Phương pháp sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào 232.4.3.. DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ H
TỔNG QUAN
Đại cương về viêm
Viêm là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, nhưng cũng được coi là phản ứng bệnh lý do quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các cơ quan Các đặc trưng của viêm bao gồm: sưng, nóng, đỏ, đau [1], [16]
Mọi nguyên nhân dẫn đến tổn thương và làm chết một lượng tối thiểu tế bào tại chỗ đều có thể gây viêm tại vị trí đó Nguyên nhân gây viêm được chia thành hai nhóm chính theo nguồn khởi phát của phản ứng viêm là nguyên nhân ngoại sinh và nội sinh [1], [16]
- Cơ học: từ sây sát nhẹ đến chấn thương nặng, gây phá hủy tế bào và mô
- Vật lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hoá protid tế bào gây tổn thương enzym, tia xạ (UV, tia X) tạo ra các gốc oxy tự do gây phá hủy một số enzym oxy hóa và gây tổn thương ADN
- Hoá học: các acid, base mạnh, các chất hoá học (thuốc trừ sâu, các độc tố) gây huỷ hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym
- Sinh học: virus, vi khuẩn, ký sinh trùng đơn bào, đa bào hoặc nấm [1], [16]
Có thể gặp các nguyên nhân như thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng Ngoài ra, viêm có thể xuất phát từ phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể, như viêm cầu thận, viêm trong hiện tượng Arthus [1], [16]
1.1.3 Diễn biến cơ bản của quá trình viêm
Tại ổ viêm, có 4 quá trình biến đổi chủ yếu: rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, tổn thương mô và tăng sinh tế bào Các quá trình này diễn ra đan xen và liên quan chặt chẽ với nhau [1]
Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm xuất hiện sớm, ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể Biến đổi này gồm 4 hiện tượng chính:
Ngay khi các yếu tố gây viêm tác động, ổ viêm lần lượt xuất hiện các hiện tượng sau:
Co mạch: Hiện tượng co mạch có tính phản xạ xảy ra rất sớm và rất ngắn do thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại [1], [30]
4 Sung huyết động mạch: Xảy ra ngay sau co mạch, là sự giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các hóa chất trung gian có hoạt tính từ tế bào mast và bạch cầu hay các sản phẩm tạo ra sau quá trình thực bào của bạch cầu Động mạch vi tuần hoàn giãn rộng, tăng cả lưu lượng lẫn áp lực máu Biểu hiện bên ngoài của sung huyết động mạch là máu đỏ tươi, căng phồng, đau và nóng [1], [30]
Sung huyết tĩnh mạch: Thần kinh vận mạch bị tê liệt, các chất gây giãn mạch ứ lại nhiều hơn tại ổ viêm Ổ viêm bớt nóng, từ màu đỏ tươi của giai đoạn sung huyết động mạch chuyển sang màu tím sẫm, phù do tăng tính thấm, cảm giác đau giảm, chuyển sang đau âm ỉ do hóa chất trung gian và các ion K + , H + tích tụ lại Quá trình này giúp dọn sạch ổ viêm, ngăn cản sự lan rộng của các tác nhân gây bệnh [1], [30] Ứ máu: Sau sung huyết tĩnh mạch, hiện tượng ứ máu xuất hiện do một số cơ chế như bạch cầu bám vào thành mạch, cản trở lưu thông máu, tế bào nội mô hoạt hóa và phì đại làm xuất hiện nhiều tế bào bám dính, các chất dãn mạch như NO, histamin làm tăng tính thấm dẫn đến máu đặc quánh, tăng độ nhớt máu tạo ma sát lớn Hiện tượng ứ máu có vai trò cô lập ổ viêm, tăng cường quá trình sửa chữa ô viêm và khiến các yếu tố gây bệnh không thể lan rộng [1], [30]
Dịch rỉ viêm là sản phẩm xuất tiết tại ổ viêm xuất hiện từ giai đoạn sung huyết động mạch và có tính chất bảo vệ Tuy nhiên, lượng lớn dịch rỉ viêm sẽ gây chèn ép mô xung quanh gây đau nhức hoặc hạn chế vận động các cơ quan Dịch rỉ viêm gồm 2 thành phần chính:
Các thành phần bình thường từ máu thoát ra như nước, muối, protein huyết tương và các thành phần hữu hình của máu tích tại ổ viêm (gồm hồng cầu, tiểu cầu và chủ yếu là bạch cầu) [1], [30]
Các chất mới được hình thành do rối loạn chuyển hóa và tổn thương mô, bao gồm: các hóa chất trung gian như histamin, serotonin, acetylcholin; các protein khối lượng phân tử nhỏ từ 8 – 12 acid amin; các acid nhân; các enzym do hoại tử tế bào [1], [30]
Bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngoại vi tới bề mặt nội mô thành mạch khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch và máu chảy chậm Bạch cầu trườn theo vách mạch, bám dính và xuyên mạch [1]
Tùy thuộc vào bản chất của tác nhân gây viêm, giai đoạn viêm mà các loại bạch cầu tới vị trí viêm sẽ khác nhau Ở đa số giai đoạn viêm cấp, giai đoạn đầu chủ yếu là bạch cầu trung tính, tiếp theo là bạch cầu mono, cuối cùng là bạch cầu ái toan [1]
Bạch cầu thực bào là hiện tượng bạch cầu bắt giữ, tiêu diệt yếu tố gây viêm Có hai cơ chế chính là phụ thuộc oxy (nhờ quá trình oxy hóa của NADPH oxidase, myeloperoxidase và NO synthetase), và cơ chế không phụ thuộc oxy (nhờ các enzym trong lysosom) [1]
Rối loạn chuyển hóa glucid Ở giai đoạn sung huyết động mạch, sự chuyển hóa glucid chủ yếu là ái khí, tạo ra
CO2 Khi bắt đầu có chuyển hóa yếm khí sẽ tạo ra acid lactic tích tụ lại trong ổ viêm, do vậy pH giảm dầu từ ngoài vào trong [1]
Rối loạn chuyển hóa lipid
Tại ổ viêm, lượng acid béo, lipid và cetonic đều tăng cao Ngoài tác động của yếu tố gây viêm, acid arachidonic chuyển hóa thành prostaglandin và leucotrien sẽ gây giãn mạch mạnh, gây sốt [1]
Rối loạn chuyển hóa protid
Tổng quan về cây muồng lùn
Cây muồng lùn, hay còn có tên gọi khác là me đất, là cây thuộc họ Đậu (Fabaceae), có tên khoa học là Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen, tên đồng danh là Cassia pumila Lam., Cassia prostrata Roxb hoặc Senna prostrata Roxb [3]
