Luận văn phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá khả năng kháng viêm của các hoạt chất phân lập từ loài sa nhân tím (amomum longiligulare t l wu)

Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Sa nhân tím (a - Thân quả, b – Cây non Sa nhân tím) Hình 2.1 Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 16 Hình 3.1 Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím 23 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím 24 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím 25 Hình 3.4 Sơ đồ tạo cặn chiết Sa nhân tím 26 Hình 3.5 Sơ đồ phân lập chất từ cặn methanol Sa nhân tím 27 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất AL1 29 Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất AL2 30 Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất AL3 31 Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất AL4 32 Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất AL5 số tƣơng tác phổ HMBC 35 Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất AL6 tƣơng tác HMBC COSY 36 Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất AL7 số tƣơng tác HMBC 38 Hình 3.13 Cấu trúc hợp chất AL8 41 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 42 Hình 3.15 Kết đánh giá khả ức chế sản sinh NO gây độc tế bào hợp chất (%UC: % ức chế sản sinh NO, %CS: % sống sót tế bào) 44 Hình PL1 Phổ 1H-NMR chất AL1 PL-2 Hình PL2 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL1 PL-2 Hình PL3 Phổ 1H-NMR chất AL2 PL-3 Hình PL4 Phổ 13C-NMR chất AL2 PL-3 Hình PL5 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL2 PL-3 Hình PL6 Phổ 1H-NMR chất AL3 PL-4 Hình PL7 Phổ 1H-NMR giãn chất AL3 PL-4 Hình PL8 Phổ 13C-NMR chất AL3 PL-5 Hình PL9 Phổ DEPT chất AL3 PL-5 Hình PL10 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL3 PL-5 Hình PL11 Phổ 1H-NMR chất AL4 PL-6 Hình PL12 Phổ 1H-NMR giãn chất AL4 PL-6 Hình PL13 Phổ 13C-NMR chất AL4 PL-7 Hình PL14 Phổ HSQC hợp chất AL4 PL-7 Hình PL15 Phổ HMBC hợp chất AL4 PL-8 Hình PL16 Phổ HMBC giãn hợp chất AL4 PL-8 Hình PL17 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL4 PL-8 Hình PL18 Phổ 1H-NMR chất AL5 PL-9 Hình PL19 Phổ 1H-NMR giãn chất AL5 PL-9 Hình PL20 Phổ 13C-NMR chất AL5 PL-10 Hình PL21 Phổ HSQC chất AL5 PL-10 Hình PL22 Phổ HMBC chất AL5 PL-11 Hình PL23 Phổ HMBC giãn chất AL5 PL-11 Hình PL24 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL5 PL-12 Hình PL25 Phổ 1H-NMR chất AL6 PL-12 Hình PL26 Phổ 1H-NMR giãn chất AL6 PL-13 Hình PL27 Phổ 1H-NMR giãn chất AL6 PL-13 Hình PL28 Phổ 13C-NMR chất AL6 PL-14 Hình PL29 Phổ DEPT chất AL6 PL-14 Hình PL30 Phổ COSY chất AL6 PL-15 Hình PL31 Phổ COSY giãn chất AL6 PL-15 Hình PL32 Phổ NOESY chất AL6 PL-16 Hình PL33 Phổ NOESY giãn chất AL6 PL-16 Hình PL34 Phổ HMBC chất AL6 PL-17 Hình PL35 Phổ HMBC giãn chất AL6 PL-17 Hình PL36 Phổ HSQC chất AL6 PL-18 Hình PL37 Phổ HSQC giãn chất AL6 PL-18 Hình PL38 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL6 PL-19 Hình PL39 Phổ 1H-NMR chất AL7 PL-19 Hình PL40 Phổ 1H-NMR giãn chất AL7 PL-20 Hình PL41 Phổ 13C-NMR chất AL7 PL-20 Hình PL42 Phổ DEPT chất AL7 PL-21 Hình PL43 Phổ HMBC chất AL7 PL-21 Hình PL44 Phổ HMBC giãn chất AL7 PL-22 Hình PL45 Phổ HMBC giãn chất AL7 PL-22 Hình PL46 Phổ HSQC chất AL7 PL-23 Hình PL47 Phổ HSQC giãn chất AL7 PL-23 Hình PL48 Phổ NOESY chất AL7 PL-24 Hình PL49 Phổ NOESY giãn chất AL7 PL-24 Hình PL50 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL7 PL-25 Hình PL51 Phổ 1H-NMR hợp chất AL8 PL-25 Hình PL52 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AL8 PL-26 Hình PL53 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AL8 PL-26 Hình PL54 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL8 PL-26 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LỒI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare T.L.Wu) 1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố 1.1.2 Công dụng chủ trị 1.1.3 Các nghiên cứu nƣớc ngồi Sa nhân tím 1.1.3.1 Thành phần hóa học 1.1.3.2 Hoạt tính sinh học 1.1.4 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím 11 1.1.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 11 1.1.4.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 12 1.2 GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM 13 1.2.1 Giới thiệu trình viêm 13 1.2.2 Các yếu tố tham gia vào trình viêm 15 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 16 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 17 2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng phân lập xác định cấu trúc hợp chất 17 2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng xác định hoạt tính kháng viêm 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập hợp chất 18 2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất 18 2.2.1.2 Phương pháp phân lập 18 2.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất 19 2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 19 2.2.2.2 Phổ khối lượng MS 19 2.2.2.3 Độ quay cực [α] 20 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 23 3.1.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ thân Sa nhân tím 23 3.1.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ Sa nhân tím 25 3.2 THƠNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC 28 3.2.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 28 3.2.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 28 3.2.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one 28 3.2.4 Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1-one 28 3.2.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 28 3.2.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 28 3.2.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 29 3.2.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 29 3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 29 3.3.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 29 3.3.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 30 3.3.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3one 31 3.3.4.Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1-one 32 3.3.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 35 3.3.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 36 3.3.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 38 3.3.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 40 3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƢỢC 43 4.1 KẾT LUẬN 46 4.2 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong phú Theo ƣớc tính, nƣớc ta có khoảng 13.000 lồi thực vật bậc cao có khoảng 4.000 loài đƣợc sử dụng làm thuốc Do đa dạng thành phần chủng loại, nguồn dƣợc liệu Việt Nam đƣợc sử dụng rộng rãi y học cổ truyền để chữa trị nhiều bệnh, nhiều thuốc đƣợc khoa học đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng Xu hƣớng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ dƣợc liệu, từ loài thực vật thu hút quan tâm nhà khoa học độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể so với dƣợc phẩm tổng hợp Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi Sa nhân (Amomum), họ Gừng (Zingiberaceae) dƣợc liệu quý, có giá trị kinh tế cao, đƣợc sử dụng làm thuốc chữa trị bệnh đƣờng ruột, hô hấp, xƣơng khớp Ngồi ra, Sa nhân tím cịn có tác dụng làm dịu đau nhức răng, chống viêm, kháng khuẩn, có tác dụng an thai chữa số bệnh phụ nữ Sa nhân tím đƣợc sử dụng làm thuốc, làm gia vị tinh dầu chiết xuất đƣợc ứng dụng lĩnh vực y học, dƣợc phẩm, công nghệ thực phẩm Là dƣợc liệu quý có khả ứng dụng rộng rãi nên Sa nhân tím đƣợc nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Các nghiên cứu ngồi nƣớc thành phần hóa học hoạt tính sinh lồi Amomum longiligulare cho thấy tiềm vô lớn phát triển dƣợc chất thiên nhiên có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn,…Tuy nhiên, nghiên cứu nƣớc ta tập trung vào đánh giá thành phần tinh dầu, nghiên cứu nhóm hợp chất khác cịn Hơn nữa, đánh giá hoạt tính sinh học lồi Sa nhân tím chƣa đầy đủ, chƣa có nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng viêm gây độc tế bào loài Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá hoạt động kháng viêm Sa nhân tím Amomum longiligulare có ý nghĩa khoa học thực tiễn, nghiên cứu cung cấp thơng tin nhóm hợp chất khác loài này, tạo sở liệu cho nghiên cứu sau Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài luận văn: “Phân lập, xác định cấu trúc đánh giá khả kháng viêm hoạt chất phân lập từ lồi sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)” đƣợc thực với mục tiêu cụ thể sau: - Phân lập đƣợc số hợp chất từ lồi Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu), xác định đƣợc cấu trúc hợp chất - Đánh giá khả kháng viêm chất phân lập đƣợc CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LỒI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare T.L.Wu) Sa nhân tím hay cịn gọi Sa nhân lƣỡi dài, sa ngần, mề tré bà, tên khoa học (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa nhân (Amomum), họ Gừng (Zingiberaceae) [1] 1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố Đặc điểm thực vật Sa nhân tím loại thân thảo sống lâu năm, cao 1,5 – 2,5 m Thân rễ mọc bò lan mặt đất Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30 cm, rộng – cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đơi; cuống dài – 10 mm Cụm hoa mọc từ thân rễ thành bơng, có – hoa màu trắng; bắc ngồi hình bầu dục, màu nâu, bắc dạng ống; dài 1,5 cm, có nhọn; tràng hình ống dài 1,3 – 1,5 cm, chia thùy, mặt ngồi có lơng thƣa, thùy hình trứng ngƣợc, hai thùy bên hẹp; cánh mơi gần trịn, đƣờng kính – 2,6 cm, lõm, mép màu vàng, có sọc đỏ, đầu cánh mơi xẻ hai thùy nhỏ gập phía sau, khơng có nhị lép, nhị dài bao phấn; bầu hình trụ trịn, phình giữa, có lơng trắng Quả hình cầu, màu tím, đƣờng kính 1,3 – cm, mặt ngồi có gai ngắn, chia ô Hạt màu nâu sẫm, cứng Khối lƣợng hạt tƣơng đối nhỏ, có – 24, hạt có áo, đƣờng kính – mm [1], [2], [3] a [3] b [3] Hình 1.1 Sa nhân tím (a - Thân quả, b – Cây non Sa nhân tím) Phân bố Sa nhân tím có vùng phân bố từ đảo Hải Nam (Trung Quốc), đến vùng Trung Lào Việt Nam Ở Việt Nam, Sa nhân tím phân bố tập trung tỉnh Tây Nguyên Những điểm có nhiều Sa nhân tím huyện M′Đrắc (Đăk Lăk), An Khê K′Bang (Gia Lai), Vĩnh Thạch (Bình Định), Sơng Hinh (Phú Yên), Ba Tơ (Quãng Ngãi)…Ở Sa nhân tím mọc tƣơng đối tập trung xen lẫn với loài Sa nhân trắng diện tích rừng lớn Ở tỉnh phía Bắc nhƣ Phú Thọ, Thái Bình, Hịa Bình, Hải Dƣơng, Sa nhân tím mọc với trữ lƣợng trạng thái mọc hoang trồng vƣờn [1] Thu hoạch Sa nhân tím có hoa gần nhƣ quanh năm, sinh gốc sau năm tuổi Ở vụ chính, hoa tháng 3, già vào khoảng tháng – Vụ phụ bắt đầu khoảng tháng 7, già vào tháng 11 Thời điểm thu hoạch tốt vỏ chuyển sang màu vàng nhƣng cịn rắn Lúc này, hạt dễ tách, màu vàng có chấm đen nâu, vị chua, cay nồng [1] 1.1.2 Cơng dụng chủ trị Quả Sa nhân tím có vị cay, tính ấm, mùi thơm vào kinh tỳ, vị, thận Có tác dụng hành khí, tán hàn, tán thấp, khai vị, tiêu thực, kích thích tiêu hóa Quả Sa nhân tím đƣợc dùng trị bụng trƣớng đau, đầy bụng, ăn không tiêu; tả, lỵ lạnh; nôn mửa, nghẹn nấc, chống viêm, có tác dụng an thai…Trong thực phẩm, Sa nhân tím đƣợc dùng làm gia vị, chế rƣợu mùi [1], [4] Hạt Sa nhân tím phơi khô, giã thành bột, chấm vào chỗ đau, ngâm rƣợu cho đặc ngậm có tác dụng chữa đau nhức [1] 1.1.3 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím 1.1.3.1 Thành phần hóa học Qua cơng trình nghiên cứu, nhiều hợp chất từ Sa nhân tím đƣợc phân lập Tinh dầu, flavonoid, terpenoid diarylheptanoid thành phần hóa học Sa nhân tím [5], [6], [7] Các thành phần hóa học đƣợc phân lập từ phân đoạn dichloromethane Sa nhân tím flavonoid diarylheptanoid [5] Thành phần tinh dầu Thành phần tinh dầu hạt Sa nhân tím (1,7-3%) chứa borneol (9) 19%, D-camphor 33%, bornyl acetate 26,5%, D-limonene 7%, α-phellandrene (10) 2,3%, α-pinene 1,8%, linalool (11) [3] Thành phần tinh dầu Sa nhân tím bao gồm α-pinene (1), βpinene (2), 1,8-cineole (3), p-cymene (4), limonene (5), camphene (6), bornyl acetate (7) camphor (8) [8] Nhóm hợp chất flavonoid Nhóm nghiên cứu Hao Ying cộng xác định 17 hợp chất Sa nhân tím kỹ thuật sắc ký cao tốc ngƣợc dòng sắc ký lỏng cao áp Các hợp chất đƣợc phát chủ yếu thuộc nhóm flavonoid diarylheptanoid [6] Các hợp chất flavonoid đƣợc xác định bao gồm: 3,5-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone (12), 3,5,3′-trihydroxy-7,4′dimethoxyflavone (13), 3,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone (14), genistein-7O-β-D-glucoside (15), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (16), luteolin-8-Cα-L-arabinoside (17) kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-Dglucopyranoside (18) [6] Hợp chất (12), (13) (14) đƣợc phân lập từ lồi Amomum longiligulare nhóm nghiên cứu Liu Jin Peng cộng [7] PL-12 [M+H]+ Hình PL24 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL5 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL6 Nootkatone Hình PL25 Phổ 1H-NMR chất AL6 PL-13 Hình PL26 Phổ 1H-NMR giãn chất AL6 Hình PL27 Phổ 1H-NMR giãn chất AL6 PL-14 Hình PL28 Phổ 13C-NMR chất AL6 Hình PL29 Phổ DEPT chất AL6 PL-15 Hình PL30 Phổ COSY chất AL6 Hình PL31 Phổ COSY giãn chất AL6 PL-16 Hình PL32 Phổ NOESY chất AL6 Hình PL33 Phổ NOESY giãn chất AL6 PL-17 Hình PL34 Phổ HMBC chất AL6 Hình PL35 Phổ HMBC giãn chất AL6 PL-18 Hình PL36 Phổ HSQC chất AL6 Hình PL37 Phổ HSQC giãn chất AL6 PL-19 [M+H]+ Hình PL38 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL6 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL7 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone Hình PL39 Phổ 1H-NMR chất AL7 PL-20 Hình PL40 Phổ 1H-NMR giãn chất AL7 Hình PL41 Phổ 13C-NMR chất AL7 PL-21 Hình PL42 Phổ DEPT chất AL7 Hình PL43 Phổ HMBC chất AL7 PL-22 Hình PL44 Phổ HMBC giãn chất AL7 Hình PL45 Phổ HMBC giãn chất AL7 PL-23 Hình PL46 Phổ HSQC chất AL7 Hình PL47 Phổ HSQC giãn chất AL7 PL-24 Hình PL48 Phổ NOESY chất AL7 Hình PL49 Phổ NOESY giãn chất AL7 PL-25 [M+H]+ Hình PL50 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL7 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL8 7-epi-α-cyperone Hình PL51 Phổ 1H-NMR hợp chất AL8 PL-26 Hình PL52 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AL8 Hình PL53 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AL8 [M+H]+ Hình PL54 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL8 ... t? ?? nhu cầu thực t? ?? trên, đề t? ?i luận văn: ? ?Phân l? ??p, xác định cấu trúc đánh giá khả kháng viêm ho? ?t ch? ?t phân l? ??p t? ?? l? ??i sa nhân t? ?m (Amomum longiligulare T. L. Wu)? ?? đƣợc thực với mục tiêu cụ thể... xác định cấu trúc hóa học hợp ch? ?t gồm hợp ch? ?t đƣợc phân l? ??p t? ?? thân Sa nhân t? ?m AL1, AL2, AL3, AL4, AL5 hợp ch? ?t AL6, AL7, AL8 đƣợc phân l? ??p t? ?? l? ??i Sa nhân t? ?m, hợp ch? ?t l? ??n phân l? ??p đƣợc t? ??. .. K? ?T LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 K? ?T LUẬN Các k? ?t luận văn thực đƣợc mục tiêu đề phân l? ??p, xác định cấu trúc đánh giá ho? ?t t? ?nh kháng viêm hợp ch? ?t phân l? ??p đƣợc t? ?? thân Sa nhân t? ?m, cụ thể: Phân l? ??p