Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng ung thư của interleukin-12 (IL-12) tái tổ hợp trên mô hình chuột mang ung thư phổi (UTP). Đối tượng và phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis vào dưới da đùi phải 19 chuột nhắt trắng BALB/c, khi khối u phát triển với kích thước khoảng 7 - 10 mm đường kính.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA INTERLEUKINE-12 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI UNG THƢ PHỔI Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Thái Biềng*; Nguyễn Thị Thịnh** Lương Cao Đồng***; Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng ung thư interleukin-12 (IL-12) tái tổ hợp mơ hình chuột mang ung thư phổi (UTP) Đối tượng phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis vào da đùi phải 19 chuột nhắt trắng BALB/c, khối u phát triển với kích thước khoảng - 10 mm đường kính, chia chuột ngẫu nhiên thành nhóm: nhóm chứng khơng điều trị nhóm điều trị với đơn liều protein IL-12 tái tổ hợp (0,1 0,6 µg/chuột) Kết quả: 19/19 chuột hình thành khối u sau tuần ghép 10 TB ung thư với tỷ lệ thành công 100% Sau tuần theo dõi, tỷ lệ chuột sống nhóm chuột điều trị protein IL-12 10/12 (83,33%), chuột thoái lui u 9/12 (75%), chuột sống thối lui u nhóm khơng điều trị 3/7 (42,86%) 2/12 (16,67%) chuột chết nhóm điều trị, 4/7 (57,14%) chuột chết nhóm khơng điều trị Kết luận: IL-12 tái tổ hợp có tác dụng kháng ung thư mơ hình chuột mang khối UTP * Từ khóa: Tế bào ung thư phổi; Chuột Lewis; Chuột nhắt BALB/c; Protein IL-12 tái tổ hợp Study on Anti-Cancer Effect of Human Recombinant Interleukin-12 Protein in Lung Cancer Mouse Model Summary Objectives: To evaluate the anti-cancer effect of human recombinant interleukin-12 (IL-12) protein in lung cancer mouse model Subjects and methods: Mouse Lewis lung cancer cells were inoculated subcutaneously in the right thighs of 19 BALB/c mice; when the tumors grew up to a size of - 10 mm in diameter, mice were randomly divided into groups: control group and experimental groups, which received a single doses of recombinant IL-12 protein, 0.1 0.6 µg/mouse, respectively Results: 19/19 mice developed tumors after week inoculation 10 tumor cells per mouse, the successful rate reached 100% After weeks of experiment, number of surviving mice and having tumor regression in IL-12 treated groups were 10/12 (83.33%) and 9/12 (75%), respectively; the number of mice alive with regression tumors in control group was 3/7 (42.86%) The number of dead mice in recombinant IL-12 protein treated groups was 2/12 (16.67%); the number of dead mice in control group was 4/7 (57.14%) Conclusion: recombinant IL-12 protein has anti-cancer effect in mouse model of lung cancer * Key words: Lung cancer cells; Lewis mouse; BALB/c mouse; Recombinant interleukin-12 protein * Học viện Quân y ** Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 27/11/2015 Ngày báo đăng: 30/11/2015 65 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi loại ung thư biến toàn cầu, số ca mắc năm - Protein tái tổ hợp IL-12 người sản phẩm đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.11/11-15 tăng trung bình 0,5% Ở Việt Nam, tỷ lệ - Động vật nghiên cứu ni bệnh nhân (BN) mắc UTP có xu điều kiện phòng thí nghiệm ngày hướng gia tăng, năm nước có trước tiến hành ghép TB, đảm bảo 20.000 BN có tới 17.000 trường thức ăn nước uống theo nhu cầu hợp tử vong UTP nguyên nhân gây tử vong hàng đầu số BN ung thư [8] Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị * Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu: - Môi trường nuôi cấy TB ung thư EMEM UTP, hiệu chưa cao [9] Theo (eagle's minimal essential medium), FBS báo cáo thống kê Mỹ, tỷ lệ UTP sống (fetal bovine serum) 10%; dung dịch năm chiếm 15% Ở châu Âu, penicillin streptomycin 1%; trypsin-EDTA tỷ lệ khoảng 10%, số (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức) ghi nhận quốc gia phát - Vật tư cần thiết phục vụ cho ni cấy triển 8,9% [8] Để góp phần nghiên cứu TB: chai nuôi, plate 96 giếng, pipet, chai tác dụng chống UTP đáp ứng yêu cầu đựng môi trường, lọc vi khuẩn (ATCC, phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng UTP, Hoa Kỳ) tiến hành thí nghiệm nhằm: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư IL-12 người tái tổ hợp mơ hình chuột mang khối UTP (protein IL-12 tái tổ hợp sản phẩm đề tài cấp Nhà nước KC04.11/11-15 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng, vật liệu, chất liệu nghiên cứu * Đối tượng, vật liệu nghiên cứu: - Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ ni cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C, tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng… Phƣơng pháp nghiên cứu * Kỹ thuật nuôi cấy TB UTP chuột Lewis: Nuôi cấy TB UTP chuột Lewis môi trường EMEM, bổ sung FBS 10%, penicillin streptomycin 1% TB nuôi cấy tăng sinh điều kiện nhiệt độ - TB UTP chuột Lewis (mã LLc1/LL/2; ATCC, Hoa Kỳ) 37oC, CO2 5%, thay môi trường lần/tuần - Chuột nhắt trắng BALB/c - 10 tuần tuổi, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm (Charles River Laboratories, Hoa Kỳ) Khi TB phát triển đạt 80% diện tích chai 66 Mỗi chai ni cấy có diện tích 75 cm2 ni, tiến hành cấy chuyển sang chai nuôi cấy với tỷ lệ 1:3 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Thu hoạch TB ung thư nuôi cấy - Nhóm IL-12t: chuột mang u chai ni Trypsin EDTA, sau ly điều trị protein IL-12 tái tổ hợp liều tâm để loại bỏ môi trường thu TB Xác 0,1 µg/con, liều định mật độ TB mơi trường - Nhóm IL-12c: chuột mang u cách sử dụng buồng đếm Neubauer điều trị protein IL-12 tái tổ hợp liều kính hiển vi quang học Chuẩn nồng độ 0,6 µg/con, liều TB 107TB/ml Theo dõi, đánh giá phát triển, ghi * Tạo khối UTP chuột chuột nhắt trắng BALB/c: nhận thay đổi trọng lượng, kích thước khối u, tỷ lệ thối u (khối u khơng quan Dung dịch TB ung thư chuẩn bị hút vào bơm tiêm ml với số lượng 10 TB/ml Cố định chuột tiêm 0,1 ml da đùi phải (10 TB/chuột) sát mắt thường), thời gian chuột chết nhóm * Xử lý số liệu: xử lý thống kê sử dụng phần mềm SPSS 15.0 Cạo lông chuột vùng đùi phải KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU suốt q trình thí nghiệm Theo dõi toàn trạng, cân nặng, xuất hiện, tiến triển thối triển khối u vị trí tiêm Tình trạng tồn thân chuột q trình thí nghiệm (đùi phải) lần/tuần quan sát Sau tiêm TB UTP chuột Lewis, đo kích thước khối u thước chuột thí nghiệm ăn uống, hoạt động xác NSK bình thường, nhanh nhẹn, lơng mượt, Tính thể tích khối u theo cơng thức: V = (D x R ) x 0,5 mắt trong, hậu môn khô, không thấy biểu lỏng Chuột tăng cân so với trước Trong đó: thí nghiệm Nhóm chứng có chuột + V: thể tích khối u (mm3) chết (vào ngày 28, 32, 35 sau tiêm + D: chiều dài khối u (mm) + R: chiều rộng khối u (mm) TB); nhóm IL-12t có chuột bị chết (vào ngày thứ 35 sau tiêm TB); nhóm IL-12c có chuột chết (vào ngày 25 sau * Đánh giá tác dụng kháng ung thư IL-12 mơ hình chuột mang khối UTP: tiêm TB) Khi khối u phát triển với kích thước khoảng - 10 mm đường kính, chia ngẫu nhiên chuột thành nhóm: sống nhóm điều trị: 10/12 (83,33%); - Nhóm chứng: chuột mang u khơng điều trị cho nhóm chuột điều trị khơng Sau 35 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chuột nhóm khơng điều trị 3/7 (42,86%) Tỷ lệ chuột sống đạt 68,42% chung điều trị 67 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Diễn biến trọng lƣợng thể chuột nghiên cứu Bảng 1: Trọng lượng thể chuột nghiên cứu (g) Ngày Nhóm Nhóm chứng (1) Nhóm IL -12t (2) Nhóm IL -12-c (3) Thơng số N1 N8 N15 N21 N28 N35 n 7 7 X ± SD 21,27 ± 3,29 22,99 ± 4,02 25,03 ± 3,63 26,76 ± 4,41 25,82 ± 4,81 21,93 ± 1,50 n 6 6 X ± SD 21,45 ± 3,49 23,50 ± 4,19 23,75 ± 4,09 24,87 ± 3,01 26,47 ± 3,95 26,82 ± 2,18 n 6 6 5 X ± SD 21,78 ± 0,88 22,50 ± 1,57 24,25 ± 1,33 25,73 ± 2,08 24,42 ± 0,36 24,82 ± 0,79 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p Sau ghép TB UTP chuột Lewis, trọng lượng thể chuột nhóm tăng so với trước thí nghiệm Ở nhóm IL-12c, trọng lượng trung bình ngày 28 giảm 01 có u to chết Nhóm chứng, từ ngày 28 - 35, chuột chết u to nên trọng lượng trung bình chuột giảm Thời điểm ngày thứ 35, trọng lượng chuột nhóm IL-12t nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); thời điểm khác trọng lượng trung bình chuột nhóm khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Số lƣợng chuột thoái u thời điểm Bảng 2: Tỷ lệ chuột thoái u nhóm Ngày N8 n (%) N11 n (%) N15 n (%) N21 n (%) N28 n (%) N35 n (%) Nhóm chứng (1) 0/7 (0) 0/7 (0) 2/7 (28,57) 2/7 (28,57) 2/7 (28,57) 3/7 (42,86) Nhóm IL-12t (2) 0/6 (0) 1/6 (16,67) 2/6 (33,33) 2/6 (33,33) 3/6 (50) 4/6 (66,67) 0/6 (0) 0/6 (0) 2/6 (33,33) 3/6 (50) 4/6 (66,67) 5/6 (83,33) p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 Nhóm Nhóm IL-12c (3) p Chuột bắt đầu thoái u từ ngày 11 sau tiêm IL-12 tái tổ hợp Tỷ lệ thoái lui khối u nhóm chứng có xu hướng chậm so với hai nhóm điều trị IL-12 tái tổ hợp thời điểm nghiên cứu Số lượng chuột thối u nhóm điều trị cao nhóm chứng thời điểm từ ngày 11 đến ngày 35 tính từ tiêm IL-12 tái tổ hợp, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê 68 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Kết thể tích trung bình khối u chuột nghiên cứu Bảng 3: Thể tích trung bình khối u (mm3) Ngày Thơng số Nhóm N1 N4 N8 N11 N15 N18 n 7 7 6 X ± SD 587,62 ± 371,34 1059,75 ± 480,11 1789,58 ± 1155,55 1506,07 ± 1086,53 2808,95 ± 1187,88 4063,50 ± 2338,34 n 6 4 X ± SD 436,17 ± 145,58 881,25 ± 650,73 1231,73 ± 906,54 1391,31 ± 1184,25 1617,16 ± 302,24 1143,73 ± 903,49 n 6 6 4 X ± SD 437,58 ± 156,47 1178,80 ± 480,38 1322,77 ± 667,44 857,75 ± 688,22 928,06 ± 1145,02 789,80 ± 1025,91 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 < 0,05 p 3,1 < 0,05 Nhóm chứng (1) Nhóm IL-12t (2) Nhóm IL-12c (3) p Thể tích trung bình khối u nhóm chuột tăng dần sau ghép TB ung thư vào chuột Thể tích nhóm chuột IL-12c dao động nhẹ từ ngày 11 đến 18 tượng thối u Thể tích khối u nhóm chứng (chuột mang u khơng điều trị) lớn có ý nghĩa thống kê so với thể tích khối u hai nhóm chuột điều trị (tại thời điểm ngày thứ 15 18; p < 0,05) Diễn biến số lƣợng chuột chết thời điểm Bảng 4: Tỷ lệ chuột chết nhóm Ngày N21 n (%) N25 n (%) N28 n (%) N32 n (%) N35 n (%) Nhóm chứng (1) 0/7 (0) 0/7 (0) 2/7 (28,57) 3/7 (42,86) 4/7 (57,14) Nhóm IL-12t (2) 0/6 (0) 0/6 (0) 0/6 (0) 0/6 (0) 1/6 (16,67) Nhóm IL-12c (3) 0/6 (0) 1/6 (16,67) 1/6 (16,67) 1/6 (16,67) 1/6 (16,67) p2,1 > 0,05 p2,1 > 0,05 p2,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 p3,1 > 0,05 Nhóm p p3,1 > 0,05 Chuột chết nhóm vào ngày 25 sau tiêm IL-2 tái tổ hợp, sau số lượng chuột chết tăng dần theo thời