Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA CHẤT CT-1 CHIẾT XUẤT TỪ CÂY KHỔ SÂM CHO LÁ TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH Trịnh Hồng Anh*; Cao Minh Hưng*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn** Phương Thiện Thương*; Nguyễn Minh Khởi*; Lê Tuấn Anh* TÓM TẮT Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 chiết xuất từ Khổ sâm cho có tác dụng dự phòng điều trị ung thư phổi người tế bào không nhỏ (UTPNTBKN) chuột thiếu hụt miễn dịch, thể hiện: - Sau ghép tế bào (TB) ung thư, nhóm dự phòng có 20% chuột khơng xuất khối u, nhóm chứng nhóm điều trị 100% xuất khối u - Kích thước khối u nhóm điều trị nhỏ nhóm chứng thời điểm theo dõi - Sau tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết nhóm chứng 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm điều trị 40% * Từ khóa: Khổ sâm cho lá; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn Research about Anticancer of CT-1 Extracted from Croton tonkinensis Gagnep on Nude Mice Summary CT-1 extracted from Croton tonkinensis Gagnep with dose of 50 mg/kg has the effective in prevention and treatment of lung cancer on nude mice: - After cancer cell transplantation, 20% of mice in control group had no tumor, 100% of mice in prevention and treatment groups had tumor - The volume of tumor in treatment group was smaller than the other groups at any times - After months: control goup: 100% of nude mice dead, prevention group: 60% of nude mice dead, treatment group: 40% of nude mice dead * Key words: C tonkinensis; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Khổ sâm cho có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), loại đặc hữu Việt Nam sử dụng làm thuốc chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở lt, đau bụng ngồi (lỵ cấp tính), ăn không tiêu, viêm loét tá tràng, đau dày * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ** Học viện Quân y *** Viện Dược liệu Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 27/11/2014 Ngày báo đăng: 28/11/2014 19 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Các nghiên cứu thành phần hóa học Khổ sâm cho bắt đầu khoảng 20 năm trở lại cho thấy thành phần hóa học Khổ sâm cho ent-kauranediterpenoid, điển hình ent-18-acetoxy-7β-hydroxy kaur-15-oxo16-ene (tạm gọi chất CT-1), có hàm lượng khoảng 293,05 µg/g [3] Chất có tác dụng ức chế phát triển nhiều dòng TB ung thư in vitro, g m thư v MCF-7, ung thư phổi NCI-H460 [6], ung thư gan SK-HEP1 [7], ung thư đại tràng Caco-2 LS180 in vitro [8] Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi tắt chuột nude) bước đột phá nghiên cứu ung thư, cho phép nghiên cứu ung thư người thể động vật Chuột nude có gen bị đột biến đ ng hợp tử (homozygous), gen quy định phát triển lông tuyến ức Do đó, với gen bị đột biến, chuột nude có tuyến ức bị suy giảm chức chí khơng có tuyến ức, khơng có lơng hệ thống đáp ứng miễn dịch TB bị hạn chế suy giảm mạnh số lượng TB lympho T Nhờ vậy, ghép TB ung thư người lên chuột nude, khối u phát triển không bị đào thải yếu tố miễn dịch chuột khối u mang đặc tính sinh học tương đ ng với khối ung thư thể người Để đánh giá tác dụng kháng ung thư mơ hình in vivo, ch ng thực đề tài nhằm: Đánh giá tác dụng kháng ung thư chất CT-1 chiết xuất từ Khổ sâm cho mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Chuột thiếu hụt miễn dịch: 30 - TB UTPNTBKN (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) A549 (Công ty ATCC, Hoa Kỳ) - Môi trường nuôi cấy TB ung thư - Thước đo kích thước khối u, tủ nuôi cấy TB - Chất CT-1 thu từ trình chiết xuất, phân lập từ Khổ sâm cho Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy TB ung thư tạo khối u chuột: TB UTPNTBKN A549 nuôi cấy môi trường Eagle’s minimum essential medium, bổ sung