Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn streptomyces alboniger

Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Viết tắt HNMR 13 C- NMR Tiếng Anh Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 XK Xạ khuẩn VSV Vi sinh vật Chất kháng sinh CKS Xạ khuẩn đối XKĐK kháng CC Column chromatography NB-40 Neurological disease DEPT MBC HL-60 PTP1B Distortionless enhancement by polarisation transfer Sắc ký cột Phổ DEPT Minimum bactericidal Nồng độ diệt khuẩn concentration tối thiểu Human promyelocytic leukemia Tế bào ung thư máu cấp cell line người Protein tyrosine phosphatase 1B MCF-7 Breast carcinoma cell line Tế bào ung thư vú Gram dương Gr(+) Hep-G2 Hepatocellular carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô gan HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị hạt coherence nhân qua nhiều liên kết HSQC IC50 Heteronuclear single Phổ tương tác dị hạt quantum coherence nhân qua liên kết Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration Gr(-) Gram âm TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng ESI-MS Electronspray ionization mass Phương pháp khối spectrum KB phổ Human epidemoid Tế bào ung thư biểu carcinoma cell line mô người MỤC LỤC CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ XẠ KHUẨN 1.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa xạ khuẩn 1.1.1.3 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 1.1.1.4 Vai trò xạ khuẩn 1.1.2 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất thứ cấp phân lập từ xạ khuẩn 1.1.2.1 Các hợp chất kháng sinh 1.1.2.2 Các hợp chất kháng lao 10 1.1.2.3 Các hợp chất chống ung thư 11 1.1.2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học từ chủng vi sinh vật Việt Nam 14 1.2 CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ALBONIGER 17 1.2.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger 18 1.2.2 Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces alboniger 20 1.2.2.1 Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư 20 1.2.2.2 Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh 21 1.2.2.3 Các hợp chất khác 23 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 25 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Vật liệu 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn 26 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 29 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây độc tế bào 29 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 29 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 31 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 KẾT QUẢ 33 3.1.1 Phân lập tạo sinh khối chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger 33 3.1.2 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả kháng Mycobacterium smegmatis 34 3.1.3 Phân loại chủng xạ khuẩn 35 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VH19-A121 37 3.2.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất VTBE.01 37 3.2.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 121CN.02 42 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƯỢC 48 3.3.1 Hoạt tính kháng lao kháng vi sinh vật kiểm định 48 3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Danh mục bảng Bảng 1: Sự thay đổi Streptomyces alboniger nhiệt độ khác [37] 18 Bảng 2: Sự thay đổi Streptomyces alboniger điều kiện môi trường khác [37] 19 Bảng 3: Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất puromycin A (1), puromycin B (2) puromycin C (3) [39] 21 Bảng 1.4 Các hợp chất thuộc khung pamamycin………………………… 22 Bảng 5: Phổ kháng khuẩn panamycin [41] 23 Bảng 1: Các chủng XK phân lập địa điểm khác 33 Bảng 2: Kết hoạt tính kháng M smegmatis chủng XK 34 Bảng 3: Bảng phân loại dựa hình thái 16S rADN 35 Bảng 4: Số liệu phổ NMR hợp chất VTBE.01 obscurolide B2 [53] 41 Bảng 5: Số liệu phổ NMR hợp chất 121CN.02 Chartreusin [54] 46 Bảng 3.6: Hoạt tính kháng lao hợp chất VTBE.01 121CN.02…….49 Bảng 7: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất 121CN.02 49 Bảng 8: Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất 121CN.02 50 Danh mục hình Hình 1: Các kiểu hệ sợi xạ khuẩn Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.3: Các hợp chất kháng sinh phân lập từ chủng vi sinh vật……………………………………………………………………… Hình 1.4: Các hợp chất kháng lao phân lập từ chủng xạ khuẩn……………………………………………………………………… 11 Hình 1.5: Các hợp chất chống ung thư phân lập từ chủng vi sinh vật ……………………………………………………………………………….13 Hình 1.6: Các hợp chất kháng lao phân lập từ chủng xạ khuẩn Việt Nam………………………………………………………………………….14 Hình 1.7: Các hợp chất thuộc lớp cyclopeptit từ vi sinh vật biển Việt Nam từ năm 2013-2017 ………………………………………………………….15 Hình 1.8: Các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng vi sinh vật Micromonospora sp G019 từ vùng biển Hạ Long………………………… 16 Hình 9: Chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger kính hiển vi điện tử…….……………………………………………………………………………… 17 Hình 10: Hình dạng Streptomyces alboniger đĩa thạch tổng hợp……18 Hình 1.11: Các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger…………………………………………………21 Hình 1.12 : Các hợp chất thuộc khung pamamycin… ……………………… 21 Hình 1.13: Các hợp chất khác phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger ……………………………………………………………………………23 Hình 1: Sơ đồ phân lập chất từ dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces alboniger………………………………………………………… ……… 38 Hình 1: Đặc điểm khuẩn lạc số chủng XK phân lập 33 Hình 2: Ảnh minh họa khả kháng M smegmatis chủng XK 34 Hình 3: Hình ảnh khuẩn lạc chủng XK có hoạt tính kháng M smegmatis cao 35 Hình 4: Cấu trúc tương tác HMBC () 1H-1H COSY ( ) hợp chất VTBE.01 37 Hình 5: Phổ 1H-NMR hợp chất VTBE.01……… ………………….37 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR hợp chất VTBE.01……………….