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p>0,05) Do đó, có thể thiết kế thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế NO ở dải nồng độ từ 3-300 àM
3.2.2 Tác dụng ức chế giải phóng NO của isoorientin
Hình 3.8 Ảnh hưởng của isoorientin đến giải phóng NO từ đại thực bào Raw 264.7
Bảng 3.2 Giá trị ức chế 50% (IC 50 ) của isoorientin trên giải phóng NO từ đại thực bào
Tỉ lệ % ức chế tại cỏc nồng độ khỏc nhau (àM) IC50 àg/mL
Nhận xét: Isoorientin thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO bởi đại thực bào hoạt húa bằng LPS Tỏc dụng này phụ thuộc nồng độ trong khoảng từ 3-300 àM và mối quan hệ nồng độ - đáp ứng tuân theo mô hình sigmoid đặc trưng Dựa vào phương pháp hồi quy phi tuyến trên phần mềm Graphad Prism, nồng độ ức chế 50% (IC50) lượng NO giải phúng của isoorientin là 34,73 àg/mL (23,20-55,37àg/mL) Trong khi đó, giá trị tương ứng cho chất tham chiếu L-NAME, một chất ức chế đặc hiệu là 0,652 àg/mL (0,532-0,800àg/mL).
Bàn luận
3.3.1 Phân lập hợp chất flavonoid từ cây Xấu hổ
3.3.1.1 Mục đích của việc phân lập
Bên cạnh loài Xấu hổ (Mimosa pudica L.) đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và tác dụng dược lý, ở nước ta hiện nay cũng có một loài Mimosa khác là loài
Mimosa diplotricha C Wright ex Sa (thường gọi là Trinh nữ móc, Trinh nữ thân vuông) do có hình thái tương tự và mọc gần nhau Dựa vào đặc điểm hình thái, có thể phân biệt được hai loài M pudica L và M diplotricha C Wright (loài Mimosa pudica
L có thân tròn, màu tím, gai mọc thành từng đôi đối nhau, cuống phụ lá xếp hình chân vịt; loài Mimosa diplotricha C Wright thân vuông, màu xanh, gai mọc rải rác theo chiều dài thân, cuống phụ lá xếp hình lông chim) [4] Điểm giống nhau về hình thái lớn nhất dễ gây nhầm lẫn khi thu hái giữa 2 loài này là sự nhạy cảm của lá khi chạm phải Tuy nhiên, dược liệu sau khi đã sấy khô và cắt nhỏ khó có thể phân biệt được bằng cảm quan
Theo tổng quan tài liệu, các hợp chất flavonoid phân lập được ở loài M diplotricha C.Wright chủ yếu là methoxy flavonoid như: 2-hydroxy-3,7,4′,8,5′- pentamethoxyflavon, 7,3′,4′-trihydroxy-3,8-dimethoxyflavon, 2-hydroxy-3,7,8,4,5- pentamethoxyflavon [41], 2′,5′-dihydroxy-3,7,8,4′-tetramethoxyflavon, 3′-hydroxy- việc phân lập được các hợp chất flavonoid-C-glycosid từ loài M pudica L để phân biệt với loài M diplotricha C.Wright là hoàn toàn phù hợp
Theo kết quả nghiên cứu của DS Bùi Thị Hồng Hạnh về đề tài “Khảo sát thành phần flavonoid trong các mẫu Xấu hổ thu hái tại một số vùng ở Việt Nam”, M pudica và M diplotricha được phân biệt bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi pha động: ethyl acetat - acid acetic - acid formic - nước (10:0,3:0,3:0,1) hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG và quan sát dưới ánh sáng UV 366 nm [7]
Hình 3.9 Sắc ký đồ phân biệt dịch chiết M pudica và M diplotricha ở bước sóng 254nm (A), 366nm (B) và sau khi hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG ở 366 nm(C) [6]
Tuy nhiên, luteolin không phải là chất để có thể lựa chọn để phân biệt được hai loài này nên việc tìm một marker khác để phân biệt là cần thiết 2 hợp chất nhóm nghiên cứu phân lập được đã phân biệt được 2 loài Mimosa pudica L và Mimosa diplotricha C
Wright, phục vụ cho việc xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Xấu hổ Hai hợp chất này đều có mặt ở loài Mimosa pudica L mà không có ở loài Mimosa diplotricha C Wright, giúp chúng trở thành một marker định tính có ý nghĩa cho loài Mimosa pudica L
Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC so sánh Mimosa pudica L và Mimosa diplotricha
3.3.1.2 Về phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các chất phân lập được
Isoorientin đã được phân lập lần đầu tiên từ mẫu Xấu hổ thu tại Vanuatu vào năm
1994, sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp sắc ký cột silicagel pha thường và pha đảo [19] Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Lobstein A cũng đã phân lập được isoorientin từ mẫu Xấu hổ thu tại Madagascar, sử dụng phương pháp HPLC điều chế [36] Trong nghiên cứu này, với điều kiện thí nghiệm sẵn có, isoorientin đã được phân lập từ mẫu Xấu hổ Việt Nam, sử dụng sắc ký cột Sephadex LH-20 và silicagel pha đảo