Muồng lùn là loài cây thảo có gốc hóa gỗ, cây cao khoảng 40 cm, mọc đứng, trên các nhánh thường có lông mịn Lá cây dài khoảng 2 – 5 cm, hình ngọn giáo Cuống lá dài 3 -7 cm và có lông mịn Lá chét từ 10 - 25 đôi, không có cuống, tròn ở đầu với một mũi dài [3] Hoa của cây muồng lùn mọc đơn độc hay thường xếp thành 2-3 bông tạo thành chùm ở trên nách lá Cuống hoa có lông mịn Cánh hoa màu vàng bóng, hình dạng thuôn xoan ngược và có kích thước không đều nhau Hoa nhị 5, bầu có lông mềm Quả đậu hình dải dài, kích thước 2-5 x 0,5 cm Mỗi quả chứa từ 10 - 15 hạt có dạng gần hình thoi, màu nâu bóng [3]
Hình 1.2: Hình ảnh cây muồng lùn
14 Tại Việt Nam, muồng lùn mọc hoang ở nhiều nơi như Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hóa, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai Cây ra hoa vào khoảng tháng 8-9 hàng năm, có quả sau 1-3 tháng Ngoài ra muồng lùn còn xuất hiện ở một số nước châu Á như Ấn độ, Mianma, Trung Quốc, Lào và Thái Lan [3]
Thành phần hóa học chính của chi Chamaecrista là Anthranoids [15] Cây muồng lùn chỉ mới được các nhà khoa học để ý tới trong giai đoạn gần đây dù trong y học dân gian nó đã được sử dụng phổ biến Các nghiên cứu chiết xuất và phân lập từ năm 2008 đã dần làm sáng tỏ cấu trúc và các thành phần có trong cây, mở ra nhiều hướng tiếp cận trong việc tìm ra, chứng minh các tác dụng sinh học cũng như đánh giá tiềm năng trở thành ứng viên trong nghiên cứu phát triển thuốc mới
Một số nghiên cứu trong giai đoạn 2008 đến 2018 phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong cây muồng lùn được chúng tôi tổng hợp trong bảng 1.1
B ả ng 1.2: M ộ t s ố nghiên c ứu xác đị nh thành ph ầ n hóa h ọ c trong cây mu ồ ng lùn
Năm Tác giả Kết quả TLTK
2008 Ankita Yadav và cộng sự
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất phytosterol bao gồm β-sitosterol, lanosterol, campersterol, stigmasterol Các phytosterol này có hàm lượng khác nhau trong các bộ phận khác nhau
2011 Xiang Wan và cộng sự
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat bao gồm fisetinidol, liquiritigenin, 1-propanone, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)- 1-(2,4,6-trihydroxyphenyl), trans-scirpusin A, luteolin, piceatannol, resveratrol
Phân lập được sennosid A, B, C, D và rhein-8-O- glycosid từ bột quả khô [44]
2012 Singh Daulat và cộng sự
Một số flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc bao gồm kaempferol-7-O-glucosid, kaempferol và quercetin
Các thành phần trong toàn cây muồng lùn bao gồm emodin, chrysophanol, physcion, diterpene, alcaloid, [48]
15 acid chrysophanic, dihydro xanthyletin, 1- hentriacontanol, 1-hexacosanol, 1-tetratriacontanol
Phân lập được 2 hợp chất flavonoid là 8-hydroxy-7- (3-hydroxypropyl)-2′-methoxyflavone và 8-hydroxy- 7-(2-hydroxyethyl)- 2′-methoxyflavone
Việc chiết xuất và phân lập các thành phần trong cây phụ thuộc rất nhiều vào dung môi do chúng liên quan trực tiếp đến độ tan của các chất hóa học Các phân đoạn dung môi được sử dụng khác nhau có thể chứa các thành phần khác nhau Một số dung môi phổ biến trong các nghiên cứu hóa thực vật bao gồm petroleum, benzen, aceton, cloroform, ethanol và nước B L Sharma và cộng sự năm 2012 đã định tính được một số thành phần ở các phân đoạn khác nhau của C.pumila [48]
B ả ng 1.3 : Đị nh tính m ộ t s ố h ợ p ch ấ t ở các phân đoạ n khác nhau c ủ a C.pumila
Petroleum Benzen Aceton Cloroform Alcohol Nước
Anthraquinon - - - + Đối với phân đoạn ethyl acetat của cây muồng lùn, năm 2011 Xiang Wan và cộng sự đã tiến hành phân lập các hợp chất bao gồm fisetinidol, liquiritigecnin, 1-propanone, 3- (3,4-dihydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl), trans-scirpusin A, luteolin, piceatannol, resveratrol [56] Vũ Thanh Bình cùng cộng sự năm 2022 đã phân lập hai dẫn xuất stilben-phenylpropanoid mới là chamaecristanol A và chamaecristanol B [55] Cùng năm 2022, Bùi Thị Thúy Luyện cùng cộng sự đã phân lập ra một hợp chất mới là 4,7- dihydroxy-2-hydroxymethyl-5,6-dime-thoxyanthraquinone [25]
Cây muồng lùn đã được sử dụng theo y học dân gian trong điều trị một số bệnh Phần trên mặt đất của muồng lùn thường được đun nước uống giúp chống viêm, mát gan, giải
16 độc trong một số bệnh như xơ gan, viêm gan Đồng bào ở Hòa Bình sử dụng cây muồng lùn trong các bài thuốc chữa bệnh về gan Một số thầy thuốc ở Quảng Ninh dùng cây muồng lùn chữa các bệnh đau cơ xương khớp Một số nước châu Á khác sử dụng rễ cây để điều trị lỵ, người dân Ấn Độ dùng lá muồng lùn để điều trị làm giảm đau mắt [3], [35]
Hiệu quả điều trị của muồng lùn đã được kiểm chứng trong các nền y học dân gian Tuy nhiên hiểu biết của con người về tác dụng và tiềm năng của cây muồng lùn vẫn còn rất hạn chế Tri thức y học cổ truyền đã gợi ý cho khoa học hiện đại về các tác dụng sinh học liên quan đến hoạt động chống viêm Trên cơ sở đó, nhiều nghiên cứu in vitro đã được thực hiện, tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng chống viêm của cây muồng lùn
Dù chỉ mới là bước đầu, song những kết quả này mang rất nhiều ý nghĩa trong việc định hướng cho các nghiên cứu sau này, bao gồm cả đề tài mà chúng tôi thực hiện
Một số nghiên cứu nền tảng về tác dụng sinh học cây muồng lùn đã được công bố:
Tác dụng chống oxy hóa
Gần đây, các tác giả Vũ Thanh Bình, Phạm Đức Vịnh và cộng sự nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của muồng lùn Nghiên cứu này tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần và các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, chloroform, n-butanol và phân đoạn nước bằng thử nghiệm dọn gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và superoxid Kết quả cho thấy cao toàn phần có tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid với IC50 tương ứng là 18,65 (9,91 - 35,08) và 12,33 (5,24 - 29,02) àg/ml Trong số các phân đoạn, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid tốt nhất với giỏ trị IC50 lần lượt là 9,98 (6,23 - 16,01) và 8,38 (6,11 - 11,50) àg/ml [10]