………… 38 Hình 7: Phổ COSY hợp chất VTBE.01 39 Hình 8: Phổ HMBC hợp chất VTBE.01 39 Hình 9: Phổ NOESY hợp chất VTBE.01 40 Hình 10: Cấu trúc tương tác HMBC () 1H-1H COSY ( ) hợp chất 121CN.02 42 Hình 3.11: Phổ (-)-ESI-MS hợp chất 121CN.02……………………… 42 Hình 12: Phổ 1H-NMR hợp chất 121CN.02 43 Hình 13: Phổ 13C-NMR hợp chất 121CN.02 44 Hình 14: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 45 Hình 15: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, số nhóm vi sinh vật (VSV) kháng thuốc độc tính số thuốc kháng sinh (KS) bán tổng hợp ngày gia tăng, nhà khoa học hướng tới nghiên cứu tìm kiếm hợp chất từ VSV, đặc biệt xạ khuẩn (XK) Đến nay, với số lượng lớn hợp chất có hoạt tính sinh học phát hiện, XK trở thành mục tiêu quan trọng ngành công nghiệp sinh học đường tìm kiếm sản xuất loại thuốc mới, đặc biệt thuốc kháng sinh [1] Streptomyces chi xạ khuẩn lớn ngành Actinobacteria chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Có 500 lồi XK thuộc chi Streptomyces mô tả Giống hầu hết Actinobacteria khác, Streptomyces chủng khuẩn gram dương (Gr(+)), có gen với tỉ lệ G-C %(tỉ lệ phần trăm Cytosine-Guanine) cao XK thuộc chi Streptomyces tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục nát, bùn đáy sông, biển Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, kết từ sản sinh geosmin q trình chuyển hóa chất, thường sống đất có vai trị VSV phân hủy Chủng VSV sản xuất nửa số thuốc KS giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế Chủng XK Streptomyces alboniger chủng thuộc chi Streptomyces Một số nghiên cứu hợp chất thứ cấp sản sinh từ chủng cho thấy chủng hứa hẹn tiềm sản sinh hợp chất kháng sinh puromycin, paramycin hoạt chất có hoạt tính sinh học thú vị [2] Việt Nam đất nước có địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng đa dạng phong phú Vì vậy, chủng XK sản sinh hợp chất thứ cấp đa dạng phong phú Qua tra cứu tài liệu cho thấy, giới có tài liệu cơng bố hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger Ở Việt Nam chưa có nhóm nghiên cứu cơng bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn số hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger” thu đỉnh Mây Bạc, rừng Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình Kết đề tài góp phần vào kho tàng hợp chất thiên nhiên phân lập từ xạ khuẩn Việt Nam Mục đích nghiên cứu: + Nghiên cứu phân lập chiết tách chủng xạ khuẩn từ dịch sinh khối + Xác định cấu trúc chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces alboniger + Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chất phân lập CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ XẠ KHUẨN 1.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn (Bacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Phần lớn XK tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) [3] Các loài liên quan đến bệnh người động vật bao gồm Nocardia, Gordona, Tsukamurella, Streptomyces, Rhodococcus, Streptomycetes Corynebacteria Các chi kỵ khí có tầm quan trọng y tế bao gồm Actinomyces, Arachnia, Rothia, Bifidobacterium [4] XK có đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Sự phân bố XK phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Trong gam đất thường có triệu XK (tính theo số khuẩn lạc mọc mơi trường thạch) XK có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram (+), toàn thể tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh, chất nhân thể ẩn nhập [3] Thành tế bào XK có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 µm có tác dụng trì hình dạng khuẩn ty, bảo vệ tế bào chủ yếu cấu tạo từ lớp glucopeptide bao gồm gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl muramic liên kết 1,4 – β glucozit, gồm lớp: lớp dày khoảng 60 – 120 Å, lớp rắn dày khoảng 50 Å, lớp dày khoảng 50 Å Thành tế bào XK không chứa cellulose chitin chứa nhiều enzym tham gia vào trình trao đổi chất trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [3] Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50 µm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipit protein Chúng có vai trị đặc biệt quan trọng q trình trao đổi chất trình hình thành bào tử XK Tế bào chất XK có chứa mezoxom, thể nhân, vật thể ẩn nhập gồm hạt poliphotphat polisacarit Nhân tế bào XK cấu trúc điển hình, nhiễm sắc thể khơng có màng Khi cịn non, Hình 2.6: Phổ NOESY hợp chất VTBE.01 Hình 2.6a: Phổ NOESY hợp chất VTBE.01 (giãn rộng) Hình 2.6b: Phổ NOESY hợp chất VTBE.01 (giãn rộng) Phụ lục 3: Các phổ hợp chất 121CN.02 Hình 3.1: Phổ 1H-NMR hợp chất 121CN.02 Hình 3.1a: Phổ 1H-NMR hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.1b: Phổ 1H-NMR hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.2: Phổ 13C-NMR hợp chất 121CN.02 Hình 3.2a: Phổ 13C-NMR hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.2b: Phổ 13C-NMR hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.3: Phổ DEPT hợp chất 121CN.02 Hình 3.3a: Phổ DEPT hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.4: Phổ HSQC hợp chất 121CN.02 Hình 3.4a: Phổ HSQC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.4b: Phổ HSQC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.5: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 Hình 3.5a: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.5b: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.5c: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.5d: Phổ HMBC hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) 3.6: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 3.6a: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) 3.6b: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) 3.6c: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) 3.6d: Phổ COSY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.7: Phổ NOESY hợp chất 121CN.02 Hình 3.7a: Phổ NOESY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.7b: Phổ NOESY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.7c: Phổ NOESY hợp chất 121CN.02 (giãn rộng) Hình 3.8: Phổ ESI-MS hợp chất 121CN.02