Bài viết Nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thư đại trực tràng người của Adiporon in vitro trình bày đánh giá tác dụng kháng ung thư đại trực tràng in vitro của AdipoRon, một chất chủ vận thụ thể Adiponectin.
TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGƯỜI CỦA ADIPORON IN VITRO Bùi Lan Anh1,2, Nhâm Thị Phương Linh2 Phạm Quỳnh Chi2, Nguyễn Thị Mai Ly2,3 Ngơ Thu Hằng1, Bùi Khắc Cường1,2 Tóm tắt Tổng quan: Con đường tín hiệu Adiponectin/AMPK thực nhiều chức chuyển hóa lượng chi phối số tín hiệu nội bào có liên quan đến bệnh sinh ung thư Tác động vào đường tín hiệu Adiponectin/AMPK có tiềm hiệu kháng ung thư Mục tiêu: Đánh giá tác dụng kháng ung thư đại trực tràng (UTĐTT) in vitro AdipoRon, chất chủ vận thụ thể Adiponectin Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp thực nghiệm, sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào, MTT qRT-PCR để đánh giá tác dụng AdipoRon lên tăng sinh tế bào ung thư biểu mRNA AMPKα1 AMPKα2 Kết quả: AdipoRon ức chế tế bào HCT116 tăng sinh quan sát kính hiển vi qua thử nghiệm MTT Đồng thời, AdipoRon thúc đẩy tế bào tăng cường biểu mRNA AMPKα2 với liều điều trị 30 µM (p < 0,001) Kết luận: AdipoRon có khả ức chế tế bào UTĐTT người dòng HCT116 tăng sinh thúc đẩy dòng tế bào tăng cường biểu mRNA AMPKα2 in vitro * Từ khoá: Adiponectin; AMPK; Ung thư đại trực tràng; AdipoRon THE ANTICANCER EFFECT OF ADIPORON ON HUMAN COLORECTAL CANCER CELLS IN VITRO Summary Background: Adiponectin/AMPK signaling pathway Adiponectin plays multiple functions on energy metabolism and contributes to several intracellular Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y Trung tâm Nghiên cứu Động vật Thực nghiệm, Học viện Quân y Bộ mơn - Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Qn y 103, Học viện Quân y Người phản hồi: Bùi Khắc Cường (buikhaccuong@gmail.com) Ngày nhận bài: 06/9/2022 Ngày chấp nhận đăng: 28/9/2022 41 http://doi.org/10.56535/jmpm.v47i8.91 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 signaling pathways related to carcinogenesis Targeting Adiponectin/AMPK signaling pathway has potential anticancer effects Objectives: To evaluate the anticancer effect of AdipoRon, an Adiponectin receptor agonist, on colorectal cancer in vitro Materials and methods: The study was conducted by experimental method, using cell culture, MTT, and qRT-PCR methods to evaluate the effect of AdipoRon on cell proliferation and mRNA expression of AMPKα1 and AMPKα2 Results: AdipoRon inhibited HCT116 cell proliferation observed in microscopy and by MTT assay Simultaneously, AdipoRon promoted intracellular expression of AMPKα2 mRNA at a therapeutic dose of 30 µM (p < 0.001) Conclusion: AdipoRon has an ability to inhibit the cell proliferation of human colorectal cancer HCT116 cell line and promote these cells to enhance AMPKα2 mRNA expression in vitro * Keywords: Adiponectin; AMPK; Colorectal cancer; AdipoRon ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Globocan năm 2020, UTĐTT đứng thứ với 1.931.590 (10%) ca mắc đứng thứ giới với 935.173 (9,4%) ca tử vong tổng số loại ung thư Các phương pháp điều trị thông thường tiêu chuẩn cho UTĐTT phẫu thuật, hóa trị xạ trị kết hợp Với tỷ lệ chẩn đoán muộn tái phát cao, hiệu điều trị hạn chế nhiều tác dụng phụ, việc nghiên cứu tìm kiếm phương pháp điều trị thay hiệu cần thiết Hiện nay, phương pháp điều trị nhắm đích cho thấy nhiều tiềm ứng dụng phương pháp nhắm đích PD-1, EGFR [1] Kết nghiên cứu 42 ghi nhận việc điều trị nhắm đích an tồn hiệu số nhóm bệnh UTĐTT định Adiponectin thực nhiều chức trao đổi chất liên quan đến chuyển hóa lượng Các nghiên cứu gần cho thấy, giảm nồng độ Adiponectin huyết tương liên quan đến tăng nguy phát triển ung thư Adiponectin chi phối số đường tín hiệu nội bào AMPK, mTOR, PI3K/Akt, MAPK, STAT3, NF-κB… có liên quan đến bệnh sinh ung thư [2] AMPK coi cảm biến trạng thái lượng tế bào kiểm sốt tăng sinh tế bào Do đó, tác động vào đường tín hiệu Adiponectin/AMPK có tiềm đem TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 lại hiệu kháng ung thư Trong nghiên cứu này, sử dụng AdipoRon loại hoạt chất chủ vận thụ thể Adiponectin phân tử nhỏ, có tác động lên hai thụ thể AdipoR1 AdipoR2 tạo hiệu ứng sinh học tương tự Adiponectin [3] nhằm: Khảo sát tác dụng ức chế ung thư UTĐTT người in vitro ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chất chủ vận Adinopectin: AdipoRon (C27H28N2O3) chế phẩm công ty: Sigma Aldrich Co (Hoa Kỳ) với tên thương mại: SML0989-5MG; Dòng tế bào UTĐTT người: HCT116 (mã ATCC: CCL-247) Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp thực nghiệm Tetrazolium thành sản phẩm có màu Formazan, cịn tế bào sống qua q trình trao đổi chất tích cực chuyển MTT (3-(4,5- Dimethyl thiazol-2-yl)2,5- diphenyl tetrazolium bromide) có màu vàng thành sản phẩm Formazan có màu tím khơng hịa tan nhờ tác dụng enzyme reductase ty thể tế bào Formazan sau hịa tan sản phẩm màu định lượng đo mật độ quang bước sóng gần 570 nm Mật độ quang đo tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống có mặt trong giếng ni cấy Nồng độ AdipoRon thử nghiệm từ 10 - 50 µM thử nghiệm MTT đĩa 96 giếng sau 72 theo công thức nhằm đánh giá đáp ứng điều trị Hai liều điều trị 10 30 µM sử dụng thử nghiệm nghiên cứu * Kỹ thuật nuôi cấy tế bào: Ni cấy tế bào thực với dịng tế bào UTĐTT người: HCT116 Môi trường nuôi cấy tế bào gồm RPMI bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh (Penicillin), tế bào nuôi đĩa nuôi cấy đường kính 10 cm * Thử nghiệm MTT: Trong thử nghiệm MTT, tế bào chết khả chuyển hoá muối * Phương pháp qRT-PCR: Kỹ thuật qRT-PCR sử dụng nguyên lý phản ứng chuỗi tổng hợp DNA để định lượng biểu theo thời gian thực mục tiêu mRNA sau chuyển đổi thành cDNA Tế bào UTĐTT HCT 116 nuôi đĩa cm tủ ấm 37oC, 5% CO2 Sau 24 ni cấy, tiến hành 43 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 điều trị với AdipoRon 10 30 µM Sau 24 điểu trị, tế bào thu hoạch, tách chiết mRNA, tổng hợp cDNA sử dụng phương pháp qRT- PCR để định lượng biểu mRNA AMPKα1, AMPKα2 GAPDH với mồi chu trình nhiệt tương ứng sau: Bảng 1: Danh mục tên trình tự đoạn mồi Tên mồi Trình tự Hu-AMPKα1-F CGGCAAAGTGAAGGTTGGCAAA Hu-AMPKα1-R CAAATAGCTCTCCTCCTGAGAC Hu-AMPKα2-F ATGGGAGGGTGCCACAAAGAAG Hu-AMPKα2-R ACGGGTTGAAGAGATGGAAGCCAG Hu-GAPDH-F TTGGTATCGTGGAAGGACTCA Hu-GAPDH-R TGTCATCATATTTGGCAGGTT Chu trình nhiệt phản ứng qRTPCR: Giai đoạn 1: Hoạt hóa (1 chu kỳ): 950C x 10 phút; Giai đoạn 2: Khuếch đại (45 chu kỳ): 950C x 15 giây, 550C x 30 giây, 720C x 30 giây; Giai đoạn 3: Đường cong nóng chảy (1 chu kỳ, 650C - 950C gia nhiệt 0,50C/5 giây) So sánh kết biểu mRNA AMPKα1 AMPKα2 nhóm tiến hành theo cơng thức Delta Delta Ct sau tính tốn Delta Ct so với nội chứng GAPDH nhóm Xử lý số liệu: Bằng phần mềm GraphPad Prism 8.4.3 Dữ liệu kiểm tra phép thử ANOVA chiều, hai chiều với kiểm định posthoc 44 Tukey thực với số liệu có so sánh cặp nhóm thử nghiệm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tăng sinh tế bào HCT116 Trong q trình ni cấy, tế bào UTĐTT HCT116 nuôi cấy môi trường RPMI (bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh) đĩa tế bào trì tủ ấm nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Kiểm tra quan sát đĩa tế bào ngày Kết hình cho thấy tế bào HCT116 tăng sinh tốt điều kiện ni cấy TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 a b c d Hình 1: Tế bào HCT116 phát triển bám đáy đĩa nuôi cấy (a): Tế bào vật kính 10X; (b): Tế bào vật kính 20X; (c): Tế bào vật kính 40X; (d): Tế bào vật kính 63X AdipoRon ức chế tăng sinh tế bào HCT116 qua thử nghiệm MTT a b d e c f Hình 2: Sự thay đổi hình thái mật độ tế bào HCT116 nhóm chứng nhóm điều trị AdipoRon sau 72 (dưới vật kính 10X) Hình ảnh tế bào (a) Nhóm chứng; Hình ảnh tế bào điều trị AdipoRon nồng độ: (b)10µM; (c) 20µM; (d) 30µM; (e) 40µM; (f)50µM 45 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ - 2022 Bảng 2: Đáp ứng liều AdipoRon thử nghiệm MTT nhóm điều trị thời điểm 72 Tỷ lệ tế bào sống Đáp ứng liều AdipoRon ( ± SD%) Nhóm chứng 100,00 ± 5,47 Nhóm AdipoRon 10 µM 74,73 ± 4,13 Nhóm AdipoRon 20 µM 59,78 ± 4,46 Nhóm AdipoRon 30 µM 46,66 ± 1,83 Nhóm AdipoRon 40 µM 39,11 ± 2,71 Nhóm AdipoRon 50 µM 31,94 ± 2,90 Giá trị p so sánh với Nhóm chứng < 0,0001 Kết cho thấy AdipoRon ức chế tế bào HCT116 tăng sinh hình ảnh quan sát kính hiển vi qua thử nghiệm MTT; Tỷ lệ tế bào sống giảm dần nồng độ điều trị AdipoRon tăng dần Hai nồng độ AdipoRon 10 µM 30 µM lựa chọn để sử dụng cho thử nghiệm * Kết tỷ lệ tế bào HCT116 sống sót sau điều trị với AdipoRon thời điểm 24 giờ, 48 72 giờ: Sau tế bào HCT116 điều trị AdipoRon, tiến hành thử nghiệm MTT thời điểm 24 giờ, 48 72 Mật độ quang đo tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót có mặt trong giếng ni cấy, từ thấy khả ức chế tăng sinh tế bào HCT116 AdipoRon 46 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 Bảng 3: Kết tỷ lệ tế bào HCT116 sống sót nhóm nghiên cứu thử nghiệm MTT sau 24 điều trị Tỷ lệ tế bào sống sau 24 Tỷ lệ tế bào sống sau 48 Tỷ lệ tế bào sống sau 72 ( ± SD%) ( ± SD%) ( ± SD%) Nhóm chứng (1) 100,00 ± 4,95 100,00 ± 17,32 100,00 ± 4,32 Nhóm AdipoRon 10 µM (2) 94,57 ± 8,22 85,76 ± 17,72 78,60 ± 5,00 Nhóm AdipoRon 30 µM (3) 54,16 ± 3,49 60,76 ± 11,66 54,40 ± 5,00 p1-2 = 0,0094 p1-2 = 0,0002 p1-2 < 0,0001 p1-3 < 0,0001 p1-3 < 0,0001 p1-3 < 0,0001 p2-3 < 0,0001 p2-3 < 0,0001 p2-3 < 0,0001 Đáp ứng liều AdipoRon p Tỷ lệ tế bào sống nhóm điều trị AdipoRon giảm dần theo nồng độ AdipoRon, khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm điều trị AdipoRon 10 µM 30 µM so với nhóm chứng hai nhóm điều trị với Đồng thời, nhóm điều trị AdipoRon 10 µM cho thấy xu hướng Tỷ lệ tế bào sống sót giảm dần theo thời gian điều trị (Bảng 3) 10 µM 30 10 Co nt ro µM l Tương quan biểu mRNA Tương quan biểu mRNA AMPKα2 Hình 3: Kết biểu mRNA tế bào HCT116 sau điều trị với AdipoRon Sau 24 điều trị với AdipoRon cho thấy xu hướng tăng cường biểu mRNA