Bên cạnh isoorientin, cũng đã phân lập được hợp chất XH-glycosid 2 Tuy nhiên do hạn chế về mặt thời gian, lượng chất thu được quá ít nên không đo được phổ NMR Tuy nhiên, khi quét phổ UV XH-glycosid 2 cũng nhận 3 giá trị cực đại giống với hợp chất XH-glycosid 1 là 257nm, 269nm, 348nm Theo một số tài liệu tham khảo tìm kiếm được [18] [37], có một đồng phân của isoorientin cũng nhận 3 giá trị cực đại trên, đó là hợp chất orientin (hay luteolin-8-C-glucosid) có công thức cấu tạo như hình dưới đây
Hình 3.11 Công thức cấu tạo của orientin
Tuy chưa thể kết luận chính xác nhưng dự đoán XH-glycosid 2 là một đồng phân của isoorientin
3.3.2 Về tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid phân lập được
Isoorientin là một glucosid, cấu trúc hóa học của isoorientin có phần aglycon là luteolin gắn một gốc glucosyl tại vị trí C-6 Năm 2002, isoorientin được tìm thấy trong dịch chiết cồn của bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ [37] Đến năm 2011, Yang và cộng sự đã tìm thấy isoorietin có mặt trong lá của cây Xấu hổ [57] Isoorientin được tìm thấy ở một số loài thực vật như Zea mays, Pueraria tuberosa, Patrinia villosa, Lythrum salicaria, Anthopterus wardii,….[34] Nghiên cứu về tác dụng sinh học cho thấy, isoorientin thể hiện các hoạt động chống oxy hóa, kháng virus, giảm đau, chống ung thư và chống viêm [47] [30] [55] [20]
Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, isoorientin còn làm giảm sự phát triển của tình trạng viêm ở chuột bị phù chân do carrageenan gây ra [14] [34] [30] Isoorientin làm tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa, ức chế sự giải phóng các yếu tố gây viêm (IL-1 β , IL-6 và TNF- α), đồng thời làm giảm tổn thương oxy hóa gan và viêm gan ở chuột có chế độ ăn giàu fructose [54] Isoorientin ức chế sự kích hoạt MAPK và chuyển vị hạt nhân NF- κ B trong các tế bào microglia BV-2 được kích thích bằng LPS và do đó ngăn chặn sự biểu hiện của các cytokine gây viêm [54] Đối với bệnh nhân mắc phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), isoorientin được xác định có hoạt tính kháng viêm chống lại interleukin-8 (IL-8) và ức chế biểu hiện MMP-1 - một dấu hiệu viêm của bệnh COPD ở mức liều là 100 μg/ml [20] Trên mô hình đánh giá hiệu quả của isoorientin liều 25mg/kg đối với bệnh hen dị ứng do ovalbumin gây ra trên chuột, isoorientin làm giảm đáng kể nồng độ IL-4, IL-5, IL-13, malondialdehyd (MDA), NO và các loại oxy phản ứng (ROS), cải thiện đáng kể tình trạng tăng phản ứng đường thở, nhuộm hematoxylin-eosin cho thấy chuột đã cải thiện tình trạng thâm nhiễm tế bào viêm và giảm độ dày của kẽ, biểu hiện protein p-NF-κB-p65 và p-IκB-α cũng đã giảm [35]
Trên thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của isoorientin mà nhóm nghiên cứu đã thực hiện, nhận thấy isoorientin có khả năng ức chế sự giải phóng NO ở đại thực bào, góp phần làm giảm sự hình thành của yếu tố gây viêm
Như vậy có thể nhận thấy isoorientin đáp ứng yêu cầu của một chất đánh dấu, giúp phân biệt hai loài dễ nhầm lẫn, đồng thời cũng là một trong các thành phần đóng góp vào tác dụng chống viêm của dược liệu Xấu hổ Đây là cơ sở để lựa chọn isoorientin làm chất đánh dấu trong xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Xấu hổ cũng như các chế phẩm từ dược liệu này
KẾT LUẬN
Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Phân lập và đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất Flavonoid C-glycosid từ cây Xấu hổ” , nhóm nghiên cứu thu được kết quả sau:
1.1 Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cây Xấu hổ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được 2 hợp chất thuộc nhóm Flavonoid C-glycosid, trong đó xác định được cấu trúc của 1 hợp chất là isoorientin (XH-glycosid 1) và dự đoán cấu trúc của hợp chất còn lại (XH-glycosid 2) là đồng phân của isoorientin
1.2 Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid phân lập từ cây Xấu hổ
Isoorientin thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO bởi đại thực bào hoạt hóa bằng LPS Tỏc dụng này phụ thuộc nồng độ trong khoảng từ 3-300 àM và mối quan hệ nồng độ - đáp ứng tuân theo mô hình sigmoid đặc trưng Dựa vào phương pháp hồi quy phi tuyến trên phần mềm Graphad Prism, nồng độ ức chế 50% (IC50) lượng NO giải phúng của isoorientin là 34,73 àg/mL (23,20-55,37àg/mL).
ĐỀ XUẤT
Từ những kết quả thu được, nhóm nghiên cứu xin được đề xuất:
1 Tiếp tục phân lập để xác định công thức chính xác của hợp chất XH-glycosid 2
2 Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Xấu hổ cũng như các chế phẩm dựa trên chất đánh dấu được lựa chọn là isoorientin.