Năm 2022, Vũ Thanh Bình và cộng sự đã công bố tác dụng chống viêm của hai dẫn xuất stilben-phenylpropanoid mới từ cây muồng lùn Hai hợp chất mới được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat có tên là chamaecristanols A và B Kết quả ức chế giải phóng NO do LPS gây viêm trên tế bào Raw 264.7 của 2 chất này được thể hiện qua giá trị IC50 lần lượt là 41,69 ± 1,34 và 32,14 ± 0,15 μM [55] Các kết quả này cũng gợi ý thực hiện các nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm tiếp theo đối với các chất phân lập từ muồng lùn
Năm 2012, Ram Avtar Sharma và cộng sự nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của nhóm sennosides chiết xuất từ muồng lùn Nhóm tác giả đã phân lập được một số anthranoid thuộc nhóm sennoside của loài C.pumila và chứng minh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm trên các phân đoạn dược liệu cũng như các hợp chất phân lập được Kết quả cho thấy, phân đoạn cloroform có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm nhưng giá trị MIC cao hơn nhiều
17 lần so với các chất đối chứng như tetracyclin, gentamycin, nystatin Các hợp chất anthranoid phân lập được như sennoside A, B, C, D và Rhein-8-O-glycosid cũng có hoạt tính trên nhưng MIC cao hơn các chất đối chứng gấp nhiều lần (từ 7 đến 20 lần) Cụ thể Sennosid D cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với Streptococcus pneumoniae trong khi sennosid B cho thấy hoạt tính kháng nấm tối đa đối với Rhizoctonia bataticola với MIC tương ứng là
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cây muồng lùn được thu hái tự nhiên tại Lạc Sơn, Hòa Bình vào tháng 9 năm 2016 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng - Trường Đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mang số hiệu HNIP/18301/17 được lưu tại Phòng Tiêu bản cây thuốc - Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội Đề tài nghiên cứu một số chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn Các chất phân lập cùng công thức hóa học do TS Bùi Thị Thúy Luyện - Khoa Công nghệ Hóa dược
- Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn
STT Ký hiệu Tên khoa học Công thức hóa học
Các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn được hòa tan trong DMSO để được dung dịch có nồng độ 50 mM và lưu trữ tại nhiệt độ -20 o C Đối với từng thử nghiệm, mẫu thử được pha loãng trong môi trường nuôi cấy đến các nồng độ thích hợp
Nguyên vật liệu, thiết bị
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10 - 12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 35 g, khỏe mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do
2.2.2 Dòng tế bào Đại thực bào Raw 264.7 được cung cấp bởi American Type Culture Collection Đại thực bào phúc mạc được phân lập từ chuột nhắt chủng Swiss tại phòng thí nghiệm Dược lý phân tử - Trường Đại học Dược Hà Nội
Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.2
Bảng 2.2: Danh mục hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Nguồn gốc
1 Dimethyl sulfoxide Merck KgaA, Đức
4 Fetal bovine serum PAN Biotech, Đức
6 Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher, Hoa Kỳ
8 Trypan blue Gibco, Hoa Kỳ
9 CM-H2DCFDA Invitrogen, Hoa Kỳ
10 MitoSOX red Invitrogen, Hoa Kỳ
13 Bovine Serum Albumin Sigma, Đức
14 Kháng thể sơ cấp anti-Ki67 Abcam, Anh
15 Kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ liên hợp huỳnh quang Alexa-488
16 Môi trường gắn DAPI Abcam, Anh
17 Thioglycolat Franklin Lakes, Hoa Kỳ
18 Thuốc thử Griess A Promega, Wisconsin
19 Thuốc thử Griess B Promega, Wisconsin
20 Elisa max deluxe set Biolegend, Hoa Kỳ
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.2
Bảng 2 3 : Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT Dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất
1 Tủ nuôi cấy vô trùng Telstar, Tây Ban Nha
2 Bể điều nhiệt Shel Lab, Hoa Kỳ
3 Máy ly tâm Beckman Coulter, Hoa Kỳ
4 Tủ ấm CO2 Incusafe, Nhật Bản
5 Máy đo pH Eutech, Singapore
6 Tủ đông -80 o C Sanyo, Nhật Bản
7 Tủ lạnh 150L Sanyo, Nhật Bản
8 Nồi hấp tiệt trùng Sturdy, Hoa Kỳ
10 Kính hiển vi vật kính ngược Zeiss, Đức
21 Máy đọc đĩa Varioskan Lux Thermal Fisher, Hoa Kỳ
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu bao gồm 2 nội dung chính
Nội dung 1: Sàng lọc tác dụng chống viêm của một số chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc Ban đầu, độc tính tế bào của các chất được đánh giá tại các nồng độ khác nhau để lựa chọn nồng độ thích hợp cho thử nghiệm chính Sau đó, hoạt tính chống viêm của các chất
22 được so sánh tại các mức nồng độ tương đương, sử dụng thử nghiệm gây giải phóng NO trên đại thực bào để lựa chọn chất tiềm năng nhất dựa trên hoạt tính và tính mới
Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế chống viêm của chất tiềm năng đã chọn từ nghiên cứu sàng lọc
Tác dụng chống viêm của chất tiềm năng được đánh giá thông qua định lượng các chất trung gian của quá trình viêm bao gồm NO, IL-6 và IL-1β Ngoài ra, để định hướng cơ chế chống viêm, ảnh hưởng của chất này lên sự hoạt hóa yếu tố sao mã gen NF-κB, quá trình chết tế bào theo chương trình do viêm (pyroptosis) và sản xuất nhóm oxy hoạt động (ROS) cũng được nghiên cứu
Nghiên cứu được thiết kếthực hiện theo sơ đồ ở hình 2.1
Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Sàng lọc tác dụng chống viêm của một số chất phân lập từ phân đoạn ethylacetat muồng lùn Đánh giá khả năng gây độc tế bào Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO Đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng
Xác định IC50 trên hoạt tính giải phóng NO Đánh giá ảnh hưởng đến hình thái tế bào Đánh giá tác dụng ức chế hình thành ROS Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng
IL-6 và IL-1β Đánh giá tác dụng ức chế pyroptosis Đánh giá tác dụng ức chế chuyển vị NF-κB
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 P hương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào
2.4.1.1 Phân lập đại thực bào phúc mạc
Chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 ml dung dịch thioglycolat 4% để huy động đại thực bào Sau 3 ngày, tiến hành phân lập đại thực bào Giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng bằng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 ml dung dịch muối cân bằng vào khoang phúc mạc của chuột Lắc nhẹ, liên tục trong 5 phút và thu hồi hỗn dịch tế bào từ khoang phúc mạc vào một ống 15 ml trong đá Dịch rửa được ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào Phân tán lại tế bào trong môi trường RPMI 1640 đầy đủ (chứa 10% FBS và 1% hỗn hợp kháng sinh penicillin/streptomycin) để thu hỗn dịch tế bào Sau khi phân lập, tế bào được cấy vào đĩa nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2, độ ẩm 95% trong tủ ấm nuôi cấy với mật độ thích hợp, tùy thuộc vào mỗi loại thí nghiệm cụ thể Sau khi ủ 2 giờ trong tủ nuôi cấy, thay thế môi trường nuôi cấy để loại bỏ các tế bào không kết dính
2.4.1.2 Nuôi cấy đại thực bào Raw 264.7
Tế bào Raw 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM đầy đủ (chứa 10% FBS và 1% hỗn hợp kháng sinh penicillin/streptomycin) Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2, độ ẩm 95% trong tủ ấm nuôi cấy trên đĩa petri 10 cm
Khi tế bào đạt trạng thái ổn định ở pha log, mật độ tế bào đạt trên 80% đĩa nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển 2 lần để chuẩn bị tế bào cho thí nghiệm
Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong đĩa petri và bổ sung 2 ml môi trường DMEM đầy đủ Tiếp đó dùng cell scraper để cạo lớp tế bào bám dính dưới đáy đĩa và chuyển tất cả dịch từ đĩa nuôi cấy vào ống 15 ml Ly tâm ống với tốc độ 2500 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào Phân tán lại tế bào trong môi trường DMEM đầy đủ, đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Neubauer Pha loãng tế bào để cấy trải ra đĩa với mật độ phù hợp với mỗi thí nghiệm hoặc tiếp tục được nuôi cấy chu kỳ tiếp theo trong tủ ấm nuôi cấy
2.4.2 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào Đại thực bào được kích thích đáp ứng viêm bằng tác nhân gây viêm lipopolysacarid (LPS) LPS kích thích đại thực bào giải phóng ra các chất trung gian hóa học (PGE2, NO, các cytokin)
24 Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng sản phẩm chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy tế bào Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng chống viêm khi làm giảm giải phóng NO có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng
Kiểm tra khả năng gây độc tế bào của các chất bằng phương pháp MTT Nếu ảnh hưởng đến khả năng sống, tế bào sẽ giảm sản sinh NO gây ảnh hưởng đến kết quả sàng lọc Mẫu thử được coi là có tiềm năng chống viêm khi ức chế giải phóng NO có ý nghĩa so với mẫu chứng nhưng không ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống của tế bào
2.4.2.1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào của chất phân lập trên đại thực bào phúc mạc Nguyên tắc
Thử nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào là phương pháp đánh giá khả năng sống của tế bào dựa trên khả năng tế bào tham gia phản ứng oxy hoá khử với MTT Chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) mang điện tích dương và có các nhóm thân lipid nên có khả năng đi qua màng tế bào và bị khử bởi các enzym oxidoreductase, dehydrogenase, oxidase, peroxidase phụ thuộc NAD(P)H trong ty thể hoặc tương bào của các tế bào sống [7]
Sản phẩm của quá trình khử MTT là formazan dạng kết tinh Formazan tan trong DMSO tạo dung dịch màu tím Dung dịch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị độ hấp thụ của dung dịch [7]
Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần Thí nghiệm gồm các nhóm mẫu: nhóm chứng trắng và nhúm mẫu thử (cỏc nồng độ 10 àM, 30 àM và 100 àM)
Tiến hành Đại thực bào phúc mạc sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 1x10 5 tế bào/giếng trong môi trường RPMI 1640 đầy đủ và được thay mới môi trường sau
2 giờ, tiếp tục ủ qua đêm
Tiếp đó ủ tế bào với môi trường chứa các nhóm mẫu trong 2 giờ Thêm LPS 100 ng/ml vào nhúm mẫu thử, tiếp tục ủ qua đờm Khi kết thỳc thời gian ủ, thờm 10 àl MTT 5 àg/ml vào mỗi giếng và ủ trong 1 giờ Loại bỏ môi trường để thu các tinh thể kết kinh màu tím ở đỏy đĩa Thờm 200 àl DMSO vào mỗi giếng và lắc đĩa để hũa tan hoàn toàn tủa formazan Đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 570 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX Đánh giá kết quả
Thông số đánh giá: tỷ lệ tế bào sống
Tỷ lệ tế bào sống được tính theo công thức: I = OD mẫu thử / OD chứng 𝑥 100%
Mẫu thử được coi là không có độc tính trên tế bào nếu tỷ lệ tế bào sống so với lô chứng viêm I ≥ 80%
2.4.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của các chất phân lập trên đại thực bào phúc mạc
Tác dụng ức chế giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng sản phẩm chuyển hóa nitrit/nitrat Trong môi trường nuôi cấy tế bào, NO được chuyển hóa nhanh chóng thành nitrit/nitrat dưới tác động của oxy Sản phẩm nitrit/nitrat được định lượng bằng thuốc thử Griess (sulphanilamid (SA) và N-naphthyl-ethylenediamin (NED)) Thuốc thử Griess chuyển đổi nitrit/nitrat thành thuốc nhuộm azo màu tím có thể đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm [9]
Sơ đồ phản ứng được mô tả ở hình 2.2
Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng nitrit/nitrat với thuốc thử Griess Thiết kế thí nghiệm
Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần Thí nghiệm gồm các nhóm mẫu: nhóm chứng trắng; nhóm chứng viờm; nhúm mẫu thử (cỏc nồng độ 10 àM, 30 àM và 100 àM)
Tiến hành Đại thực bào phúc mạc sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 1x10 5 tế bào/giếng trong môi trường RPMI 1640 đầy đủ và được thay mới môi trường sau
2 giờ, tiếp tục ủ qua đêm
Tiếp đó, ủ tế bào với môi trường chứa các nhóm mẫu trong 2 giờ, sau đó thêm LPS
100 ng/ml vào nhóm chứng viêm và nhóm mẫu thử, tiếp tục ủ qua đêm Khi kết thúc thời gian ủ, hỳt chuyển 50 àl mụi trường trong mỗi giếng sang một đĩa 96 giếng mới Sau đú, thờm 25 àl dung dịch sulfanilamid (0,23 M) và ủ 5 phỳt ở nhiệt độ phũng, trong búng tối trước khi thờm 25 àl N-1-napthylethylenediamin dihydrochlorid (15,4 mM) tới hỗn hợp phản ứng Sau khi tiếp tục ủ thêm 5 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 540 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX Đánh giá kết quả
Thông số đánh giá: nồng độ NO và phần trăm ức chế giải phóng NO
Xác định hàm lượng NO giải phóng thông qua đường chuẩn tuyến tính nồng độ NO – độ hấp thụ (OD) được xây dựng với chất chuẩn NaNO2
Phần trăm ức chế giải phóng NO được tính theo công thức:
(trong đó CLPS và Cthử lần lượt là nồng độ NO của tế bào trong nhóm chứng viêm và mẫu thử)
Mẫu thử được coi là có tác dụng ức chế giải phóng NO khi nồng độ NO giảm có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng viêm (p < 0,05)
Dựa trên kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất, kết hợp các tài liệu khoa học nghiên cứu về tác dụng chống viêm của các chất này, lựa chọn chất có tác dụng chống viêm tiềm năng mạnh để tiếp tục đánh giá tác dụng chống viêm và cơ chế liên quan 2.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng nhất trên đại thực bào
2.4.3.1 Xác định giá trị IC 50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO
Từ kết quả sàng lọc của chất tiềm năng, nhóm nghiên cứu tiến hành xác định giá trị
IC50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO ở hai dòng tế bào: đại thực bào phúc mạc và đại thực bào Raw 264.7
Phương pháp xử lý số liệu
Phân tích thống kê và biểu diễn kết quả bằng đồ thị được thực hiện trên phần mềm GraphPad Prism 9 Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng phân tích T-test Sự khác biệt giữa các mẫu được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05
Xác định giá trị IC50 bằng phương pháp phân tích hồi quy phi tuyến log (inhibitor) & normalized respone – variable slope Kết quả được biểu diễn dưới dạng IC50 và khoảng tin cậy 95%
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn
3.1.1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào trên đại thực bào
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lựn tại nồng độ 10 àM, 30 àM và 100 àM đến khả năng sống của đại thực bào phỳc mạc được thể hiện ở hình 3.1
Tỷ lệ tế bào sống (%)
Hình 3.1: Ảnh hưở ng c ủ a các ch ấ t đế n kh ả năng số ng c ủ a đạ i th ự c bào phúc m ạ c
Chú thích: # tỷ lệ tế bào sống < 80%
Cỏc chất ML1 và ML2 tại nồng độ ≥ 30 àM làm giảm đỏng kể khả năng sống sút của đại thực bào Tỷ lệ tế bào sống của chất ML1 và ML2 tại nồng độ ≥ 30 àM dưới 80% so với nhóm chứng trắng
Chất ML1, ML2 tại nồng độ 10 àM và cỏc chất cũn lại (ML3-7) ở nồng độ ≤ 100 àM không ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sống của đại thực bào Tỷ lệ tế bào sống của những mẫu này đạt trên 80% so với nhóm chứng trắng
Từ kết quả thử nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào, tiến hành thử nghiệm đánh giỏ tỏc dụng ức chế giải phúng NO đối với cỏc chất ML1, ML2 tại nồng độ 10 àM và cỏc chất cũn lại (ML3-7) ở nồng độ 10 àM, 30 àM và 100 àM
3.1.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào
Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn thể hiện mối quan hệ nồng độ nitrit/nitrat (àM) – mật độ quang (OD) là: OD = 0,0091 x C nitrit + 0,0024
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lựn tại nồng độ 10 àM, 30 àM và 100 àM được thể hiện ở hỡnh 3.2
Hình 3.2: Ảnh hưởng của các chất đến khả năng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc
Chú thích: * p < 0,05 so với chứng trắng; # p < 0,05 so với chứng viêm
Khi ủ với LPS, nồng độ NO giải phóng trong nhóm chứng viêm tăng cao (tăng 34,9 lần so với nhóm chứng trắng) Điều này chứng tỏ thử nghiệm gây giải phóng NO đủ nhạy để sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất quan tâm
Nồng độ NO trong cỏc mẫu thử ML1, ML2 ở nồng độ 10 àM; ML3 và ML4 ở nồng độ ≥ 30 àM và ML6 ở nồng độ ≥ 10 àM đều khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ so với nhúm chứng viêm Trong đó, ML6 là chất có nồng độ NO thấp nhất ở cả 3 nồng độ
Chất ML5 và ML7 thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO yếu, nồng độ NO ở những mẫu này không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng viêm
Trong 7 chất thử được sàng lọc tác dụng chống viêm, chất ML6 là chất thể hiện tác dụng ức chế NO mạnh nhất ML6 là hợp chất mới được phân lập năm 2022 và hiện chưa
36 được nghiên cứu tác dụng chống viêm Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn chất ML6 để tiếp tục đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan.
Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của ML6 36 1 Giá trị IC 50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO
3.2.1 G iá trị IC 50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO
Giá trị IC 50 trên đại thực bào phúc mạc
Kết quả đỏnh giỏ tỏc dụng ức chế giải phúng NO của ML6 tại cỏc nồng độ 0,3 àM; 1 àM; 3 àM; 10 àM và 30 àM trờn đại thực bào phỳc mạc được thể hiện ở hỡnh 3.3
Hình 3.3 : Ảnh hưởng của ML6 đến khả năng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc
(A) Nồng độ NO (àM) tại cỏc nồng độ thử
(B) Đồ thị tương quan lg(C) – % ức chế của ML6 và chất đối chiếu L-NAME Chú thích: * p < 0,05 so với chứng trắng; # p < 0,05 so với chứng viêm
Khi ủ với LPS, nồng độ NO giải phóng trong nhóm chứng viêm tăng cao (tăng 29,13 lần so với nhóm chứng trắng) Điều này chứng tỏ thử nghiệm gây giải phóng NO đủ nhạy để xác định giá trị IC50 trên đại thực bào phúc mạc
Chất ML6 cỏc nồng độ từ 0,3 – 30 àM đều cú tỏc dụng ức chế giải phúng NO trờn đại thực bào phúc mạc sau khi bị kích thích bởi LPS 100 ng/mL Nồng độ NO trong dịch nuôi cấy tế bào sau khi được ủ với chất ML6 đều giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng viờm Nồng độ NO trong mẫu ML6 tại cỏc nồng độ 0,3; 1; 3; 10 và 30 àM lần lượt là 14,35 àM; 10,95 àM; 9,41 àM, 5,53 àM; 1,93 àM
% ức c hế gi ải p hón g N O
37 Giá trị IC50 của ML6 và chất đối chiếu L-NAME đối với khả năng ức chế giải phóng
NO trờn đại thực bào phỳc mạc lần lượt là 3,822 àM (2,306 – 6,334 àM) và 0,272 àM (0,168 – 0,429 àM)
Chất ML6 thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc, tuy nhiên tác dụng này yếu hơn so với chất đối chiếu L-NAME
Giá trị IC 50 trên tế bào Raw 264.7
Kết quả đỏnh giỏ tỏc dụng ức chế giải phúng NO của ML6 tại cỏc nồng độ 1 àM; 3 àM; 10 àM; 30 àM và 100 àM trờn tế bào Raw 264.7 được thể hiện như hỡnh 3.4
20 40 60 80 100 lg(C) P hần t ră m ức c hế gi ải p hón g N O
Hình 3.4: Ảnh hưởng của ML6 đến khả năng ức chế giải phóng NO trên tế bà o Raw
(A) Nồng độ NO (àM) tại cỏc nồng độ thử
(B) Đồ thị tương quan lg(C) – % ức chế của chất ML6 và L-NAME
Chú thích: * p < 0,05 so với chứng trắng; # p < 0,05 so với chứng viêm
Khi ủ với LPS, nồng độ NO giải phóng trong nhóm chứng viêm tăng cao (tăng 24,97 lần so với nhóm chứng trắng) Điều này chứng tỏ thử nghiệm gây giải phóng NO đủ nhạy để xác định giá trị IC50 trên đại thực bào Raw 264.7
Chất ML6 cỏc nồng độ từ 1 - 100 àM đều cú tỏc dụng ức chế giải phúng NO trờn tế bào Raw 264.7 sau khi bị kích thích bởi LPS 100 ng/mL, nồng độ NO trong dịch nuôi cấy tế bào sau khi được ủ với chất ML6 đều giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng viêm Nồng độ NO trung bỡnh của cỏc mẫu thử ở cỏc nồng độ 1; 3; 10; 30 và 100 àM lần lượt là 13,77 àM; 13,53 àM; 11,83 àM; 5,85 àM; 2,52 àM
Giá trị IC50 của ML6 và chất đối chiếu L-NAME đối với khả năng ức chế giải phóng
NO trờn tế bào Raw 264.7 lần lượt là 19,120 àM (9,655 – 38,680 àM) và 0,803 àM (0,462 – 1,416 àM)
38 Chất ML6 thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO trên tế bào Raw 264.7, tuy nhiên tác dụng này yếu hơn so với chất đối chiếu L-NAME
3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng đến hình thái đại thực bào
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của ML6 đến hình thái đại thực bào phúc mạc được kích thích bằng LPS thể hiện qua hình 3.5
Chứng trắng Chứng viờm ML6 - 1 àM ML6 - 10 àM
Hình 3.5 Ảnh hưởng của ML6 đến hình thái đại thực bào phúc mạc được kích thích viêm bằng LPS Nhận xét
Tế bào ở nhóm chứng trắng không có tình trạng viêm, các tế bào tròn và nhỏ, hình thái tế bào ổn định
Tế bào ở nhóm chứng viêm có sự thay đổi lớn về hình dáng, tế bào xuất hiện các đuôi gai và tăng kích thước, tăng số lượng hạt và tăng không bào trong tế bào chất so với nhóm chứng trắng
Tế bào ở nhúm ML6 - 10 àM cú số lượng tế bào đuụi gai tăng hơn so với nhúm chứng trắng Tuy nhiên, tổng quan hình dạng ở nhóm này gần tương đồng với nhóm chứng trắng
Tế bào ở nhúm ML6 - 1 àM xuất hiện nhiều đụi gai, số lượng đuụi gai và sự thay đổi hình thái ít hơn so với chứng viêm
Tế bào ở nhúm ML6 - 10 àM ổn định hơn tế bào ở nhúm ML6 - 1 àM Ở nhúm ML6
- 10 àM, cỏc tế bào trũn, số lượng đuụi gai, kớch thước hạt và khụng bào trong tế bào chất ớt hơn so với tế bào ở nhúm ML6 - 1 àM
Chất ML6 có xu hướng bảo vệ hình thái của tế bào, đặc biệt ở nồng độ 10 μM
3.2.3 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng IL -6 và IL- 1β trên đại thực bào
Ngoài NO, quá trình viêm giải phóng nhiều chất trung gian hóa học quan trọng khác như IL-6 và IL-1β Kích thích phản ứng viêm đại thực bào bằng tác nhân LPS sẽ giải phóng IL-6 Khác với IL-6, giải phóng IL-1β yêu cầu kích thích phản ứng viêm đồng thời bằng LPS và ATP ngoại bào [7], [11]
ML6 thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO mạnh Tuy nhiên, ức chế giải phóng NO là cơ chế chống viêm không đặc hiệu và phụ thuộc loài tế bào, vì vậy nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng ức chế giải phóng IL-6 và IL-1β trên đại thực bào phúc mạc của ML6 Thử nghiệm định lượng IL-6 và IL-1β bằng phương pháp ELISA [49]
Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng IL-6 Đồ thị sigmoid thể hiện mối tương quan nồng độ IL-6 (pg/mL) và mật độ quang (OD) được thể hiện ở hình 3.6
Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng IL - 6 bằng phương pháp ELISA
40 Kết quả đỏnh giỏ tỏc dụng ức chế giải phúng IL-6 của ML6 tại nồng độ 3 àM và 10 àM trờn đại thực bào phỳc mạc được thể hiện như hỡnh 3.7
Nồng độ IL-6 (ng/ml)
LPS (100ng/ml) ML6 (àM) Dexa (àM)
Hình 3.7 : Ảnh hưởng của ML6 đến giải phóng IL -6 từ đại thực bào phúc mạc
Chú thích: * p < 0,05 so với chứng trắng; # p < 0,05 so với chứng viêm; ns p > 0,05 so với chứng viêm
Khi ủ với LPS, nồng độ IL-6 giải phóng trong nhóm chứng viêm tăng cao (tăng 31,78 lần so với nhóm chứng trắng) Điều này chứng tỏ thử nghiệm ELISA đủ nhạy để đánh giá khả năng giải phóng IL-6
Tác dụng ức chế giải phóng IL-6 trên đại thực bào phúc mạc kích thích bởi LPS 100 ng/mL của chất ML6 nồng độ 3 àM khụng cú sự khỏc biệt cú ý nghĩa so với mẫu chứng viờm Tuy nhiờn, chất ML6 nồng độ 10 àM làm giảm cú ý nghĩa thống kờ nồng độ IL-6 so với mẫu chứng viêm
Chất đối chứng dexamethason 0,5 àM làm giảm cú ý nghĩa thống kờ nồng độ IL-6 so với mẫu chứng
Tỷ lệ ức chế giải phúng IL-6 khi cú mặt chất ML6 nồng độ 10 àM và dexamethason 0,5 àM lần lượt là 40,46% và 49,94%
BÀN LUẬN
4.1 Bàn luận về kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn
Tác dụng chống viêm không hiếm gặp trong các nguyên liệu có nguồn gốc từ dược liệu Các chất phân lập từ dược liệu được coi là nguồn nguyên liệu phong phú cho sàng lọc và tìm kiếm các tác nhân chống viêm mới Mặc dù muồng lùn đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị một số trạng thái bệnh lý liên quan đến viêm, tác dụng chống viêm của dược liệu này hiếm khi được chứng minh bằng thực nghiệm [3] Gần đây, nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành đánh giá tiềm năng chống viêm của muồng lùn sử dụng một số mô hình gây viêm trên động vật Kết quả sơ bộ cho thấy cao chiết muồng lùn thể hiện tác dụng làm giảm đáp ứng viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan và mô hình gây u hạt thực nghiệm Tuy nhiên, do các nghiên cứu này chỉ đánh giá tác dụng của cao chiết dựa trên triệu chứng viêm của động vật, chúng chưa cung cấp thông tin hữu ích liên quan đến cơ chế chống viêm của dược liệu Mặt khác, thành phần hóa học chịu trách nhiệm cho tác dụng chống viêm của muồng lùn cũng chưa được xác định
Nghiên cứu sơ bộ trước đây cũng cho thấy trong các phân đoạn của cao muồng lùn, phân đoạn ethyl acetat thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [10] Sau đó, nghiên cứu hóa thực vật đã tập trung nhận diện các thành phần hóa học chính của phân đoạn này Cho ví dụ, nhóm nghiên cứu Vũ Thanh Bình và cộng sự trước đó đã công bố 2 chất mới phân lập từ phân đoạn ethyl acetat của muồng lùn bao gồm chamaecristanol A và chamaecristanol B Đáng chú ý, hai chất này thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào [55] Tuy nhiên, tiềm lực chống viêm của hai chất này chỉ ở mức trung bình Hơn nữa, ngoài ức chế giải phóng NO, tác dụng của chúng cũng chưa được kiểm chứng rộng rãi trên các thử nghiệm khác Do đó, nhóm nghiên cứu nhận định rằng tác dụng chống viêm của cây muồng lùn còn tập trung trong các hợp chất khác có mặt trong phân đoạn ethyl acetat
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu thu thập được 7 mẫu chất tinh khiết đã được Bùi Thị Thúy Luyện và cộng sự phân lập từ phân đoạn ethyl acetat Sau khi tiến hành sàng lọc sơ bộ, nhóm nghiên cứu nhận thấy chất ML3, ML4 và ML6 có tác dụng chống viêm mạnh đối với đại thực bào phúc mạc Chất ML3 (Resveratrol) - một loại stilben quen thuộc, được tìm thấy trong nhiều loại thực vật Chất này có dữ liệu chống viêm đã được thiết lập và đã được áp dụng trong điều trị lâm sàng [37] Trái lại, vai trò của chất ML4 và ML6 trong viêm hầu như chưa được nghiên cứu Chất ML4 là một flavonoid phức tạp Dẫn xuất
50 của ML4 đã được chứng minh là có tác dụng ức chế sự tổng hợp CCL-11 trong nguyên bào sợi phổi, gợi ý rằng chất này có thể có vai trò trong viêm phổi dị ứng [31] Trong khi đó, ML6 là hợp chất mới được phân lập năm 2022 và mới chỉ được chứng minh tác dụng ức chế α-amylase và α-glucosidase [11]
Ngoài ra, chất ML1 (piceatennol) và chất ML2 (trans- scirpusin A) cũng thể hiện tác dụng ức chế giải phóng NO do LPS gây ra Tuy nhiên, hai chất này gây ảnh hưởng lớn đến khả năng sống của tế bào ML1 và ML2 cũng đã được nghiên cứu về tác dụng chống viêm in vitro trên tế bào Raw 264.7 Kết quả cho thấy ML1 thể hiện tác dụng chống viêm theo cơ chế ức chế iNOS, ức chế giải phóng cytokin, ức chế hoạt động tế bào T CD8+ [43] ML2 thể hiện tác dụng chống viêm theo cơ chế ức chế giải phóng NO và ức chế COX-2 [39] Như vậy, dựa trên tiềm lực chống viêm cũng như tính mới, nhóm nghiên cứu lựa chọn chất ML6 để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn tác dụng chống viêm và bước đầu xác định một số cơ chế chịu trách nhiệm cho tác dụng chống viêm của chất này
4.2 Bàn luận về tác dụng chống viêm và một số cơ chế liên quan của ML6
4.2.1 Bàn luận về lựa chọn dòng tế bào nghiên cứu Đại thực bào là thành phần quan trọng tham gia vào quá trình đáp ứng viêm của cơ thể trước các tác nhân gây hại Trong phản ứng viêm, đại thực bào có ba chức năng chính: trình diện kháng nguyên, thực bào và điều hòa miễn dịch thông qua sản xuất cytokin và các yếu tố tăng trưởng Các tác nhân kích hoạt đại thực bào là: các cytokin (Interferon γ, yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt - đại thực bào (G-CSF), TNFα), lipopolysaccharid (LPS) và các chất trung gian hóa học khác Đại thực bào sẽ bị ức chế hoặc bất hoạt bởi các cytokin chống viêm (IL-4, IL-10, IL-13) và chất đối kháng cytokin gây viêm được sản xuất bởi đại thực bào Đại thực bào tham gia vào quá trình tự điều hòa trong quá trình viêm bởi chúng giải phóng một loạt các thành phần có hoạt tính sinh học có vai trò gây viêm và chống viêm Can thiệp vào đại thực bào hoặc các chất trung gian giải phóng từ đại thực bào là con đường nghiên cứu chủ chốt trong điều trị các bệnh viêm nhiễm [22], [33]
Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trên đại thực bào phúc mạc và đại thực bào Raw 264.7 Tế bào Raw 264.7 là dòng tế bào bất tử được phân lập từ một khối u gây ra bởi virus bạch cầu Abelson chuột nhắt Loại tế bào này có chung các đặc điểm kiểu hình và chức năng tương tự các đại thực bào bình thường [28] Từ lâu, tế bào Raw 264.7 thường được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống viêm dưới tác động của LPS [21] Đại thực bào phúc mạc (peritoneal macrophages – PM) là dòng tế bào nguyên phát được phân lập từ khoang màng bụng chuột nhắt Khoang màng bụng là vị trí dễ thu đại thực
51 bào từ chuột Thông thường, số lượng đại thực bào có trong khoang màng bụng ở điều kiện sinh lý thấp Để tăng hiệu suất khi thu tế bào, thường phải sử dụng các tác nhân kích thích như thioglycollat hoặc peptone proteose để kích thích sự di chuyển của đại thực bào đến khoang phúc mạc [33] Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành tiêm thioglycollat 4% vào khoang màng bụng chuột trước 3 ngày phân lập tế bào
So với các đại thực bào có nguồn gốc từ tủy xương (BMDM) và đại thực bào lách (SPM), đại thực bào phúc mạc (PM) biểu hiện cảm ứng cytokin cao hơn và ổn định hơn về chức năng và kiểu hình PM là nguồn đại thực bào được áp dụng phổ biến cho các thử nghiệm in vitro khác nhau, bao gồm đánh giá sự biểu hiện và hoạt động của các thụ thể kiểu Toll (TLR), đánh giá độc tính tế bào, đánh giá giải phóng cytokin, chemokin và các chất trung gian hóa học khác [22], [33]
PM là dòng tế bào chính của tế bào phúc mạc với tỷ lệ hơn 30% [34] PM thường tồn tại đồng thời dưới các kiểu hình khác nhau, trong đó có 2 kiểu hình chính là M1 và M2 Kiểu hình M1 là dòng tế bào nguyên thủy, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ, bao gồm biểu hiện cytokin Th1 và cytokin gây viêm (TNF-α, IL-2, IFN-γ) Kiểu hình M2 là dòng tế bào được kích hoạt sau khi tế bào được kích thích viêm Những tế bào này chủ yếu biểu hiện cytokin Th2 và cytokin chống viêm (IL-4, IL-10, IL-13) và biến đổi TGF- β giúp ức chế quá trình viêm [13]
Bên cạnh cách phân loại theo kiểu hình, PM còn được phân loại dựa trên hình thái:
PM lớn và PM nhỏ Trong điều kiện ổn định, các PM lớn chiếm ưu thế và được đặc trưng với biểu hiện của yếu tố phiên mã GATA6 cao [13] Trong khối PM thường hạn chế về tính đồng nhất về kiểu hình và hình thái so với dòng tế bào Raw 264.7
4.2.2 Bàn luận về tác dụng ức chế giải phóng chất trung gian hóa học
Phản ứng viêm giải phóng nhiều chất trung gian hóa học Tác động ức chế giải phóng những yếu tố gây viêm này là con đường chống viêm tiềm năng Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng ức chế các chất trung gian hóa học đặc trưng của phản ứng viêm là NO, IL-6 và IL-1β
Nội độc tố LPS là một chất kích hoạt mạnh phản ứng viêm, đồng thời cũng là một mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMPs) quan trọng ở vi khuẩn Gram âm Một lượng nhỏ LPS có thể gây ra phản ứng viêm thông qua sự tương tác của nó với thụ thể TLR-4 LPS làm tăng giải phóng ROS, NO đồng thời kích hoạt thụ thể TLR-4 dẫn đến tăng sản xuất các cytokin gây viêm [53]
Trong quá trình thử nghiệm, nhóm nghiên cứu gây viêm tế bào bằng LPS nồng độ
100 ng/ml Theo một số nghiên cứu khoa học khác, nồng độ LPS thường được sử dụng dao
52 động từ 100 ng/ml đến 5 μg/ml [51], [57], [58] Tuy nhiên, theo kinh nghiệm của chúng tôi, hoạt tính gây viêm của LPS phụ thuộc lớn vào nguồn gốc Nồng độ LPS thích hợp cần được lựa chọn dựa trên khảo sát thực tế, phù hợp với từng điều kiện thực nghiệm cụ thể Thật vậy, các nghiên cứu tiền đề của nhóm cho thấy, sử dụng LPS nồng độ 100 ng/ml từ chủng
E coli 127:B8 có thể tạo ra đáp ứng viêm đạt 80 - 90% so với đáp ứng tối đa (đạt được ở nồng độ 500 ng/ml) Do đó, LPS nồng độ 100 ng/ml được chúng tôi chọn cho các thử nghiệm chính thức