vũ thùy linh nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn chamaecrista pumila lam k larsen

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG

CHỐNG VIÊM IN VITRO CỦA CÁC

CHẤT PHÂN LẬP TỪ PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT MUỒNG LÙN

(CHAMAECRISTA PUMILA

(LAM.) K LARSEN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

CHỐNG VIÊM IN VITRO CỦA CÁC

CHẤT PHÂN LẬP TỪ PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT MUỒNG LÙN

(CHAMAECRISTA PUMILA

(LAM.) K LARSEN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô giáo đã dạy dỗ em trong suốt 5 năm tại Trường Đại học Dược Hà Nội Với tình cảm chân thành nhất, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới các quý thầy cô bộ môn Dược lý - Trường Đại học Dược

Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập và tham gia nghiên cứu

Để hoàn thành khóa luận, em xin phép được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc

tới PGS TS Nguyễn Thùy Dương và TS Phạm Đức Vịnh – Khoa Dược lý – Dược lâm

sàng là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và luôn giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin chân

thành cảm ơn TS Bùi Thị Thúy Luyện - Khoa Công nghệ Hóa dược đã tiến hành nghiên

cứu và cung cấp mẫu nghiên cứu để em có thể hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn DS Đinh Đại Độ, DS Đinh Thị Kiều Giang, DS Nguyễn Thị Thủy,

DS Nguyễn Hoàng Hạnh Nhân, DS Nguyễn Văn Anh đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ

em trong quá trình thực hiện đề tài tại bộ môn

Em xin gửi lời cám ơn đặc biệt đến bạn Mai Vân Phương cùng các anh chị học viên

và các em khóa 75, khóa 76 đã luôn đồng hành cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và học tập

Khoá luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen”

là thành quả của quá trình học tập, làm việc cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân Em rất mong nhận được những đóng góp quý báu của các thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

1.1 Đại cương về viêm 3

1.1.1 Khái niệm về viêm 3

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm 3

1.1.3 Diễn biến cơ bản của quá trình viêm 3

1.1.4 Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào 5

1.1.5 Các đích tác dụng chống viêm hiện nay 9

1.2 Tổng quan về cây muồng lùn 13

1.2.1 Tên khoa học 13

1.2.2 Đặc điểm thực vật 13

1.2.3 Thành phần hóa học 14

1.2.4 Tác dụng sinh học 15

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào 23

2.4.2 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào 232.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng nhất trên đại thực bào 26

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn 34

3.1.1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào trên đại thực bào 34

3.1.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào 35

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của ML6 363.2.1 Giá trị IC50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO 36

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng đến hình thái đại thực bào 38

3.2.3 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng IL-6 và IL-1β trên đại thực bào 39

3.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế chuyển vị nhân của NF-κB trên đại thực bào 433.2.5 Đánh giá tác dụng ức chế quá trình pyroptosis trên đại thực bào 45

3.2.6 Đánh giá tác dụng ức chế hình thành nhóm oxy hoạt động trong đại thực bào………47

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 49

4.1 Bàn luận về kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn 49

4.2 Bàn luận về tác dụng chống viêm và một số cơ chế liên quan của ML6 50

4.2.1 Bàn luận về lựa chọn dòng tế bào nghiên cứu 50

4.2.2 Bàn luận về tác dụng ức chế giải phóng chất trung gian hóa học 51

4.2.3 Bàn luận về định hướng cơ chế tác dụng chống viêm 53

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MtROS Các gốc oxy hoạt động có nguồn gốc từ ty thể

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào 6

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng nitrit/nitrat với thuốc thử Griess 25 Hình 3.1 Ảnh hưởng của các chất đến khả năng sống của đại thực bào

phúc mạc

34

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các chất nghiên cứu đến khả năng ức chế

giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc

35

Hình 3.3 Ảnh hưởng của ML6 đến khả năng ức chế giải phóng NO

trên đại thực bào phúc mạc

36

Hình 3.4 Ảnh hưởng của ML6 đến khả năng ức chế giải phóng NO

trên tế bào Raw 264.7

Hình 3.10 Ảnh hưởng của ML6 đến sự chuyển vị nhân của NF-κB trên

đại thực bào phúc mạc được kích thích LPS

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm là một đáp ứng sinh lý nhằm loại bỏ các tác nhân gây bệnh ngoại lai và sửa chữa các tổn thương Viêm vừa là một phản ứng bảo vệ cơ thể, vừa là phản ứng bệnh lý do quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các mô và cơ quan của cơ thể [1], [16] Nếu không được kiểm soát, viêm sẽ ảnh hưởng chức năng nhiều cơ quan và tiến triển thành viêm mạn tính Đây là một trong những cơ chế bệnh sinh quan trọng của các bệnh lý như viêm đại tràng, viêm ruột, hen suyễn, vảy nến, các bệnh tự miễn, bệnh đa xơ cứng, ung thư [16], [46]

Glucocorticoid và thuốc chống viêm nhóm không steroid (NSAID) là hai nhóm thuốc đã được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh viêm trong nhiều thập kỷ qua Mặc dù thể hiện tác dụng chống viêm mạnh, các nhóm thuốc này cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn Điều trị dài ngày bằng NSAID có liên quan đến các tác dụng bất lợi trên đường tiêu hoá, các biến cố tim mạch và thận [54] Trong khi đó, glucocorticoid có thể gây rối loạn chuyển hóa, loãng xương, suy giảm miễn dịch, hội chứng Cushing [45] Do đó, phát triển các thuốc chống viêm mới an toàn và hiệu quả là hướng nghiên cứu rất được quan tâm hiện nay

Dược liệu và các hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu từ lâu đã được coi là nguồn tiềm năng cho tìm kiếm và phát triển các thuốc chống viêm mới Các thuốc có nguồn gốc dược liệu thường có tác động trên nhiều đích của quá trình viêm, với ít tác dụng bất lợi nghiêm

trọng kèm theo Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cây muồng lùn (Chamaecrista pumila) là dược liệu sở hữu tác dụng chống viêm tiềm năng Theo kinh nghiệm dân gian,

phần trên mặt đất của muồng lùn thường được đun nước uống giúp chống viêm, mát gan, giải độc trong một số bệnh như xơ gan, viêm gan [3] Mặc dù được dùng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị viêm, khối u, các công bố về tác dụng sinh học của muồng lùn hiện rất hạn chế

Nhóm nghiên cứu Trường Đại học Dược Hà Nội đã sàng lọc tác dụng chống oxy hóa

in vitro của cao toàn phần và các phân đoạn của cây muồng lùn và đã bước đầu ghi nhận

những kết quả khả quan, trong đó phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính mạnh nhất [10] Một số nghiên cứu trước đây cũng ghi nhận tác dụng chống viêm của phân đoạn ethyl acetat và một số hợp chất phân lập từ phân đoạn này Để tìm hiểu cơ chế chống viêm và các thành phần hóa học đóng góp chính vào tác dụng chống viêm của phân đoạn ethyl acetat muồng

lùn, “Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro của chất phân lập từ phân đoạn ethyl

acetat muồng lùn (Chamaecrista pumila (Lam.) K Larsen)” được thực hiện với hai mục

tiêu sau đây:

1 Sàng lọc tác dụng chống viêm của một số chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat cao chiết muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO

2 Đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng nhất trên đại thực bào

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về viêm

1.1.1 Khái niệm về viêm

Viêm là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, nhưng cũng được coi là phản ứng bệnh lý do quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các cơ quan Các đặc trưng của viêm bao gồm: sưng, nóng, đỏ, đau [1], [16]

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm

Mọi nguyên nhân dẫn đến tổn thương và làm chết một lượng tối thiểu tế bào tại chỗ đều có thể gây viêm tại vị trí đó Nguyên nhân gây viêm được chia thành hai nhóm chính theo nguồn khởi phát của phản ứng viêm là nguyên nhân ngoại sinh và nội sinh [1], [16]

Nguyên nhân ngoại sinh

- Cơ học: từ sây sát nhẹ đến chấn thương nặng, gây phá hủy tế bào và mô - Vật lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hoá protid tế bào gây tổn thương

enzym, tia xạ (UV, tia X) tạo ra các gốc oxy tự do gây phá hủy một số enzym oxy hóa và gây tổn thương ADN

- Hoá học: các acid, base mạnh, các chất hoá học (thuốc trừ sâu, các độc tố) gây huỷ hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym

- Sinh học: virus, vi khuẩn, ký sinh trùng đơn bào, đa bào hoặc nấm [1], [16]

Nguyên nhân nội sinh

Có thể gặp các nguyên nhân như thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng Ngoài ra, viêm có thể xuất phát từ phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể, như viêm cầu thận, viêm trong hiện tượng Arthus [1], [16]

1.1.3 Diễn biến cơ bản của quá trình viêm

Tại ổ viêm, có 4 quá trình biến đổi chủ yếu: rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, tổn thương mô và tăng sinh tế bào Các quá trình này diễn ra đan xen và liên quan chặt chẽ với nhau [1]

1.1.3.1 Rối loạn tuần hoàn

Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm xuất hiện sớm, ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể Biến đổi này gồm 4 hiện tượng chính:

 Rối loạn vận mạch

Ngay khi các yếu tố gây viêm tác động, ổ viêm lần lượt xuất hiện các hiện tượng sau: Co mạch: Hiện tượng co mạch có tính phản xạ xảy ra rất sớm và rất ngắn do thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại [1], [30]

Sung huyết động mạch: Xảy ra ngay sau co mạch, là sự giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các hóa chất trung gian có hoạt tính từ tế bào mast và bạch cầu hay các sản phẩm tạo ra sau quá trình thực bào của bạch cầu Động mạch vi tuần hoàn giãn rộng, tăng cả lưu lượng lẫn áp lực máu Biểu hiện bên ngoài của sung huyết động mạch là máu đỏ tươi, căng phồng, đau và nóng [1], [30]

Sung huyết tĩnh mạch: Thần kinh vận mạch bị tê liệt, các chất gây giãn mạch ứ lại nhiều hơn tại ổ viêm Ổ viêm bớt nóng, từ màu đỏ tươi của giai đoạn sung huyết động mạch chuyển sang màu tím sẫm, phù do tăng tính thấm, cảm giác đau giảm, chuyển sang đau âm ỉ do hóa chất trung gian và các ion K+, H+ tích tụ lại Quá trình này giúp dọn sạch ổ viêm, ngăn cản sự lan rộng của các tác nhân gây bệnh [1], [30]

Ứ máu: Sau sung huyết tĩnh mạch, hiện tượng ứ máu xuất hiện do một số cơ chế như bạch cầu bám vào thành mạch, cản trở lưu thông máu, tế bào nội mô hoạt hóa và phì đại làm xuất hiện nhiều tế bào bám dính, các chất dãn mạch như NO, histamin làm tăng tính thấm dẫn đến máu đặc quánh, tăng độ nhớt máu tạo ma sát lớn Hiện tượng ứ máu có vai trò cô lập ổ viêm, tăng cường quá trình sửa chữa ô viêm và khiến các yếu tố gây bệnh không thể lan rộng [1], [30]

 Tạo dịch rỉ viêm

Dịch rỉ viêm là sản phẩm xuất tiết tại ổ viêm xuất hiện từ giai đoạn sung huyết động mạch và có tính chất bảo vệ Tuy nhiên, lượng lớn dịch rỉ viêm sẽ gây chèn ép mô xung quanh gây đau nhức hoặc hạn chế vận động các cơ quan Dịch rỉ viêm gồm 2 thành phần chính:

Các thành phần bình thường từ máu thoát ra như nước, muối, protein huyết tương và các thành phần hữu hình của máu tích tại ổ viêm (gồm hồng cầu, tiểu cầu và chủ yếu là bạch cầu) [1], [30]

Các chất mới được hình thành do rối loạn chuyển hóa và tổn thương mô, bao gồm: các hóa chất trung gian như histamin, serotonin, acetylcholin; các protein khối lượng phân tử nhỏ từ 8 – 12 acid amin; các acid nhân; các enzym do hoại tử tế bào [1], [30]

 Bạch cầu xuyên mạch

Bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngoại vi tới bề mặt nội mô thành mạch khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch và máu chảy chậm Bạch cầu trườn theo vách mạch, bám dính và xuyên mạch [1]

Tùy thuộc vào bản chất của tác nhân gây viêm, giai đoạn viêm mà các loại bạch cầu tới vị trí viêm sẽ khác nhau Ở đa số giai đoạn viêm cấp, giai đoạn đầu chủ yếu là bạch cầu trung tính, tiếp theo là bạch cầu mono, cuối cùng là bạch cầu ái toan [1]

 Bạch cầu thực bào

Bạch cầu thực bào là hiện tượng bạch cầu bắt giữ, tiêu diệt yếu tố gây viêm Có hai cơ chế chính là phụ thuộc oxy (nhờ quá trình oxy hóa của NADPH oxidase, myeloperoxidase và NO synthetase), và cơ chế không phụ thuộc oxy (nhờ các enzym trong lysosom) [1]

1.1.3.2 Rối loạn chuyển hóa  Rối loạn chuyển hóa glucid

Ở giai đoạn sung huyết động mạch, sự chuyển hóa glucid chủ yếu là ái khí, tạo ra CO2 Khi bắt đầu có chuyển hóa yếm khí sẽ tạo ra acid lactic tích tụ lại trong ổ viêm, do vậy pH giảm dầu từ ngoài vào trong [1]

 Rối loạn chuyển hóa lipid

Tại ổ viêm, lượng acid béo, lipid và cetonic đều tăng cao Ngoài tác động của yếu tố gây viêm, acid arachidonic chuyển hóa thành prostaglandin và leucotrien sẽ gây giãn mạch mạnh, gây sốt [1]

 Rối loạn chuyển hóa protid

Chuyển hóa protid tăng do hoạt tính cao của các enzym protease và cytokin TNF Các chất chuyển hóa như polypeptid và acid amin tăng lên và tích tụ tại ổ viêm [1]

1.1.3.3 Tổn thương mô

Tại ổ viêm thường bao gồm các tổn thương tiên phát và tổn thương thứ phát Tổn thương tiên phát phụ thuộc vào nguyên nhân gây viêm, có thể rất nhỏ (trầy xước) hoặc rất lớn (dập nát, nhiễm khuẩn) gây hoại tử tế bào Tổn thương thứ phát do những rối loạn tại ổ viêm, phụ thuộc vào cường độ của nguyên nhân và mức độ phản ứng của cơ thể [1]

1.1.3.4 Tăng sinh tế bào

Viêm bắt đầu bằng tổn thương tế bào và kết thúc bằng quá trính tăng sinh, tái tạo, làm lành vết thương Giai đoạn đầu quá trình viêm có sự tăng sinh các loại tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân và lympho bào Ở cuối quá trình viêm, sự tăng sinh vượt mức hoại tử giúp ổ viêm được sửa chữa Các tế bào nhu mô của cơ quan bị viêm có thể tái sinh đầy đủ, cấu trúc và chức năng vẫn được phục hồi Tuy nhiên, một phần nhu mô có thể thay thế bằng mô xơ [1]

1.1.4 Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào

Triệu chứng của phản ứng viêm được đóng góp chủ yếu bởi các chất trung gian hóa học Trong viêm cấp tính, các chất này có nguồn gốc từ tế bào hoặc từ huyết tương Các chất trung gian có nguồn gốc từ tế bào thường nằm trong các hạt nội bào và sẽ được tiết ra hoặc được tổng hợp mới khi tế bào được kích thích bởi tác nhân gây viêm [25], [30]

Hình 1.1: Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào

 Các acid amin vận mạch

Histamin Histamin dự trữ nhiều nhất trong hạt của tế bào mast, được giải phóng khi tế bào mast thoái hóa để đáp ứng với các kích thích Histamin được giải phóng gây giãn và tăng tính thấm tiểu động mạch [42]

Serotonin Serotonin (5-hydroxytryptamin) là chất trung gian có sẵn trong tiểu cầu và một số tế bào thần kinh nội tiết Serotonin có tác dụng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch [15]

 Enzym lysosom

Enzym lysosom do bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân tiết ra Khi được giải phóng, enzym lysosom sẽ tiêu diệt vi sinh vật, gây phá hủy mô do phân huỷ các đại phân tử và peroxid hóa lipid của màng tế bào [7], [9]

 Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) có nguồn gốc từ phospholipid, thường là phosphatidylcholin [7], [9] Các tế bào như tiểu cầu, tế bào nội mô, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tổng hợp PAF với số lượng nhỏ Phospholipase A2 (PLA2) bất hoạt hoạt động của PAF và hoạt động của PAF được kích thích khi tế bào bị viêm

Cytokin Nitric oxid và các nitric oxid synthase

Được tế bào tiết ra

hoặc tân tạo

Các acid amin vận mạch: histamin,

serotonin

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) Prostagladin, leukotrien

Enzym lysosom

Ngoài vai trò hoạt hóa và kích hoạt tiểu cầu, PAF có chức năng tăng tính thấm, tăng phản ứng oxy hóa, giãn mạch và hóa ứng động các tế bào viêm [9]

 Các chất chuyển hóa của acid arachidonic (prostaglandin, leukotrien)

Acid arachidonic (AA) sinh ra từ phospholipid của màng tế bào dưới tác động của PLA2 khi chịu các kích thích hoặc thông qua các chất trung gian khác AA chuyển hóa và tạo thành các chất trung gian của phản ứng viêm bao gồm prostaglandin, leukotrien [39]

Prostaglandin Enzym cyclooxygenase (COX) chuyển hóa AA tạo thành prostaglandin (PGs) và thromboxan (prostanoids) [9] Có 4 loại PG có hoạt tính sinh học chính được tạo ra trong cơ thể: prostaglandin E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α) Lượng PG rất ít hoặc hầu như không có ở các mô bình thường Trong phản ứng viêm, mức độ tổng hợp PG thay đổi đáng kể khi có sự xâm nhập của bạch cầu và các tế bào miễn dịch PG làm tăng tính thấm thành mạch, gây giãn mạch, sốt và khuếch đại cơn đau [7], [9]

Leukotrien Leukotrien (LT) được sản xuất trong bạch cầu nhờ quá trình oxy hóa AA và acid eicosapentaenoic (EPA) nhờ enzym 5-lipoxygenase (5-LOX) [7] LT được phân thành 4 loại bao gồm cysteinyl leukotrien, LTB4, LTG4 và LTB5 Trong đó, LTB4 là LT điển hình trong phản ứng viêm; LTB4 kích thích hoá ứng động bạch cầu trung tính, kích hoạt bạch cầu trung tính thoái hoá và giải phóng các chất trung gian gây viêm [17] Ngoài ra, LT có tác dụng mạnh trong co thắt phế quản và tăng tính thấm tĩnh mạch [7]

 Các nhóm oxy hoạt động và nito oxid

Các nhóm oxy hoạt động Nhóm oxy hoạt động (ROS) bao gồm các gốc oxy tự do như anion superoxid, hydroxyl, hydroperoxyl Trong điều kiện sinh lý, một lượng nhỏ ROS được hình thành trong tế bào, ví dụ trong quá trình hô hấp hiếu khí của tế bào gan [17] Trong phản ứng viêm, ROS được giải phóng ra ngoại bào có chức năng tiêu diệt mầm bệnh, nhưng cũng gây tổn thương mô, tăng tính thấm thành mạch và gây chết tế bào [7]

Trong phản ứng viêm, ROS có nguồn gốc từ enzym NADPH oxidase (NOX) có liên quan đến vai trò tiêu diệt mầm bệnh ROS có nguồn gốc từ ty thể giữ vai trò liên quan kích hoạt các yếu tố gây viêm, thúc đẩy sự trưởng thành các cytokin và quá trình chết tế bào theo chu trình [7]

Dưới tác động của NOX, bạch cầu trung tính và đại thực bào tổng hợp lượng lớn ROS nội bào ROS nội bào có vai trò truyền tín hiệu trong tế bào lympho T và điều chỉnh trạng

thái oxy hóa khử nội bào của tế bào Điều này dẫn đến tăng giải phóng PG và các cytokin gây viêm như IL-6, IL-12 [7]