gian nhóm lại Số lượng tỷ lệ chuột chết nhóm chứng cao so với hai nhóm điều trị protein IL-12 tái tổ hợp thời điểm ngày 28, 32, 35, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê 69 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 BÀN LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Kết nghiên cứu tác dụng kháng ung thư IL-12 tái tổ hợp mơ hình chuột mang khối UTP cho thấy IL-12 tái tổ hợp có tác dụng kháng ung thư mơ hình chuột mang khối UTP: giảm kích thước khối u, tăng tỷ lệ thoái lui khối u, tăng tỷ lệ sống sót Nguyễn Lĩnh Tồn, Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc Cường Xây dựng mơ hình UTP người, Tạp chí Y - Dược học quân Số chuyên đề KC 10 2012, tr.25-30 IL-12 tham gia vào trình biệt hóa TB T ngun thủy thành TB Th1, kích thích phát triển hoạt động chức TB T IL-12 thúc đẩy TB T trì sản xuất IFN-γ, tăng tiết IFN-γ nội sinh cần thiết cho hiệu ức chế khối u [4, 5] IL-12 có vai trò chống tạo mạch ngăn chặn hình thành mạch máu cảm ứng IFN-γ [5, 6] Tác dụng kháng ung thư IL-12 chứng minh nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng sử dụng mơ hình động vật gây ung thư thực nghiệm Khi tiêm IL-12 trực tiếp vào chuột mang khối u trì hỗn, giảm số trường hợp có tác dụng ức chế hồn tồn khối u phát triển; tăng tỷ lệ sống chuột mang khối ung thư [3, 7, 10] Điều phù hợp với kết nghiên cứu Dietrich A, Stockmar C et al The impact of intraoperative vaccination with IL-12 modified autologous tumor cells in the Lewis lung carcinoma mouse model (abstract) J Cancer Res Clin Oncol 2012, Jun,138 (6), pp.901-906 Kết có ý nghĩa việc nghiên cứu tác dụng điều trị IL-12 tái tổ hợp UTP thực nghiệm KẾT LUẬN IL-12 người tái tổ hợp liều 0,1 0,6 µg/chuột có tác dụng kháng ung thư mơ hình chuột mang khối UTP, làm giảm kích thước khối u, giảm tỷ lệ chuột chết, tăng tốc độ thoái lui khối u 70 Nguyen Thai Bieng et al Establishment of mouse Lewis lung cancer on mouse model Journal of Military Pharmaco-Medicine 2014, 39 (7) Yuzhalin AE, Kutikhin AG Interleukin-12: clinical usage and molecular markers of cancer susceptibility Growth Factors 2012, 30, pp.176-191 Sangro B et al Gene therapy of cancer based on interleukin 12 Curr Gene Ther 2005, 5, pp.573-581 Tamandani DM, Shekari M, Suri V Interleukin-12 gene polymorphism and cervical cancer risk Am J Clin Oncol 2009, 32, pp.524528 Shen F, Li JL et al Interleukin-12 prevents colorectal cancer liver metastases in mice Onco Targets Ther 2013, 13 (6), pp.523-526 Ferlay J, Shin HR, Bray F et al Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 Int J Cancer 2010, 127 (12), pp.2893-2917 Jiang Liu, Michael R Johnston Experimental animal models for studying lung cancers (abstract) Lung Cancer Metastasis 2010, pp.241-265 10 Yin XL, Duan H, Peng ZP, Sun SL, Li SL Treatment of murine Lewis lung cancer with recombinant interleukin-12 Ai Zheng 2006, 25 (9), pp.1087-1091 ... việc nghiên cứu tác dụng điều trị IL-12 tái tổ hợp UTP thực nghiệm KẾT LUẬN IL-12 người tái tổ hợp liều 0,1 0,6 µg /chuột có tác dụng kháng ung thư mơ hình chuột mang khối UTP, làm giảm kích thư c... ung thư IL-12 tái tổ hợp mơ hình chuột mang khối UTP cho thấy IL-12 tái tổ hợp có tác dụng kháng ung thư mơ hình chuột mang khối UTP: giảm kích thư c khối u, tăng tỷ lệ thối lui khối u, tăng tỷ... nhằm: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư IL-12 người tái tổ hợp mơ hình chuột mang khối UTP (protein IL-12 tái tổ hợp sản phẩm đề tài cấp Nhà nước KC04.11/11-15 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU