Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng ung thư của interleukin-12 (IL-12) tái tổ hợp trên mô hình chuột mang ung thư phổi (UTP). Đối tượng và phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis vào dưới da đùi phải 19 chuột nhắt trắng BALB/c, khi khối u phát triển với kích thước khoảng 7 - 10 mm đường kính.
Trang 1NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA
INTERLEUKINE-12 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN
MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI UNG THƯ PHỔI
Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Thái Biềng*; Nguyễn Thị Thịnh**
Lương Cao Đồng***; Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng ung thư của interleukin-12 (IL-12) tái tổ hợp trên mô hình
chuột mang ung thư phổi (UTP) Đối tượng và phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis
vào dưới da đùi phải 19 chuột nhắt trắng BALB/c, khi khối u phát triển với kích thước khoảng
7 - 10 mm đường kính, chia chuột ngẫu nhiên thành 3 nhóm: nhóm chứng không điều trị và
2 nhóm được điều trị với đơn liều protein IL-12 tái tổ hợp (0,1 và 0,6 µg/chuột) Kết quả: 19/19
chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 106TB ung thư với tỷ lệ thành công 100% Sau 5 tuần
theo dõi, tỷ lệ chuột sống của nhóm chuột điều trị protein IL-12 là 10/12 (83,33%), chuột thoái
lui u 9/12 (75%), chuột sống và thoái lui u của nhóm không điều trị 3/7 (42,86%) 2/12 (16,67%)
chuột chết của nhóm điều trị, 4/7 (57,14%) chuột chết của nhóm không điều trị Kết luận: IL-12
tái tổ hợp có tác dụng kháng ung thư trên mô hình chuột mang khối UTP
* Từ khóa: Tế bào ung thư phổi; Chuột Lewis; Chuột nhắt BALB/c; Protein IL-12 tái tổ hợp
Study on Anti-Cancer Effect of Human Recombinant Interleukin-12
Protein in Lung Cancer Mouse Model
Summary
Objectives: To evaluate the anti-cancer effect of human recombinant interleukin-12 (IL-12)
protein in lung cancer mouse model Subjects and methods: Mouse Lewis lung cancer cells
were inoculated subcutaneously in the right thighs of 19 BALB/c mice; when the tumors grew up
to a size of 7 - 10 mm in diameter, mice were randomly divided into 3 groups: control group and
2 experimental groups, which received a single doses of recombinant IL-12 protein, 0.1 và
0.6 µg/mouse, respectively Results: 19/19 mice developed tumors after 1 week inoculation
10 6 tumor cells per mouse, the successful rate reached 100% After 5 weeks of experiment,
number of surviving mice and having tumor regression in IL-12 treated groups were 10/12
(83.33%) and 9/12 (75%), respectively; the number of mice alive with regression tumors in
control group was 3/7 (42.86%) The number of dead mice in recombinant IL-12 protein treated
groups was 2/12 (16.67%); the number of dead mice in control group was 4/7 (57.14%)
Conclusion: recombinant IL-12 protein has anti-cancer effect in mouse model of lung cancer
* Key words: Lung cancer cells; Lewis mouse; BALB/c mouse; Recombinant interleukin-12 protein
* Học viện Quân y
** Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông
*** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com)
Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2015
Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi là loại ung thư biến nhất
trên toàn cầu, số ca mắc mới mỗi năm
tăng trung bình 0,5% Ở Việt Nam, tỷ lệ
bệnh nhân (BN) mắc UTP đang có xu
hướng gia tăng, mỗi năm cả nước có hơn
20.000 BN mới và có tới 17.000 trường
hợp tử vong UTP là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trong số các BN ung thư
[8] Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị
UTP, nhưng hiệu quả chưa cao [9] Theo
báo cáo thống kê ở Mỹ, tỷ lệ UTP sống
được 5 năm chỉ chiếm 15% Ở châu Âu,
tỷ lệ này khoảng 10%, con số này cũng
được ghi nhận ở các quốc gia đang phát
triển là 8,9% [8] Để góp phần nghiên cứu
tác dụng chống UTP và đáp ứng yêu cầu
phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng UTP,
chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm:
Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của
IL-12 người tái tổ hợp trên mô hình chuột
mang khối UTP (protein IL-12 tái tổ hợp
là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước
KC04.11/11-15
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng, vật liệu, chất liệu nghiên
cứu
* Đối tượng, vật liệu nghiên cứu:
- TB UTP chuột Lewis (mã LLc1/LL/2;
ATCC, Hoa Kỳ)
- Chuột nhắt trắng BALB/c 8 - 10 tuần
tuổi, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm (Charles
River Laboratories, Hoa Kỳ)
- Protein tái tổ hợp IL-12 người là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.11/11-15
- Động vật nghiên cứu được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành ghép TB, đảm bảo thức ăn và nước uống theo nhu cầu
* Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu:
- Môi trường nuôi cấy TB ung thư EMEM (eagle's minimal essential medium), FBS (fetal bovine serum) 10%; dung dịch penicillin và streptomycin 1%; trypsin-EDTA (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức)
- Vật tư cần thiết phục vụ cho nuôi cấy TB: chai nuôi, plate 96 giếng, pipet, chai đựng môi trường, lọc vi khuẩn (ATCC, Hoa Kỳ)
- Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ nuôi cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C,
tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng…
2 Phương pháp nghiên cứu
* Kỹ thuật nuôi cấy TB UTP chuột Lewis:
Nuôi cấy TB UTP chuột Lewis trong môi trường EMEM, bổ sung FBS 10%, penicillin và streptomycin 1% TB được nuôi cấy tăng sinh ở điều kiện nhiệt độ
37oC, CO2 5%, thay môi trường 2 lần/tuần Mỗi chai nuôi cấy có diện tích 75 cm2
Khi TB phát triển đạt 80% diện tích chai nuôi, tiến hành cấy chuyển sang chai nuôi cấy mới với tỷ lệ 1:3
Trang 3Thu hoạch TB ung thư nuôi cấy trong
chai nuôi bằng Trypsin EDTA, sau đó ly
tâm để loại bỏ môi trường thu TB Xác
định mật độ TB trong môi trường bằng
cách sử dụng buồng đếm Neubauer và
kính hiển vi quang học Chuẩn nồng độ
TB về 107TB/ml
* Tạo khối UTP chuột trên chuột nhắt
trắng BALB/c:
Dung dịch TB ung thư đã chuẩn bị
được hút vào bơm tiêm 1 ml với số
lượng 107 TB/ml Cố định chuột và tiêm
0,1 ml dưới da đùi phải (106TB/chuột)
Cạo sạch lông chuột vùng đùi phải trong
suốt quá trình thí nghiệm Theo dõi toàn
trạng, cân nặng, sự xuất hiện, tiến triển
và thoái triển của khối u tại vị trí tiêm
(đùi phải) 2 lần/tuần bằng quan sát và
đo kích thước khối u bằng thước chính
xác NSK
Tính thể tích khối u theo công thức:
V = (D x R2) x 0,5
Trong đó:
+ V: thể tích khối u (mm3)
+ D: chiều dài của khối u (mm)
+ R: chiều rộng của khối u (mm)
* Đánh giá tác dụng kháng ung thư của
IL-12 trên mô hình chuột mang khối UTP:
Khi khối u phát triển với kích thước
khoảng 7 - 10 mm đường kính, chia ngẫu
nhiên chuột thành 3 nhóm:
- Nhóm chứng: chuột mang u không
điều trị
- Nhóm IL-12t: chuột mang u được điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp liều 0,1 µg/con, liều duy nhất
- Nhóm IL-12c: chuột mang u được điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp liều 0,6 µg/con, liều duy nhất
Theo dõi, đánh giá sự phát triển, ghi nhận thay đổi trọng lượng, kích thước khối u, tỷ lệ thoái u (khối u không quan sát được bằng mắt thường), thời gian chuột chết ở các nhóm
* Xử lý số liệu: xử lý thống kê sử dụng
phần mềm SPSS 15.0
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Tình trạng toàn thân chuột trong quá trình thí nghiệm
Sau khi tiêm TB UTP chuột Lewis, chuột thí nghiệm vẫn ăn uống, hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt trong, hậu môn khô, không thấy biểu hiện đi lỏng Chuột tăng cân so với trước khi thí nghiệm Nhóm chứng có 4 chuột chết (vào ngày 28, 32, 35 sau khi tiêm TB); nhóm IL-12t có 1 chuột bị chết (vào ngày thứ 35 sau tiêm TB); nhóm IL-12c
có 1 chuột chết (vào ngày 25 sau khi tiêm TB)
Sau 35 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chuột sống ở nhóm điều trị: 10/12 con (83,33%);
ở nhóm không điều trị 3/7 con (42,86%)
Tỷ lệ chuột sống đạt 68,42% chung cho cả nhóm chuột điều trị và không điều trị
Trang 42 Diễn biến trọng lƣợng cơ thể ở chuột nghiên cứu
Bảng 1: Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g)
Ngày
Nhóm
Thông
Nhóm chứng (1)
X ± SD 21,27 ±
3,29
22,99 ± 4,02
25,03 ± 3,63
26,76 ± 4,41
25,82 ± 4,81
21,93 ± 1,50
Nhóm IL -12t (2)
X ± SD 21,45 ±
3,49
23,50 ± 4,19
23,75 ± 4,09
24,87 ± 3,01
26,47 ± 3,95
26,82 ± 2,18
Nhóm IL -12-c (3)
X ± SD 21,78 ±
0,88
22,50 ± 1,57
24,25 ± 1,33
25,73 ± 2,08
24,42 ± 0,36
24,82 ± 0,79
p
p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05
p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05
Sau ghép TB UTP chuột Lewis, trọng lượng cơ thể chuột 3 nhóm đều tăng so với trước thí nghiệm Ở nhóm IL-12c, trọng lượng trung bình của ngày 28 giảm do 01 con
có u to chết Nhóm chứng, từ ngày 28 - 35, 4 chuột chết vì u to nên trọng lượng trung bình của chuột giảm Thời điểm ngày thứ 35, trọng lượng chuột ở nhóm IL-12t và nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05); các thời điểm khác trọng lượng trung bình chuột ở các nhóm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
3 Số lƣợng chuột thoái u tại các thời điểm
Bảng 2: Tỷ lệ chuột thoái u của các nhóm
Ngày
Nhóm
N8
n (%)
N11
n (%)
N15
n (%)
N21
n (%)
N28
n (%)
N35
n (%)
(0)
0/7 (0)
2/7 (28,57)
2/7 (28,57)
2/7 (28,57)
3/7 (42,86)
(0)
1/6 (16,67)
2/6 (33,33)
2/6 (33,33)
3/6 (50)
4/6 (66,67) Nhóm IL-12c (3) 0/6
(0)
0/6 (0)
2/6 (33,33)
3/6 (50)
4/6 (66,67)
5/6 (83,33)
p
p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05
p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05
Chuột bắt đầu thoái u từ ngày 11 sau khi tiêm IL-12 tái tổ hợp Tỷ lệ thoái lui khối u của nhóm chứng có xu hướng chậm hơn so với hai nhóm điều trị bằng IL-12 tái tổ hợp tại các thời điểm nghiên cứu Số lượng chuột thoái u tại nhóm điều trị đều cao hơn nhóm chứng tại các thời điểm từ ngày 11 đến ngày 35 tính từ khi tiêm IL-12 tái tổ hợp, nhưng khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê
Trang 54 Kết quả thể tích trung bình khối u ở chuột nghiên cứu
Ngày
Nhóm
Thông
Nhóm chứng
(1)
X ± SD 587,62 ±
371,34
1059,75 ± 480,11
1789,58 ± 1155,55
1506,07 ± 1086,53
2808,95
± 1187,88
4063,50 ± 2338,34
Nhóm IL-12t
(2)
X ± SD 436,17 ±
145,58
881,25 ± 650,73
1231,73 ± 906,54
1391,31 ± 1184,25
1617,16 ± 302,24
1143,73 ± 903,49
Nhóm IL-12c
(3)
X ± SD 437,58 ±
156,47
1178,80 ± 480,38
1322,77 ± 667,44
857,75 ± 688,22
928,06 ± 1145,02
789,80 ± 1025,91
p
p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 < 0,05
p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 < 0,05 p 3,1 < 0,05
Thể tích trung bình khối u ở cả 3 nhóm chuột tăng dần sau khi ghép TB ung thư vào chuột Thể tích nhóm chuột IL-12c dao động nhẹ từ ngày 11 đến 18 do hiện tượng thoái u Thể tích khối u ở nhóm chứng (chuột mang u không điều trị) lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với thể tích khối u hai nhóm chuột điều trị (tại các thời điểm ngày thứ 15 và 18; p < 0,05)