Ngoài ra, ROS có nguồn gốc từ ty thể (mtROS) là sản phẩm phụ của quá trình hô hấp của ty thể và hoạt động của enzym chuyển hóa MtROS tham gia vào các chức năng phân tử quan trọng và dẫn truyền tín hiệu xảy ra trong phản ứng viêm, bao gồm giải phóng cytokin do LPS gây ra, kích hoạt yếu tố NF-κB thông qua thụ thể inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3R), dẫn truyền tín hiệu Ca 2+ được tạo ra bởi thrombin và kích hoạt AP-1 được tạo ra bởi lysophosphatidylcholin (LPC) [7]

Nitric oxid (NO) Trong điều kiện sinh lý bình thường, nitric oxid (NO) là một chất tự do có tác dụng chống viêm Tuy nhiên, một lượng lớn NO giải phóng trong tế bào viêm và được coi là một chất trung gian gây phá hủy mô và gây giãn mạch [7], [12]

Trong viêm cấp tính, NO được tạo ra từ quá trình chuyển L-arginin thành L-citrullin dưới tác động của ba dạng đồng phân nitric oxid synthase (NOS): eNOS, nNOS, iNOS [7], [12] eNOS có nguồn gốc từ tế bào nội mô, nNOS có nguồn gốc từ tế bào thần kinh, iNOS là enzym cảm ứng có nguồn gốc từ đại thực bào eNOS, nNOS tạo ra lượng NO trong khoảng thời gian ngắn (vài giây đến vài phút) và phụ thuộc vào kênh Ca2+ (Ca-calmodulin) Ngược lại, iNOS không thường xuyên hiện diện trong tế bào và chỉ được biểu hiện khi tế bào bị cảm ứng hoặc kích thích bởi cytokin gây viêm và/hoặc tác nhân lipopolysacarid (LPS) [7]

 Cytokin

Cytokin là một nhóm protein trọng lượng phân tử thấp được tiết ra bởi các tế bào, được sản xuất tại vị trí viêm bao gồm: Interleukin (IL), yếu tố phát triển và yếu tố kích thích bào lạc, interferon, chemokin Các tế bào chính tham gia tổng hợp cytokin là lympho bào đã được hoạt hóa, đại thực bào, tế bào đuôi gai [11], [16]

Cytokin là một họ chất trung gian hóa học có cấu trúc tương tự nhau có vai trò điều hoà các phản ứng miễn dịch và quá trình viêm Trong số các cytokin, TNF-α, IL-1 và IL-6 là những chỉ điểm sinh học của quá trình viêm [7], [11]

TNF-α TNF-α được tổng hợp bởi nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm đại thực bào, tế bào lympho T, tế bào lympho B, bạch cầu trung tính và tế bào nội mô TNF-α là một yếu tố hoạt hóa tế bào nội mô mạch máu, tăng tính thấm thành mạch, gây sốt, chết tế bào theo chu trình TNF-α kích hoạt NF-κB, protein hoạt hóa (AP) -1 và kích thích các con đường báo hiệu của sự chết tế bào thông qua caspase [11]

IL-1 IL-1 được tổng hợp bởi nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, tế bào đuôi gai và tế bào biểu mô Có hai dạng IL-1 chính là IL-1α và IL-1β, được mã hóa bởi các gen khác nhau nhưng có chung thụ thể IL-1 nên có chung loạt các vai trò tương tự nhau Các vai trò này bao gồm kích hoạt các yếu tố phiên mã quan trọng liên quan đến phản ứng viêm và miễn dịch (NF-kB; AP-1; c-Jun N-terminal kinase (JNK); p38 và các loại protein kinase khác liên quan đến mitogen (MAPK), kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào và gen điều hòa interferon) [11], [24]

Cả tiền chất IL-1α và IL-1α trưởng thành đều liên kết với cùng loại thụ thể, đều được đưa vào tế bào và chuyển vào nhân, liên kết chặt chẽ với nhiễm sắc thể như một yếu tố phiên mã [11]

Trái ngược với IL-1α, tiền chất IL-1β (pro-IL-1β) ở dạng proprotein không có hoạt tính sinh học Sự kích hoạt pro-IL-1β thành IL-1β trưởng thành yêu cầu bước phân giải protein bằng enzym caspase-1 Inflammasome NLRP3 là phức hợp protein có chứa ASC, NLRP3 và Pro-Caspase-1 biểu hiện chủ yếu trong đại thực bào NLRP3 kích hoạt caspase-1 để chuyển IL-1β dạng tiền chất thành dạng trưởng thành [7]

IL-6 IL-6 là một loại cytokin tiền viêm tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm tế bào lympho T, bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô và nguyên bào sợi Vai trò của IL-6 được thể hiện thông qua 2 cơ chế khác nhau IL-6 kết hợp trưc tiếp với phức hợp thụ thể màng IL-6 và glycoprotein-130 dẫn tới hoạt hóa tế bào gây viêm như đại thực bào và bạch cầu trung tính IL-6 cũng có thể kết hợp với thụ thể hòa tan sIL-6Rα, được biểu hiện thông qua mARN hoặc phân giải protein bằng disintegrin và metalloproteinase (ADAM) Đáng chú ý, ADAM không được kích hoạt bởi các cytokin khác như IL-1β hoặc TNF-α Ngoài ra, IL-6 tác động trên hệ miễn dịch do đóng vai trò chính trong điều hòa các tác nhân tham gia vào quá trình miễn dịch dịch thể (tế bào lympho B), miễn dịch tế bào (tế bào lympho T), hủy cốt bào [11]

1.1.5 Các đích tác dụng chống viêm hiện nay

Các nhóm thuốc chống viêm tác động lên các đích khác nhau của quá trình viêm đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm ở nhiều bệnh lý

1.1.5.1 Ức chế các enzym liên quan đến con đường chuyển hoá acid arachidonic

Can thiệp vào các enzym liên quan đến con đường chuyển hóa AA từ lâu đã được coi là lựa chọn ưu tiên trong điều trị viêm và hiện đã có nhiều loại thuốc ức chế hoặc đối kháng chọn lọc theo cơ chế này [7]

 Ức chế COX

Ức chế enzym COX giúp giảm tổng hợp PG là đích tác dụng của các thuốc NSAIDs như aspirin, indomethacin, ibuprofen Tuy nhiên việc ức chế không chọn lọc COX gây ra nhiều tác dụng bất lợi trên đường tiêu hóa Các NSAIDs ức chế chọn lọc COX-2 sẽ giúp giảm các tác dụng bất lợi này Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 như celecoxib không gây loét dạ dày trong mô hình chống viêm trên động vật thực nghiệm [7], [20]

 Điều hòa LT

Các chất ức chế 5-LOX ngăn cản quá trình tổng hợp LT từ AA Các chất đối kháng thụ thể LT-cysteinyl leukotrien (cysLT) đã được phát triển để xử lý đáp ứng viêm theo cơ chế điều hòa LT [7] Một số nhóm thuốc kháng leukotrien là: nhóm cạnh tranh receptor leukotrien D4, nhóm phong bế protein hoạt hóa 5-lipoxygenase; nhóm ức chế 5-lipoxygenase [20]

