Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu (myristica fragrans)

Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu (Myristica Fragrans) Nguyễn Thị Chinh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS. Phương Thiện Thương Năm bảo vệ: 2011 Abstracts. Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của 04 hoạt chất là các lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans là acid meso-dihydroguairetic, macelignan, fragransin A2, nectandrin B trên mô hình tế bào 2D, spheroid và in vivo. Kết quả như sau: Trong 04 hoạt chất thì acid meso-dihydroguairetic có hoạt tính kháng u mạnh nhất khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). Ở mô hình spheroid, acid meso-dihydroguairetic có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và gây tan khối cầu spheroid MCF7. Trong in vivo, acid meso- dihydroguairetic gây tiêu hết u trên chuột nhắt swiss đến 50% ở liều thử thuốc cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng đồng thời làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử. Keywords. Hoạt chất phân lập; Hạt nhục đậu khấu; Chống ung thư; Hóa sinh học Content Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng gia tăng. Năm 2000, ở Việt Nam tỷ lệ mắc chung của bệnh ung thư ở nam giới là 104/100.000 dân, ở nữ giới là 101/100.000 dân, thì đến năm 2010 tỷ lệ này ở nam giới tăng đến 181/100.000 dân và ở nữ giới tăng đến 134/100.000 dân. Trong đó các loại bệnh ung thư có tỷ lệ mắc mới tăng rõ rệt là ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư thực quản, ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới và ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư đại tràng và ung thư tuyến giáp ở nữ giới. Mỗi năm Việt Nam có khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư. Ước tính năm 2011 có thêm 126.000 người mắc mới [11]. Bệnh ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng, không loại trừ một ai trong xã hội. Việc nghiên cứu tìm ra các chất có khả năng điều trị căn bệnh ung thư, cũng như ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thư làm tăng thời gian sống cho bệnh nhân luôn được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm nghiên cứu. Đến nay, đã có nhiều hoạt chất chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên đã được khám phá ra và đem vào sử dụng trên lâm sàng. Các hoạt chất điển hình là paclitaxel (taxol), vinblastin và vincristin, camptothecin, adriamycin… Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Có rất nhiều loại cây được sử dụng là những dược liệu quí. Đã có nhiều hoạt chất được tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư cũng như ngăn chặn sự phát triển của khối u được tìm thấy như: đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Đu đủ (Papayaceae) [24], gấc (Momordica cochinchinensis Streng) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [1], trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [9],… Do đó, chắc chắn trong thiên nhiên vẫn còn tiềm ẩn các hoạt chất có tác dụng chống ung thư đang chờ con người khám phá. Cây nhục đậu khấu có tên khoa học là Myristica fragrans Hout. (tên tiếng Anh: mace, nutmeg), thuộc họ nhục đậu khấu (Myristicaceae), là cây được trồng và mọc ở miền Nam Việt Nam. Các lignan (tức là các phenylpropanoids) là thành phần chủ yếu có tác dụng sinh học của hạt nhục đậu khấu, gồm các chất chính fragransin A2, nectandrin B, macelignan, meso-dihydroguaiaretic acid. Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học các lignan phân lập từ hạt có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm giảm đau, có tác dụng bảo vệ gan, giảm cholesterol trong máu, chống xơ vữa động mạch, kháng khuẩn. Nhưng cho đến nay những nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của hạt và các lignan phân lập từ hạt ở Việt Nam và thế giới mới có rất ít [27]. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans” với các mục đích chính như sau: - Thử hoạt tính chống ung thư của các hoạt chất lignan phân lập được trên mô hình nuôi cấy tế bào 2D. - Tạo mô hình và nghiên cứu tác dụng chống ung thư của lignan có tác dụng chống ung thư mạnh nhất (trong các lignan đã thử nghiệm 2D) trên mô hình 3D và in vivo. Ung thư không phải chỉ là một loại bệnh mà là khoảng trên 200 loại bệnh khác nhau [34]. Mỗi loại có nguyên nhân riêng của nó, nhưng đều có nguồn gốc chung từ việc tế bào bị đột biến gen [34]. Năm 1953, lần đầu tiên tế bào ung thư được quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Những thành tựu nghiên cứu ở mô hình tế bào cho đến nay là cơ sở chắc chắn cho nhận định của giáo sư Arnold Graffi “vấn đề của ung thư thực chất là vấn đề của tế bào học”. Vì vậy muốn điều trị ung thư phải hiểu được cơ sở tế bào học của nó [8, 34]. Các đặc điểm nổi bật chung của tế bào ung thư là tế bào bị đột biến gen, có khả năng sự tăng sinh vô hạn, không kiểm soát được, có khả năng xâm lấn và phát triển ở các cơ quan, tổ chức khác của cơ thể (sự di căn), có khả năng tăng sinh mạch máu [13, 34]. Bệnh ung thư bắt đầu từ khi có một tế bào bắt đầu vượt qua sự kiểm soát của cơ thể, bị đột biến gen, phát triển không ngừng và hình thành một đám tế bào có chung đặc điểm là phát triển vô kiểm soát, xâm lấn và chèn ép các mô xung quanh. Có rất nhiều nguyên nhân làm chuyển dạng tế bào lành thành tế bào ung thư, bao gồm: các tác nhân vật lý (chủ yếu là tia bức xạ ion hóa), các tác nhân hóa học, các virus, một số bệnh viêm mạn tính, nhiễm trùng lâu ngày, rối loạn nội tiết, rối loạn hoạt động enzyme và nhiều vấn đề dinh dưỡng liên quan. Các tác nhân này gây ảnh hưởng sâu sắc đến cơ cấu di truyền phân tử của tế bào, làm thay đổi khả năng trao đổi chất, năng lượng và thông tin với môi trường. Ngoài ra, ung thư còn có thể do yếu tố di truyền bẩm sinh Quá trình hình thành khối u từ tế bào ung thư phải trải qua nhiều giai đoạn. Thời gian từ tế bào ung thư khởi đầu đến khi xuất hiện một u có thể nhận biết gọi là thời kì tiềm ẩn (ở người có thể kéo dài từ 10 đến 20 năm) [8, 34]. Sau khi phát triển thành khối u, các tế bào ung thư tiếp tục tăng sinh hỗn loạn, tự mất đi các thụ thể để nhận biết giới hạn với các tế bào bên cạnh, sản xuất ồ ạt cytokin và enzyme proteaza để phá hủy màng đệm lót và môi trường ngoại bào xung quanh. Do đó, các tế bào ung thư liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục sinh sôi, nảy nở, tăng sinh số lượng. Quá trình này được gọi là sự di căn (metastasis). Nói cách khác, di căn là một hay nhiều tế bào ung thư tăng trưởng ở một khoảng cách nào đấy cách nơi phát sinh tiên phát của khối u. Thông thường do hậu quả của di căn mà ung thư gây ra là xấu, có khả năng gây tử vong Thuốc chữa ung thư có nguồn gốc thực vật gồm một số alkaloid, glycozid hoặc các dẫn chất bán tổng hợp của chúng. Thuốc nhóm này có thể kể đến là: vincristin, vinblastin, podophyllin, thaliblastin, etoposid, teniposid, elsidin. Các nghiên cứu đã chỉ ra một số cây thuốc Việt Nam có các thành phần kể trên: a. Dừa cạn: tên khoa học là Catharanthus roseus, thuộc họ trúc đào Apocynaceae. Từ dừa cạn đã chiết được các alkaloid chữa ung thư là vinblastin, vincristin, cũng như các bán tổng hợp từ vinblastin là vinorelbin và eldisin . b. Một số cây trong họ hành tỏi Liliaceae như tỏi ta, hành ta và tỏi độc. Nước chiết từ tỏi có tác dụng chống lại ung thư miệng của chuột hamster khi gây ung thư miệng chuột. Dầu tỏi và dầu hành có tác dụng chống lại khối u ở da chuột nhắt trắng . c. Cây bát giác liên tên khoa học là Podophyllum tonkinense Gagnep, họ Hoàng liên gai Berberidaceae. Cây này ở nước ta chưa thấy nghiên cứu tác dụng chữa ung thư nhưng ở Mỹ người ta đã chiết được từ cây Podophyllum peltatum L. cùng họ Berberidaceae chất podophyllotoxin có tác dụng chữa ung thư. d. Cây thông đỏ tên khoa học là Taxus wallichiana zucc, thuộc họ thanh tùng Taxaceae. Từ thông đỏ đã chiết xuất ra chất 10-deacetylbaccatin II, rồi chuyển hóa ra thành taxol có tác dụng chữa ung thư. e. Đu đủ tên khoa học là Carica papaya L, họ đu đủ papayaceae, qua nghiên cứu đều cho thấy có tác dụng chữa ung thư . Phương pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt chất trong mô hình in vitro a, Nạp tế bào 8000 tế bào trong 180 µl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùy thuộc từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37 0 C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chất. b, Ủ với thuốc thử Sau 24h nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20µl dịch thuốc đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử. Tế bào được ủ với các chất theo 5 nồng độ 30μM -10μM -3μM -1μM – 0,3μM trong 48h. Mỗi nồng độ được lặp lại 4 lần. Sau đó đem cố định với TCA. c, Nhuộm với SRB Protein tổng số của tế bào sau khi cố định bằng TCA 50% được nhuộm trong 10 phút bằng dung dịch SRB 4% với lượng 100µl/giếng ở nhiệt độ phòng. Lượng SRB dư thừa được rửa trôi bằng dung dịch 1% axit axetic, lặp lại 5 lần. Sau đó hong khô ở nhiệt độ phòng. d, Hòa tan thuốc nhuộm Thuốc nhuộm đã bám vào protein được thôi ra bằng cách lắc nhẹ trên máy lắc với 100 µl dung dịch 10mM tris-base/giếng. e, Đo mật độ quang học Mật độ quang học của dung dịch SRB vừa được thôi ra trong các giếng được xác định bằng máy Microplate reader Model 680 (BioRad) ở bước sóng 540 nm. f, Tính toán số liệu và ghi kết quả Dựa vào giá trị mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế bào theo công thức sau: A (%) = T VH x 100% Trong đó: VH: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi dùng để pha hoạt chất . T : là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với hoạt chất Nếu : A = 50% thì có nghĩa là thuốc đã ức chế và làm chết 50% tế bào. Nồng độ của hoạt chất khi A đạt giá trị 50% gọi là liều gây ức chế 50% sự phát triển của tế bào, kí hiệu là IC50. Phương pháp thử tác dụng của hoạt chất trên spheroid MCF7 Phương pháp tạo spheroid MCF7 Bước 1: Chuẩn bị đĩa 96 giếng phủ agarose  Hòa tan agarose trong nước cất khử trùng nồng độ 3% (3g/100ml)  Đun nóng agarose bằng lò vi sóng ở nhiệt độ 120 0 C trong 15 phút  Làm nóng môi trường nuôi cấy bằng tủ sấy ở 70 0 C trong 5 phút  Pha agarose 3% trên với môi trường đã đun nóng (tỷ lệ 1:1) được agarose 1,5%.  Nhỏ 50µl agarose trên vào mỗi giếng  Sau 2h để agarose đông hoàn toàn, nhỏ tiếp 150µl môi trường/giếng. Bước 2: Chuẩn bị tế bào  Hoạt hóa tế bào từ Nitơ lỏng:  Rã đông tế bào lưu giữ trong Nitơ lỏng (-196 0 C). Phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp (khoảng 7ml MT) trong ống falcon 15ml.  Đem ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút  Thu tế bào lắng, phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp có bổ sung 20% FBS, ủ trong tủ ấm 37 0 C, 5% CO 2 . Nuôi tế bào đến khi tế bào bám mặt đĩa nuôi cấy khoảng 75-90% thì tiến hành thu tế bào.  Thu tế bào: sử dụng trypsin để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma. Bước 3: Tạo spheroid  Nhỏ 20µl tế bào (nồng độ 5000TB/20µl) lên nắp đĩa  Đậy nắp đĩa vào đĩa agarose đã chuẩn bị trước  Nuôi trong tủ ấm 37 0 C, 5% CO 2 .  Sau 2 ngày tiến hành hạ giọt treo xuống nền agarose. Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid trên spheroid MCF7 Sau khi hạ giọt spheroid, để spheroid phát triển ổn định, sau khoảng 5-7 ngày tiến hành tra mẫu hoạt chất với 5 nồng độ khác nhau: 30, 20, 15, 10, 5 µM. Đồng thời tiến hành tra taxol ở các giếng đối chứng thử với taxol với 5 nồng độ là: 30; 3; 0,3; 0,03; 0,003 µg/ml (Bảng 4). Bố trí thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1 trên mô hình spheroid MCF7 3.8(µM) Taxol (µg/ml) A M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 B M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 C M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 D M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 E MT VH F MT VH G MT VH H MT VH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (M): Giếng được nạp môi trường nuôi cấy; (MT): Giếng gồm môi trường nuôi cấy và spheroid; (V H ): Giếng gồm môi trường nuôi cấy, spheroid và dung môi pha mẫu dùng làm đối chứng. Quy ước: Ngày tiến hành tra thuốc được tính là ngày 0. Các ngày tiếp theo sau khi tra thuốc được tính là ngày 1, 2, 3, Xác định thể tích khối spheroid MCF7 Tiến hành theo dõi sự phát triển của khối spheroid dưới tác dụng của thuốc ở các nồng độ khác nhau. Chụp ảnh spheroid MCF7 sau đó dùng phần mềm Carl Zeiss Axio Vision 4.5 để đo đường kính khối cầu spheroid. Sau đó tính thể tích spheroid theo công thức của Rolf Bjerkvig [29]. - Đối với những spheroid bình thường có hình dạng khối cầu thì tính thể tích khối cầu spheroid theo công thức: V= 4 3 .π.(a.b) 3/2 - Đối với những spheroid bất thường không còn hình dạng khối cầu thì tính thể tích khối spheroid theo công thức: V= 0,4.a.b 2 Trong đó: a: đường kính nhỏ nhất của khối cầu b: đường kính lớn nhất của khối cầu V: thể tích khối cầu spheroid. Phương pháp gây u rắn và thử tác dụng chống ung thư của hoạt chất 1 trên chuột Gây u Chuột 05 tuần tuổi (trọng lượng trung bình 18 - 20g) sau khi được bắt về 01 ngày, được tiến hành gây u. Dùng sơranh, kim 18G tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào Sarcoma180 (tương đương 10 6 tế bào) vào dưới da vùng ngực (lệch về phía bên phải chuột) để tạo u rắn trên chuột. Phân lô Sau 05 ngày cấy truyền, quan sát thấy khối u rắn đã xác định rõ, tiến hành phân lô, đo kích thước khối u và trọng lượng. Chuột được chia làm 07 lô:  01 Lô Đối chứng sinh học - viết tắt là ĐCSH: chuột khỏe mạnh bình thường, không cấy truyền TBUT.  01 Lô Đối chứng ung thư - viết tắt là ĐCUT: chuột được cấy truyền TBUT.  01 Lô Đối chứng ung thư uống dung môi - viết tắt là ĐCDM: chuột được cấy truyền TBUT, uống dung môi là dầu gấc.  01 Lô Đối chứng ung thư uống 6-MP – viết tắt UT+6-MP: chuột được cấy truyền TBUT, uống 6-MP pha trong nước cất.  03 lô đối chứng ung thư uống hoạt chất 1 - viết tắt là UT+1 (1g/kg); UT+1 (0,5g/kg); UT+1 (0,2g/kg): chuột được cấy truyền TBUT, uống hoạt chất 1 pha trong dung môi dầu gấc với nồng độ hoạt chất lần lượt là 1g; 0,5g; 0,2g hoạt chất trên 1kg thể trọng chuột. Cách cho uống Dùng sơranh (có kim cho uống dài, đầu tù) cho sâu vào trong cổ họng chuột để tránh hiện tượng chuột nhè thuốc ra ngoài, cho chuột uống vào các ngày thứ 2, 3, 5, 6 trong tuần. Liều uống Chất 1: 3 liều uống tương ứng với 3 lô là 1g; 0.5g; 0.2g/kg thể trọng tương đương với 20; 10; 4mg/con/lần. 6-MP: liều uống 0,96 mg/con/lần. ĐCDM: uống dầu gấc 100µl /con/lần. Kết quả Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của 04 hoạt chất là các lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans là acid meso-dihydroguairetic, macelignan, fragransin A2, nectandrin B trên mô hình tế bào 2D, spheroid và in vivo chúng tôi thu được các kết quả như sau: Trong 04 hoạt chất thì acid meso-dihydroguairetic có hoạt tính kháng u mạnh nhất khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). Ở mô hình spheroid, acid meso-dihydroguairetic có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và gây tan khối cầu spheroid MCF7. Trong in vivo, acid meso-dihydroguairetic gây tiêu hết u trên chuột nhắt swiss đến 50% ở liều thử thuốc cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng đồng thời làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử . Từ những nghiên cứu in vitro và in vivo đã tiến hành trên 4 hoạt chất meso- Dihydroguaireic acid; Macelignan; Fragransin A và Nectandrin B sàng lọc được chúng tôi rút ra những kết luận sau:  meso-dihydroguairetic acid có hoạt tính kháng u khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC 50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 (IC 50 = 10,11 µM). Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK với tỷ số tăng sinh đạt 87,76% so với đối chứng khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM).  meso-dihydroguairetic acid có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và gây tan khối cầu spheroid của dòng tế bào MCF7. Chỉ một ngày sau khi tra chất 1 thể tích khối spheroid đã giảm đáng kể ở tất cả các nồng độ 10, 15, 20, 30 µM. Đến ngày thứ 4 thì thể tích khối cầu spheroid gần như không đáng kể (chỉ còn vài 6- 7% so với ngày thứ nhất).  meso-dihydroguairetic acid gây tiêu hết u đến 50% trên chuột nhắt trắng Swiss mang u rắn Sar180 ở liều thử thuốc cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng. Chất thử còn có tác dụng làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử, kéo dài nhất là liều 1g/kg thể trọng. Chuột ở lô ĐCUT chỉ sau 35 ngày kể từ khi tạo u chuột đã chết hoàn toàn, ở các lô sử dụng chất số 1 còn 30% số chuột vẫn sống đến ngày thứ 60. Những kết quả nghiên cứu trên có thể kết luận hoạt chất meso-dihydroguairetic acid (1) có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư in vitro và in vivo. Tuy nhiên cơ chế tác dụng của hoạt chất này vẫn chưa được biết rõ. Hy vọng những kết quả này sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và định hướng phát triển của hoạt chất 1 trong tương lai. References Tiếng Việt 1. Đỗ Trung Đàm (1995), Thuốc chữa ung thư, NXB Y học, Hà Nội. 2. Lê Xuân Hải (2009), Đánh giá độc tính và tác dụng kích thích miễn dịch, chống gốc tự do của cao thuốc thảo dược VID, Luận án tiến sĩ. 3. Hiệp hội chống ung thư UICC (1999), Ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội. 4. Bùi Văn Lệ, “Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật và đường saccarose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9 (6), tr59. 5. Đỗ Tất Lợi (2003), Các cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. 6. Chu Văn Mẫn (2009), Tin học trong công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 7. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học trên người và động vật, NXB Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Quỳ (1993), Gây tạo mô hình u báng thực nghiệm và thử tác dụng phòng chống ung thư của một số hoạt chất tự nhiên và tổng hợp, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 9. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Kamenarka.Z, Bankova.V, Popov.S, Zvetkova.E, Lê Mai Hương (2011), “Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn Alcoloid từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crium latifolium)”, Tạp chí Dược học số 11, tr21-23. 10. Trần Công Yên (1990), Tế bào ung thư - một mục tiêu tấn công chủ yếu của Sinh – Y học hiện đại, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tài liệu đánh máy lưu hành nội bộ. 11. http://www.thuocbietduoc.com.vn/tin-tuc-11252-2-5/ung-thu-do-loi-song-tang- chong-mat.aspx0 12. http://wvww.thuoc-suckhoe.com/khainiem/BAIVIET/phanloai 026.htm 13. http://www.ungthu.net Tiếng Anh 14. Chung, J.Y., Choo, J.H., Lee, M.H., Hwang, J.K (2006), “Anticariogenic activity of macelignan isolated from Myristica fragrans (nutmeg) against Streptococus mutans”, Phytomedicine, 13, 261-266. 15. Forrest, J.E., Heacock, R.A., Forrest, T.P. (1974), “Diarylpropanoids from nutmeg and mace”, Myristica fragrans Houtt, 2, 205-209. 16. Freshney, R.I. (2005), “Culture of Animal Cells”, A Manual of Basic Technique, 5th edition. 17. Gils, C.V., Alan Cox, P. (1994), “Ethnobotany of nutmeg in the Spice Islands” , J. Ethnopharmacol, 42, 117-124. 18. Hanahan, D., Weinberg R.A. (2000), "The Hallmarks of Cancer". Cell, 100, 57– 70. 19. Kwon, H.S., Kim, M.J., Jeong, H.J., Yang, M.S., Park, K.H., Jeong, T.S., Lee, W.S. (2008), “Low density lipoprotein (LDL)-antioxidant lignans from Myristica fragrans seeds”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 194-198. 20. Masters, J.R.W. (2002), Cancer cell lines, Vol.I. 21. Morita, T., Jinno, K., Kawagishi, H., Arimoto, Y., Suganuma, H., Inakuma, T., Sugiyama, K. (2003), “Hepatoprotective effect of myristicin from nutmeg (Myristica fragrans) on lipopolysaccharide/d-galactosamine-induced liver injury”, J. Agric. Food Chem., 51, 1560-1565. 22. Laboratory, T.J. (2008), Mouse Models for Cancer Research. 23. Olajide, O.A., Ajayi, F.F., Ekhelar, A. I., Awe, S.O., Makinde, J.M., Alada, A.R. (1999), “Biological effects of Myristica fragrans (nutmeg) extract”, Phytother. Res., 13, 344-345. 24. Oliveros – Belardo, V.A., Masilugan, V., Cardeno, F., Devera, E., Delacruz, E., Valmonte. J. (1972), “Possible antitumor conitituent of Carica papaya”, Asia J.Pham.r, 26-9. 25. Ozaki, Y., Soedigdo, S., Wattimena, Y.R., Suganda, A.G. (1989), “Antiinflammatory effect of mace, aril of Myristica fragrans Houtt., and its active principles”, Jpn. J. Pharmacol., 49, 155-163. 26. Park, S., Lee, D.K., Yang, C. (1998), “Inhibition of fos-jun-ADN complex formation by meso-Dihydroguaireic acid and in vitro cytotoxic effect of cancer cells”, Cancer Lett., 127 (1-2), 23 -28. 27. Phuong Thien Thuong., Nguyen Trang Thuy., Dao Trong Tuan., Nguyen Minh Khoi., Won Keun Oh. (2009), “Major lignans from the seeds of Myristica fragrans (Nutmeg)”, Tạp chí Dược liệu, 14(2), 82-85. 28. Ram, A., Lauria, P., Gupta, R., Sharma, V.N. (1996), “Hypolipidatemic effect of Myristica fragrans fruit extract in rabbits”, J. Ethnopharmacol., 55, 49-53. 29. Rolf Bjerkvig, Ph.D. (1992), Spheroid culture in cancer research, Illustrated. 30. Sharma, A., Mathur, R., Dixit, V.P. (1995), “Prevention of hypercholesterolemia and atherosclerosis in rabbits after supplemientation of Myristica fragrans seed extract”, Indian J. Physiol. Pharmacol., 39, 407-410. 31. Sohn, J.H., K.L., Choo, J.H., Hwang, J.K. (2007), “Macelignan protects HepG2 cells against tert-butylhydroperoxide-induced oxidative damage”, Biofactors, 29, 1-10. 32. Suckow, M.A. (2001), The laboratory mouse, A Volume in The Laboratory Animal Pocket Reference Series. 33. Teicher, B.A (1997), Anticancer Drug Development Guide. 34. Weiberg, R.A. (2007), The Biology of Cancer. Garland Science Publishing House, Michigan, USA. 35. http://en.wikipedia.org/wiki/Nutmeg . Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu (Myristica Fragrans) Nguyễn Thị Chinh. tài Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans” với các mục đích chính như sau: - Thử hoạt