5 Diễn biến số lƣợng chuột chết tại các thời điểm
Bảng 4: Tỷ lệ chuột chết của các nhóm
Ngày Nhóm
N21
n (%)
N25
n (%)
N28
n (%)
N32
n (%)
N35
n (%)
(0)
0/7 (0)
2/7 (28,57)
3/7 (42,86)
4/7 (57,14)
(0)
0/6 (0)
0/6 (0)
0/6 (0)
1/6 (16,67)
(0)
1/6 (16,67)
1/6 (16,67)
1/6 (16,67)
1/6 (16,67)
p
p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05 p 2,1 > 0,05
p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05 p 3,1 > 0,05
Chuột đầu tiên chết ở nhóm 3 vào ngày 25 sau khi tiêm IL-2 tái tổ hợp, sau đó số lượng chuột chết tăng dần theo thời gian ở 2 nhóm còn lại Số lượng và tỷ lệ chuột chết của nhóm chứng cao hơn so với hai nhóm điều trị bằng protein IL-12 tái tổ hợp tại các thời điểm ngày 28, 32, 35, sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê
Trang 6BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng
ung thư của IL-12 tái tổ hợp trên mô hình
chuột mang khối UTP cho thấy IL-12 tái
tổ hợp có tác dụng kháng ung thư trên
mô hình chuột mang khối UTP: giảm kích
thước khối u, tăng tỷ lệ thoái lui khối u,
tăng tỷ lệ sống sót
IL-12 tham gia vào quá trình biệt hóa
TB T nguyên thủy thành TB Th1, kích
thích sự phát triển và hoạt động chức
năng của TB T IL-12 thúc đẩy TB T duy
trì sản xuất IFN-γ, tăng tiết IFN-γ nội sinh
cần thiết cho hiệu quả ức chế khối u [4,
5] IL-12 còn có vai trò chống tạo mạch và
ngăn chặn sự hình thành mạch máu mới
được cảm ứng bởi IFN-γ [5, 6] Tác dụng
kháng ung thư của IL-12 được chứng
minh trong nhiều nghiên cứu tiền lâm
sàng sử dụng các mô hình động vật gây
ung thư thực nghiệm Khi tiêm IL-12 trực
tiếp vào chuột mang khối u có thể trì
hoãn, giảm trong một số trường hợp có
tác dụng ức chế hoàn toàn khối u phát
triển; tăng tỷ lệ sống của chuột mang khối
ung thư [3, 7, 10] Điều này phù hợp với
kết quả nghiên cứu của chúng tôi
Kết quả này cũng rất có ý nghĩa trong
việc nghiên cứu tác dụng điều trị của IL-12
tái tổ hợp trên UTP thực nghiệm
KẾT LUẬN
IL-12 người tái tổ hợp liều 0,1 và
0,6 µg/chuột có tác dụng kháng ung thư
trên mô hình chuột mang khối UTP, làm
giảm kích thước khối u, giảm tỷ lệ chuột
chết, tăng tốc độ thoái lui khối u
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Lĩnh Toàn, Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc Cường Xây dựng mô hình UTP người,
Tạp chí Y - Dược học quân sự Số chuyên đề
KC 10 2012, tr.25-30
2 Nguyen Thai Bieng et al Establishment
of mouse Lewis lung cancer on mouse model Journal of Military Pharmaco-Medicine 2014,
39 (7)
3 Dietrich A, Stockmar C et al The impact
of intraoperative vaccination with IL-12 modified autologous tumor cells in the Lewis lung carcinoma mouse model (abstract) J Cancer Res Clin Oncol 2012, Jun,138 (6), pp.901-906
4 Yuzhalin AE, Kutikhin AG Interleukin-12:
clinical usage and molecular markers of cancer susceptibility Growth Factors 2012, 30, pp.176-191
5 Sangro B et al Gene therapy of cancer
based on interleukin 12 Curr Gene Ther
2005, 5, pp.573-581
6 Tamandani DM, Shekari M, Suri V
Interleukin-12 gene polymorphism and cervical cancer risk Am J Clin Oncol 2009, 32,
pp.524-528
7 Shen F, Li JL et al Interleukin-12 prevents
colorectal cancer liver metastases in mice Onco Targets Ther 2013, 13 (6), pp.523-526
8 Ferlay J, Shin HR, Bray F et al
Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 Int J Cancer 2010,
127 (12), pp.2893-2917
9 Jiang Liu, Michael R Johnston
Experimental animal models for studying lung cancers (abstract) Lung Cancer Metastasis
2010, pp.241-265
10 Yin XL, Duan H, Peng ZP, Sun SL, Li SL
Treatment of murine Lewis lung cancer with recombinant interleukin-12 Ai Zheng 2006,
25 (9), pp.1087-1091