 Ức chế PLA2

Các thuốc ức chế PLA2 ngăn cản tổng hợp, giải phóng PG và LT từ AA Vì vậy, nhóm thuốc glucocorticoid có hiệu quả chống viêm mạnh hơn các thuốc chỉ tác động lên một nhánh của con đường chuyển hóa AA Ngoài ra, glucocorticoid làm giảm biểu hiện của các gen mã hóa COX-2, iNOS và tăng biểu hiện của các gen mã hóa các cytokin chống viêm như IL-4, IL-10,IL-13 [20]

1.1.5.2 Ức chế hoạt động của các acid amin vận mạch

Histamin giải phóng từ tế bào mast gắn với thụ thể H1 để biểu hiện hoạt động, vì vậy các thuốc kháng histamin theo cơ chế cạnh tranh thụ thể H1 sẽ đối kháng với nhiều biểu hiện của đáp ứng viêm tức thì [9] Các thuốc kháng histamin theo cơ chế này thường được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng như viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc dị ứng, viêm xoang, mề đay

1.1.5.3 Ức chế sản xuất/hoạt hóa một số cytokin gây viêm

Cytokin là chất trung gian truyền tín hiệu quan trọng trong hệ thống miễn dịch [11] Do đó, cytokin và chemokin là đích quan trọng trong các thuốc chống viêm, đặc biệt ở các bệnh tự miễn dịch

Bảng 1.1: Một số thuốc tác động lên cytokin trong điều trị các bệnh tự miễn [7]

Kháng IL-12/23 (Ustekinumab) Kháng IL-17 MoAb (AIN457/LY24398)

Trung hòa IL-12, IL-23, IL-17

Kháng TNF-α MoA (Infliximab, Adulimumab, Golimumab)

Giảm hoạt động của TNF-α

Kháng IL-6 MoAb (MEDI5117) Kháng thụ thể của IL-6 (Tocilizumab)

Giảm hoạt động của IL-6

Đối kháng thụ thể IL-1 (Anakinra) Đối kháng IL-1β (Canakinumab)

Giảm hoạt động của IL-1β

1.1.5.4 Ức chế sự di chuyển tế bào đến vị trí viêm

Sự thoát mạch của bạch cầu dẫn đến kích hoạt integrin làm bạch cầu bám dính chắc chắn vào tế bào nội mô mạch máu Sau khi thoát mạch, bạch cầu di chuyển về phía vị trí tổn thương theo hướng gradient hóa học hoặc hóa ứng động Các chất hóa ứng động cũng kích thích bạch cầu giải phóng các chất trung gian gây viêm Do đó, ức chế sự di chuyển của tế bào đến vị trí viêm là một hướng tiếp cận tiềm năng trong điều trị viêm [7]

Các chất ức chế di chuyển tế bào có thể được chia thành bốn loại, bao gồm: selectin và thụ thể, các chất hóa ứng động và thụ thể, integrin và thụ thể, các phân tử truyền tín hiệu xuôi dòng từ các thụ thể bám dính hoặc chất hóa ứng động [7]

1.1.6 Các mô hình đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

Nghiên cứu tác dụng chống viêm của các đối tượng tiềm năng cần được thực hiện trên

các mô hình gây viêm in vivo hoặc in vitro Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

được chia thành hai loại là mô hình phi tế bào và mô hình tế bào

1.1.6.1 Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm phi tế bào

Mô hình phi tế bào đánh giá tác dụng chống viêm dựa trên đánh giá tác dụng ức chế các enzym quan trọng trong phản ứng viêm Đối tượng nghiên cứu có tiềm năng chống viêm khi nó thể hiện tác dụng ức chế các enzym này Do đó, việc xây dựng các mô hình phân tử và sinh hóa để đánh giá hoạt tính của enzym đóng vai trò quan trọng Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính các enzym COX và 5-LOX đã được thiết lập để nghiên cứu tác dụng chống viêm [26]

COX và 5-LOX là hai enzym chủ chốt trong quá trình viêm phụ thuộc con đường AA, có vai trò chuyển hóa AA thành chất trung gian hóa học gây viêm là PG và LK Mẫu nghiên cứu có khả năng ức chế con đường sản sinh ra PG và LK sẽ thể hiện tác dụng chống viêm tối ưu [8]

 Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế COX

AA được sử dụng làm cơ chất và sẽ được chuyển đổi thành hydroperoxid khi có mặt enzym COX trong mẫu nghiên cứu Hoạt tính COX được đánh giá gián tiếp thông qua hoạt tính peroxidase với chất cho điện tử là N,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochlorid [8]

 Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế 5-LOX

Hoạt tính ức chế LOX được nghiên cứu sử dụng acid linoleic làm chất nền và lipoxidase làm enzym Đánh giá hoạt tính LOX thông qua sự hình thành acid hydroperoxylinoleic từ acid linoleic [23]

1.1.6.2 Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm dựa trên tế bào

Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm dựa trên tế bào sử dụng các tác nhân gây viêm để đánh giá sự thay đổi các chất chuyển hóa hoặc sản phẩm của quá trình [26] Dòng đại thực bào sơ cấp hoặc dòng đại thực bào bất tử là những dòng tế bào sử dụng trong mô hình đánh giá tác dụng chống viêm

- Dòng đại thực bào sơ cấp được phân lập từ chuột hoặc đại thực bào BMDM có nguồn gốc từ tủy xương được biệt hóa bởi yếu tố kích thích tạo cụm tế bào (M-CSF) - Dòng đại thực bào bất tử: tế bào THP-1 (tế bào ung thư bạch cầu đơn nhân ở người

mắc bệnh bạch cầu cấp), tế bào Raw 264.7 (đại thực bào có nguồn gốc từ khối u ở chuột đực do virus gây bệnh bạch cầu Abelson gây ra)

Dòng đại thực bào bất tử giống với các tế bào đơn nhân và đại thực bào sơ cấp về hình thái và đặc tính biệt hóa

Trong các mô hình tế bào, đối tượng nghiên cứu được đánh giá tác dụng chống viêm thông qua các chất trung gian gây viêm, chẳng hạn như các cytokin gây viêm, NO hoặc

enzym quan trọng của phản ứng viêm

 Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO

Tác dụng ức chế giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng sản phẩm chuyển hóa nitrit/nitrat Trong môi trường nuôi cấy tế bào, NO được chuyển hóa nhanh chóng thành nitrit/nitrat dưới tác động của oxy Sản phẩm nitrit/nitrat được định lượng bằng thuốc thử Griess (sulphanilamid và N-naphthyl-ethylenediamin) Dựa trên phản ứng của thuốc thử Griess với nitrit/nitrat thành thuốc nhuộm azo màu tím có thể đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm [24]

 Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế giải phóng cytokin (TNF-α, IL-1β, IL-6)

Trong số các cytokin, TNF-α, IL-1 và IL-6 là những chỉ điểm sinh học quan trọng trong quá trình viêm [7] TNF-α, IL-1 và IL-6 được định lượng dựa trên kỹ thuật Elisa Thử

nghiệm này dựa trên phản ứng liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể Theo đó, kháng thể đặc hiệu đã biết liên kết với kháng nguyên trong các mẫu thử để tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể liên kết bề mặt đĩa Sau đó, enzym và cơ chất được bổ sung để tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo quang [5]

Ngoài ra, tác dụng ức chế giải phóng cytokin còn được thực hiện bằng thử nghiệm Real-time PCR liên quan đến định lượng các yếu tố phiên mã mARN cyokin Thử nghiệm này cho phép phát hiện nhiều cytokin khác nhau từ lượng mẫu tương đối nhỏ [5], [36]

1.2 Tổng quan về cây muồng lùn

1.2.1 Tên khoa học

Cây muồng lùn, hay còn có tên gọi khác là me đất, là cây thuộc họ Đậu (Fabaceae), có tên khoa học là Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen, tên đồng danh là Cassia pumila Lam., Cassia prostrata Roxb hoặc Senna prostrata Roxb [3]

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Muồng lùn là loài cây thảo có gốc hóa gỗ, cây cao khoảng 40 cm, mọc đứng, trên các nhánh thường có lông mịn Lá cây dài khoảng 2 – 5 cm, hình ngọn giáo Cuống lá dài 3 -7 cm và có lông mịn Lá chét từ 10 - 25 đôi, không có cuống, tròn ở đầu với một mũi dài [3]

Hoa của cây muồng lùn mọc đơn độc hay thường xếp thành 2-3 bông tạo thành chùm ở trên nách lá Cuống hoa có lông mịn Cánh hoa màu vàng bóng, hình dạng thuôn xoan ngược và có kích thước không đều nhau Hoa nhị 5, bầu có lông mềm Quả đậu hình dải dài, kích thước 2-5 x 0,5 cm Mỗi quả chứa từ 10 - 15 hạt có dạng gần hình thoi, màu nâu

bóng [3]

Hình 1.2: Hình ảnh cây muồng lùn

Tại Việt Nam, muồng lùn mọc hoang ở nhiều nơi như Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hóa, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai Cây ra hoa vào khoảng tháng 8-9 hàng năm, có quả sau 1-3 tháng Ngoài ra muồng lùn còn xuất hiện ở một số nước châu Á như Ấn độ, Mianma, Trung Quốc, Lào và Thái Lan [3]

1.2.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính của chi Chamaecrista là Anthranoids [15] Cây muồng lùn

chỉ mới được các nhà khoa học để ý tới trong giai đoạn gần đây dù trong y học dân gian nó đã được sử dụng phổ biến Các nghiên cứu chiết xuất và phân lập từ năm 2008 đã dần làm sáng tỏ cấu trúc và các thành phần có trong cây, mở ra nhiều hướng tiếp cận trong việc tìm ra, chứng minh các tác dụng sinh học cũng như đánh giá tiềm năng trở thành ứng viên trong nghiên cứu phát triển thuốc mới

Một số nghiên cứu trong giai đoạn 2008 đến 2018 phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong cây muồng lùn được chúng tôi tổng hợp trong bảng 1.1

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định thành phần hóa học trong cây muồng lùn

2008 Ankita Yadav

và cộng sự

Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất phytosterol bao gồm β-sitosterol, lanosterol, campersterol, stigmasterol Các phytosterol này có hàm lượng khác nhau trong các bộ phận khác nhau

[56]

2012

Ram Avtar Sharma và cộng sự

Phân lập được sennosid A, B, C, D và

2012 Singh Daulat

và cộng sự

Một số flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc bao gồm kaempferol-7-O-glucosid, kaempferol và quercetin

[19]

2012

Shoeb A và cộng sự

Các thành phần trong toàn cây muồng lùn bao gồm emodin, chrysophanol, physcion, diterpene, alcaloid, [48]

acid chrysophanic, dihydro xanthyletin, 1- hentriacontanol, 1-hexacosanol, 1-tetratriacontanol

2018

Wei-Song Kong và cộng

sự

Phân lập được 2 hợp chất flavonoid là (3-hydroxypropyl)-2′-methoxyflavone và 8-hydroxy-7-(2-hydroxyethyl)- 2′-methoxyflavone

8-hydroxy-7-[29]

Việc chiết xuất và phân lập các thành phần trong cây phụ thuộc rất nhiều vào dung môi do chúng liên quan trực tiếp đến độ tan của các chất hóa học Các phân đoạn dung môi được sử dụng khác nhau có thể chứa các thành phần khác nhau Một số dung môi phổ biến trong các nghiên cứu hóa thực vật bao gồm petroleum, benzen, aceton, cloroform, ethanol và nước B L Sharma và cộng sự năm 2012 đã định tính được một số thành phần ở các

phân đoạn khác nhau của C.pumila [48]

Bảng 1.3: Định tính một số hợp chất ở các phân đoạn khác nhau của C.pumila

1.2.4 Tác dụng sinh học

Cây muồng lùn đã được sử dụng theo y học dân gian trong điều trị một số bệnh Phần trên mặt đất của muồng lùn thường được đun nước uống giúp chống viêm, mát gan, giải

độc trong một số bệnh như xơ gan, viêm gan Đồng bào ở Hòa Bình sử dụng cây muồng lùn trong các bài thuốc chữa bệnh về gan Một số thầy thuốc ở Quảng Ninh dùng cây muồng lùn chữa các bệnh đau cơ xương khớp Một số nước châu Á khác sử dụng rễ cây để điều trị lỵ, người dân Ấn Độ dùng lá muồng lùn để điều trị làm giảm đau mắt [3], [35]

Hiệu quả điều trị của muồng lùn đã được kiểm chứng trong các nền y học dân gian Tuy nhiên hiểu biết của con người về tác dụng và tiềm năng của cây muồng lùn vẫn còn rất hạn chế Tri thức y học cổ truyền đã gợi ý cho khoa học hiện đại về các tác dụng sinh học

liên quan đến hoạt động chống viêm Trên cơ sở đó, nhiều nghiên cứu in vitro đã được thực

hiện, tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng chống viêm của cây muồng lùn Dù chỉ mới là bước đầu, song những kết quả này mang rất nhiều ý nghĩa trong việc định hướng cho các nghiên cứu sau này, bao gồm cả đề tài mà chúng tôi thực hiện

Một số nghiên cứu nền tảng về tác dụng sinh học cây muồng lùn đã được công bố:

 Tác dụng chống oxy hóa

Gần đây, các tác giả Vũ Thanh Bình, Phạm Đức Vịnh và cộng sự nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của muồng lùn Nghiên cứu này tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần và các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, chloroform, n-butanol và phân đoạn nước bằng thử nghiệm dọn gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và superoxid Kết quả cho thấy cao toàn phần có tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid với IC50 tương ứng là 18,65 (9,91 - 35,08) và 12,33 (5,24 - 29,02) µg/ml Trong số các phân đoạn, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng dọn gốc tự do DPPH và superoxid tốt nhất với giá trị IC50 lần lượt là 9,98 (6,23 - 16,01) và 8,38 (6,11 - 11,50) µg/ml [10]

 Tác dụng chống viêm

Năm 2022, Vũ Thanh Bình và cộng sự đã công bố tác dụng chống viêm của hai dẫn xuất stilben-phenylpropanoid mới từ cây muồng lùn Hai hợp chất mới được phân lập từ

phân đoạn ethyl acetat có tên là chamaecristanols A và B Kết quả ức chế giải phóng NO

do LPS gây viêm trên tế bào Raw 264.7 của 2 chất này được thể hiện qua giá trị IC50 lần lượt là 41,69 ± 1,34 và 32,14 ± 0,15 μM [55] Các kết quả này cũng gợi ý thực hiện các nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm tiếp theo đối với các chất phân lập từ muồng lùn

 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2012, Ram Avtar Sharma và cộng sự nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của nhóm sennosides chiết xuất từ muồng lùn Nhóm tác giả đã phân lập được một số anthranoid

thuộc nhóm sennoside của loài C.pumila và chứng minh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

trên các phân đoạn dược liệu cũng như các hợp chất phân lập được Kết quả cho thấy, phân đoạn cloroform có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm nhưng giá trị MIC cao hơn nhiều

lần so với các chất đối chứng như tetracyclin, gentamycin, nystatin Các hợp chất anthranoid phân lập được như sennoside A, B, C, D và Rhein-8-O-glycosid cũng có hoạt tính trên nhưng MIC cao hơn các chất đối chứng gấp nhiều lần (từ 7 đến 20 lần) Cụ thể Sennosid D

cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với Streptococcus pneumoniae trong khi sennosid B cho thấy hoạt tính kháng nấm tối đa đối với Rhizoctonia bataticola với MIC tương ứng là

140 và 170 μg/mL ở nồng độ thử nghiệm 100 – 400 μg/mL với các đối chứng viêm - gentamicin và nystatin Các hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm trung bình thể hiện ở tất cả các hợp chất đã phân lập [44]

Cùng năm 2012, Daulat Singh nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của nhóm flavonoid chiết xuất từ muồng lùn Nghiên cứu này chỉ ra, một số flavonoid phân lập có

hoạt tính kháng khuẩn trên một số vi khuẩn như E.coli, S aureus, P aeurinosa, S typhi và một số lại nấm như A flavus, A niger [19]

Năm 2017, nghiên cứu của Đỗ Mạnh Trung cho thấy, cao chiết ethanol phần trên mặt

loài C.pumila có thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên 9 chủng vi khuẩn [2]  Tác dụng khác

Năm 2008, theo Papiya Mitra Mazumder, Rai và Roy, tác dụng của cây muồng lùn bao gồm ức chế thần kinh trung ương, lợi tiểu, chống co thắt và hạ sốt [41]

Năm 2023, Bùi Thị Thúy Luyện và cộng sự đã đánh giá tác dụng của hợp chất mới (4,7-dihydroxy-2-hydroxymethyl-5,6-dimethoxyanthraquinon) và 8 hợp chất khác phân lập từ phân đoạn ethyl acetat về khả năng ức chế α-glucosidase và α-amylase [25] Các kết quả cho thấy các chất phân lập từ phân đoạn này của muồng lùn có thể có các tiềm năng khác về tác dụng sinh học cần được nghiên cứu tiếp

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây muồng lùn được thu hái tự nhiên tại Lạc Sơn, Hòa Bình vào tháng 9 năm 2016 Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi ThS Nghiêm Đức Trọng - Trường Đại học Dược Hà Nội Mẫu tiêu bản mang số hiệu HNIP/18301/17 được lưu tại Phòng Tiêu bản cây thuốc - Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội

Đề tài nghiên cứu một số chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn Các chất phân lập cùng công thức hóa học do TS Bùi Thị Thúy Luyện - Khoa Công nghệ Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn

1 ML1 Piceatennol

2 ML2 Trans-scirpusin A

2.1.2 Chuẩn bị mẫu thử

Các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn được hòa tan trong DMSO để được dung dịch có nồng độ 50 mM và lưu trữ tại nhiệt độ -20oC Đối với từng thử nghiệm, mẫu thử được pha loãng trong môi trường nuôi cấy đến các nồng độ thích hợp

3 ML3 Resveratrol

dihydroxyflavan-

7,4'-epiafzelechin

Butanetriol, 3-

2R-1,2,4-methylene

hydroxymethyl-5,6-dimethoxyanthraqui

4,7-dihydroxy-2-none

7 ML7 Fisetinidol

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Động vật

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 10 - 12 tuần tuổi, cân nặng 28 - 35 g, khỏe

mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.2.2 Dòng tế bào

Đại thực bào Raw 264.7 được cung cấp bởi American Type Culture Collection

Đại thực bào phúc mạc được phân lập từ chuột nhắt chủng Swiss tại phòng thí nghiệm

Dược lý phân tử - Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2.3 Hóa chất

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất dùng trong nghiên cứu

5 Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin)

14 Kháng thể sơ cấp anti-Ki67 Abcam, Anh 15 Kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ liên hợp

huỳnh quang Alexa-488

Abcam, Anh

2.2.4 Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.3: Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu

1 Tủ nuôi cấy vô trùng Telstar, Tây Ban Nha

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm 2 nội dung chính

Nội dung 1: Sàng lọc tác dụng chống viêm của một số chất phân lập từ phân đoạn

ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào phúc mạc Ban đầu, độc tính tế bào của các chất được đánh giá tại các nồng độ khác nhau để lựa chọn nồng độ thích hợp cho thử nghiệm chính Sau đó, hoạt tính chống viêm của các chất

được so sánh tại các mức nồng độ tương đương, sử dụng thử nghiệm gây giải phóng NO trên đại thực bào để lựa chọn chất tiềm năng nhất dựa trên hoạt tính và tính mới

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế chống viêm của chất tiềm

năng đã chọn từ nghiên cứu sàng lọc Tác dụng chống viêm của chất tiềm năng được đánh giá thông qua định lượng các chất trung gian của quá trình viêm bao gồm NO, IL-6 và IL-1β Ngoài ra, để định hướng cơ chế chống viêm, ảnh hưởng của chất này lên sự hoạt hóa yếu tố sao mã gen NF-κB, quá trình chết tế bào theo chương trình do viêm (pyroptosis) và sản xuất nhóm oxy hoạt động (ROS) cũng được nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kếthực hiện theo sơ đồ ở hình 2.1

Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Sàng lọc tác dụng chống viêm của một số chất

phân lập từ phân đoạn ethylacetat muồng lùn

Đánh giá khả năng gây độc tế bào

Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO

Đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng

Xác định IC50 trên hoạt tính giải phóng NO

Đánh giá ảnh hưởng đến hình thái tế bào

Đánh giá tác dụng ức chế hình thành ROS Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng

IL-6 và IL-1β

Đánh giá tác dụng ức chế pyroptosis Đánh giá tác dụng ức chế chuyển vị NF-κB

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào

2.4.1.1 Phân lập đại thực bào phúc mạc

Chuột nhắt trắng được tiêm phúc mạc 1 ml dung dịch thioglycolat 4% để huy động đại thực bào Sau 3 ngày, tiến hành phân lập đại thực bào Giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ và cẩn thận bộc lộ khoang màng bụng bằng kéo và kẹp phẫu thuật vô trùng Thu đại thực bào phúc mạc bằng cách tiêm 10 ml dung dịch muối cân bằng vào khoang phúc mạc của chuột Lắc nhẹ, liên tục trong 5 phút và thu hồi hỗn dịch tế bào từ khoang phúc mạc vào một ống 15 ml trong đá Dịch rửa được ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào Phân tán lại tế bào trong môi trường RPMI 1640 đầy đủ (chứa 10% FBS và 1% hỗn hợp kháng sinh penicillin/streptomycin) để thu hỗn dịch tế bào

Sau khi phân lập, tế bào được cấy vào đĩa nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2, độ ẩm 95% trong tủ ấm nuôi cấy với mật độ thích hợp, tùy thuộc vào mỗi loại thí nghiệm cụ thể Sau khi ủ 2 giờ trong tủ nuôi cấy, thay thế môi trường nuôi cấy để loại bỏ các tế bào không kết dính

2.4.1.2 Nuôi cấy đại thực bào Raw 264.7

Tế bào Raw 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM đầy đủ (chứa 10% FBS và 1% hỗn hợp kháng sinh penicillin/streptomycin) Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2, độ ẩm 95% trong tủ ấm nuôi cấy trên đĩa petri 10 cm

Khi tế bào đạt trạng thái ổn định ở pha log, mật độ tế bào đạt trên 80% đĩa nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển 2 lần để chuẩn bị tế bào cho thí nghiệm

Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong đĩa petri và bổ sung 2 ml môi trường DMEM đầy đủ Tiếp đó dùng cell scraper để cạo lớp tế bào bám dính dưới đáy đĩa và chuyển tất cả dịch từ đĩa nuôi cấy vào ống 15 ml Ly tâm ống với tốc độ 2500 vòng/phút trong 3 phút để thu tế bào Phân tán lại tế bào trong môi trường DMEM đầy đủ, đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Neubauer Pha loãng tế bào để cấy trải ra đĩa với mật độ phù hợp với mỗi thí nghiệm hoặc tiếp tục được nuôi cấy chu kỳ tiếp theo trong tủ ấm nuôi cấy

2.4.2 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn

ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào

Đại thực bào được kích thích đáp ứng viêm bằng tác nhân gây viêm lipopolysacarid (LPS) LPS kích thích đại thực bào giải phóng ra các chất trung gian hóa học (PGE2, NO, các cytokin)

Giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng sản phẩm chuyển hóa nitrit/nitrat trong môi trường nuôi cấy tế bào Mẫu nghiên cứu được coi là có tác dụng chống viêm khi làm giảm giải phóng NO có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng

Kiểm tra khả năng gây độc tế bào của các chất bằng phương pháp MTT Nếu ảnh hưởng đến khả năng sống, tế bào sẽ giảm sản sinh NO gây ảnh hưởng đến kết quả sàng lọc Mẫu thử được coi là có tiềm năng chống viêm khi ức chế giải phóng NO có ý nghĩa so với mẫu chứng nhưng không ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống của tế bào

2.4.2.1 Đánh giá khả năng gây độc tế bào của chất phân lập trên đại thực bào phúc mạc Nguyên tắc

Thử nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào là phương pháp đánh giá khả năng sống của tế bào dựa trên khả năng tế bào tham gia phản ứng oxy hoá khử với MTT Chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) mang điện tích dương và có các nhóm thân lipid nên có khả năng đi qua màng tế bào và bị khử bởi các enzym oxidoreductase, dehydrogenase, oxidase, peroxidase phụ thuộc NAD(P)H trong ty thể hoặc tương bào của các tế bào sống [7]

Sản phẩm của quá trình khử MTT là formazan dạng kết tinh Formazan tan trong DMSO tạo dung dịch màu tím Dung dịch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị độ hấp thụ của dung dịch [7]

Tiếp đó ủ tế bào với môi trường chứa các nhóm mẫu trong 2 giờ Thêm LPS 100 ng/ml vào nhóm mẫu thử, tiếp tục ủ qua đêm Khi kết thúc thời gian ủ, thêm 10 µl MTT 5 µg/ml vào mỗi giếng và ủ trong 1 giờ Loại bỏ môi trường để thu các tinh thể kết kinh màu tím ở đáy đĩa Thêm 200 µl DMSO vào mỗi giếng và lắc đĩa để hòa tan hoàn toàn tủa formazan Đo độ hấp thụ của dung dịch tạo thành ở bước sóng 570 nm sử dụng hệ thống máy đọc đĩa Variaskan LUX

Đánh giá kết quả

Thông số đánh giá: tỷ lệ tế bào sống

Tỷ lệ tế bào sống được tính theo công thức: I = ODmẫu thử / ODchứng𝑥 100%

Mẫu thử được coi là không có độc tính trên tế bào nếu tỷ lệ tế bào sống so với lô chứng viêm I ≥ 80%

2.4.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO của các chất phân lập trên đại thực

bào phúc mạc Nguyên tắc

Tác dụng ức chế giải phóng NO được đánh giá thông qua định lượng sản phẩm chuyển hóa nitrit/nitrat Trong môi trường nuôi cấy tế bào, NO được chuyển hóa nhanh chóng thành nitrit/nitrat dưới tác động của oxy Sản phẩm nitrit/nitrat được định lượng bằng thuốc thử Griess (sulphanilamid (SA) và N-naphthyl-ethylenediamin (NED)) Thuốc thử Griess chuyển đổi nitrit/nitrat thành thuốc nhuộm azo màu tím có thể đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm [9]

Sơ đồ phản ứng được mô tả ở hình 2.2

Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng nitrit/nitrat với thuốc thử Griess

Thiết kế thí nghiệm

Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần Thí nghiệm gồm các nhóm mẫu: nhóm chứng trắng; nhóm

chứng viêm; nhóm mẫu thử (các nồng độ 10 µM, 30 µM và 100 µM)