fetal bovine serum 10%, 1% penicillin streptomycin (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức), 1,5 mcg insulin/ml mơi trường Mỗi chai ni cấy diện tích 75 cm2 chứa 106 TB TB nuôi cấy tăng sinh thay môi trường lần/tuần điều kiện nhiệt độ 370C, CO2 5% Khi TB phát triển đạt 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang chai Tách TB đếm, thu TB với n ng độ 107 TB/ml để phục vụ thử nghiệm Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước tách rửa hai lần dung dịch PBS 1X, sau tách dung dịch trypsin-EDTA 1X Dung dịch TB ung thư chuẩn bị h t vào bơm tiêm ml với số lượng 107/ml Cố định chuột nude tiêm 0,1 ml vào da đùi phải (106 TB/chuột) Quá trình thao tác thực điều kiện vơ trùng tuyệt đối TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 * Đánh giá hiệu dự phòng điều trị ung thư CT-1: - Phân nhóm: 30 chuột nude, phân thành nhóm: + Nhóm dự phòng: 10 con, uống CT-1 với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, tuần liên tục trước ghép TB tạo khối ung thư + Nhóm điều trị: 10 con, uống CT-1 với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, tuần liên tục sau có khối ung thư + Nhóm chứng: 10 con, uống nước cất với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng/ngày, tuần liên tục sau có khối ung thư - Sau ghép TB, xuất khối u, phân riêng chuột nhóm dự phòng, chuột lại chia ngẫu nhiên thành nhóm điều trị nhóm chứng bắt đầu cho uống thuốc - Đánh giá theo dõi phát triển khối u vị trí tiêm (đùi phải) lần/tuần quan sát, sờ nắn đo kích thước thước xác NSK + Kích thước khối u: đo theo kích thước dài x rộng thước xác NSK (Nhật Bản) 01 lần/tuần Kích thước u tính theo cơng thức: V = D x R2 x 0,5 (Yamaura CS, 2000), đó: V: thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng khối u Q trình đánh giá kích thước khối u dừng lại có chuột chết nhóm nào, khác theo dõi để xác định thời gian sống thêm + Thời gian sống nhóm: thời gian sống chuột tính từ sau ghép TB ung thư Q trình theo dõi thời gian sống nhóm chuột dừng lại tồn chuột nhóm chứng chết - Các tiêu đánh giá: + Tỷ lệ xuất khối u + Kích thước khối u trung bình nhóm + Tỷ lệ chết sau theo dõi Kết nghiên cứu bàn luận Tỏc dng dự phòng ung thƣ CT-1 120% 100% 100% Nhóm chứng Nhóm điều trị 100% 80% 80% 60% 40% 20% 0% Nhóm dự phòng Biểu đồ 1: Tỷ lệ xuất khối u sau ghép TB ung thư nhóm (n = 10) 21 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Cho chuột thiếu hụt miễn dịch uống chứng Điều chứng tỏ, chất CT-1 chất CT-1 với liều 50 mg/kg/ngày khơng có tác dụng dự phòng ung thư tuần liên tục, sau ghép 10 TB phổi mà có tác dụng ức chế phát A549/con Trong số 10 chuột nhóm này, triển TB ung thư phổi chuột thiếu chuột phát triển khối u, chuột (20%) hụt miễn dịch không phát triển khối u (sau tuần ghép - Hình ảnh đại thể: TB) Đối với nhóm chứng nhóm điều trị, 100% chuột có khối u phát triển Điều cho thấy chất CT-1 có tác dụng dự phòng ung th- phỉi Tác dụng CT-1 lên kích thƣớc khối u Nhóm chứng Biểu đồ 2: Kết theo dõi thể tích khối u qua thời điểm nghiên cứu Chuột sau hình thành khối u (ở ngày Nhóm dự phòng thứ 7), kích thước khối u nhóm tương đương Tiếp tục theo dõi kích thước khối u ch ng tơi nhận thấy: nhóm điều trị CT-1 có tác dụng cải thiện rõ rệt kìm hãm tốc độ phát triển khối u, thể kích thước khối u nhóm điều trị ln nhỏ nhóm chứng nhóm dự phòng thời điểm theo dõi Nhóm dự phòng, kích thước khối u có xu hướng nhỏ hơn, nhiên chưa có khác biệt đáng kể so với nhóm 22 Nhóm điều trị Ảnh 1: Hình ảnh khối u nhóm thời điểm bắt đầu theo dõi TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Khối u nhóm thời điểm bắt đầu theo dõi có kích thước tương đ ng Thời gian sống dƣ chuột sau ghép TB ung thƣ Khối u nhóm chuột phân ngẫu Thời gian sống dư nhóm: thời nhiên, có kích thước trung bình khoảng 70 gian sống dư chuột tạm coi từ mm Khối u có bờ rõ, cứng chắc, di sau ghép TB ung thư Trong suốt thời động Da phía khơng thay đổi màu sắc gian này, ngồi việc đo kích thước khối u, ch ng tơi theo dõi biểu bất thường khác liệt, chết Quá trình theo dõi thời gian sống dư nhóm chuột dừng lại tồn chuột nhóm chứng chết Nhóm chứng Biểu đồ 3: Biểu diễn thời gian sống nhóm chuột Sau tháng, tồn chuột nhóm Nhóm dự phòng chứng chết, thống kê thời gian sống dư nhóm, so sánh tỷ lệ chuột chết Nhóm điều trị 60% chuột sống (6 con), nhóm dự phòng 40% (4 con, khơng mọc u) Như vậy, chất CT-1 có tác dụng kéo dài thời gian sống dư chuột nude mang khối ung thư phổi người KẾT LUẬN Nhóm điều trị Đánh giá tác dụng chất CT-1 chiết Ảnh 2: Hình ảnh khối u nhóm xuất từ Khổ sâm cho chuột thiếu thời điểm 35 ngày sau điều trị hụt miễn dịch mang khối ung th- phỉi người Sau 35 ngày điều trị, kích thước khối u khác biệt đáng kể nhóm 23 ch ng tơi nhận thấy: TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 bước đầu cho thấy có tác dụng dự phòng điều trị ung thư phổi khơng biệt hóa TB nhỏ, thể hiện: - Nhóm dự phòng có 20% chuột khơng xuất khối u, nhóm chứng nhóm điều trị 100% xuất khối u - Kích thước khối u nhóm điều trị nhỏ nhóm chứng thời điểm theo dõi Phương Thiện Thương, Đào Trọng Tuấn, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi Tổng quan nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Khổ sâm cho Hà Nội 2014 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Hamada Y, Otsuka H Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis Gagnep Chem Pharm Bull 2005, 53 (3), pp.296-300 - Sau tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết nhóm chứng 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm điều trị 40% Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee JJ, Otsuka H Four ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep Chem Pharm Bull 2004, 52, pp.879-882 TÀI LIỆU THAM KHẢO ATCC http://www.atcc.org/ATCCA dvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ Default.aspx?ATCCNum=30-500K&Template= bioproducts Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn Nghiên cứu tạo khối ung thư tuyến tiền liệt người chuột nude “nude mice” kỹ thuật ghép dị lồi Tạp chí Y - Dược học Quân 2011, 2 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn Xác định hoạt chất ent-kauranditerpenoid Khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) sắc ký lỏng hiệu cao Tạp chí Dược học 2011, 8, tr.29-33 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn Hoạt tính gây độc TB ent-kauranditerpenoid từ thuốc Khổ sâm cho (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Tạp chí Dược học 2011, 419, tr.24-27 24 ATCC http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default aspx?ATCCNum=HTB22&Template=cellBiology Nguyen Minh Khoi, Phuong Thien Thuong, Saho Ohta, Shinichiro Shiota, Hironori Kanta, Kenji Takeuchi, Fumiaki Ito An ent-kauran diterpenoid from Croton tonkinensis Induce Apoptosis in Colorectal cancer cell through the phosphorylation of JNK mediated by reactive oxygen species and dual - specificity JNK kinase MKK4 Anticancer Agent in Medicinal Chemistry 2014, 14, pp.1051-1061 ... ung thư chất CT-1 chiết xuất từ Khổ sâm cho mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Chuột thiếu hụt miễn dịch: ... nuôi cấy TB ung thư - Thư c đo kích thư c khối u, tủ ni cấy TB - Chất CT-1 thu từ trình chiết xuất, phân lập từ Khổ sâm cho Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy TB ung thư tạo khối u chuột: TB UTPNTBKN... Caco-2 LS180 in vitro [8] Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi tắt chuột nude) bước đột phá nghiên cứu ung thư, cho phép nghiên cứu ung thư người thể động vật Chuột nude có gen bị đột biến