AMPKα1 AMPKα2 tế bào HCT116 Tuy nhiên, khác biệt có ý nghĩa thống kê biểu mRNA AMPKα2 nhóm điều trị 30 µM so với nhóm chứng (p < 0,0001) 47 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 BÀN LUẬN Các nghiên cứu tiền lâm sàng xác định Adiponectin Adipokine chống ung thư tiềm Do đó, tác động vào đường tín hiệu Adiponectin đề xuất phương pháp tiếp cận dược lý tiềm phòng ngừa điều trị ung thư Tuy nhiên, hạn chế nội adiponectin khối lượng phân tử lớn, thời gian bán hủy độ ổn định ngắn cản trở ứng dụng lâm sàng Cho nên chất chủ vận thụ thể Adiponectin nghiên cứu nhằm khắc phục hạn chế sử dụng Adiponectin đảm bảo đầy đủ đặc tính dược lý giống Adiponectin Một số nghiên cứu gần cho thấy đặc tính chống ung thư mơ hình ung thư tiền lâm sàng khác AdipoRon, chất chủ vận thụ thể Adiponectin, nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng AdipoRon UTĐTT A Young Kim CS (2020) nghiên cứu Adiponectin ảnh hưởng đến tăng trưởng tế bào ung thư đại tràng Adiponectin làm giảm tăng sinh tế bào HCT116 có phụ thuộc vào liều lượng điều trị không ức chế phát triển tế bào HEK293 RPE1 Sự biểu mức Adiponectin làm giảm tăng sinh tế bào ung thư đại tràng [4] 48 Nghiên cứu Huang M CS (2018) cho thấy khả Adiponectin ức chế tăng sinh gây apoptosis tế bào HCT116 UTĐTT [5] Kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu chế hoạt động AdipoRon - chất chủ vận thụ thể Adiponectin tế bào UTĐTT HCT116 AMPK (5′-AMP-Activated Protein Kinase) cảm biến trạng thái lượng tế bào biểu hầu hết tế bào nhân thực, bao gồm nguyên sinh vật, nấm, thực vật động vật AMPK có vai trị việc điều hịa chuyển hóa lipid protein tế bào để đáp ứng với kích thích luyện tập thể lực, thay đổi nguồn cung cấp lượng, hormone leptin Adiponectin có nguồn gốc từ tế bào mỡ Do đó, hoạt hóa AMPK dẫn đến bắt giữ chu trình tế bào ức chế phát triển khối u, AMPK đóng vai trị quan trọng việc ngăn ngừa ung thư [6] Nghiên cứu A Young Kim CS (2010) kiểm tra mức độ phosphoryl hóa AMPK tế bào HCT116 điều trị, cho thấy Adiponectin làm tăng pAMPK tế bào HCT116 Nghiên cứu WANG Shu-Juan CS (2020) thông báo AdipoRon ức chế tăng sinh TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2022 dòng tế bào u tủy tăng cường mức độ biểu p-AMPK tế bào Một số nghiên cứu gần ghi nhận đặc tính chống ung thư AdipoRon mơ hình ung thư tiền lâm sàng khác nhau, đặc biệt ung thư biểu mô tuyến ống tụy, ung thư vú, ung thư buồng trứng u tủy [7] KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy AdipoRon có khả ức chế tế bào UTĐTT người dịng HCT116 tăng sinh thúc đẩy dòng tế bào tăng cường biểu mRNA AMPKα2 in vitro * Tài trợ: “Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 108.02-2019.324" TÀI LIỆU THAM KHẢO Cercek, A., et al PD-1 blockade in mismatch repair-deficient, locally advanced Rectal Cancer, 2022; 386(25):2363-2376 Li, G., et al Mechanisms underlying the anti-proliferative actions of Adiponectin in human breast cancer cells, MCF7-dependency on the cAMP/protein kinase-A pathway Nutr Cancer, 2011; 63(1):80-8 Okada-Iwabu, M., et al A smallmolecule AdipoR agonist for type diabetes and short life in obesity Nature, 2013; 503(7477):493-9 Kim, K.Y., et al Adiponectinactivated AMPK stimulates dephosphorylation of AKT through protein phosphatase 2A activation Cancer Res; 2009; 69(9):4018-26 Huang, M., et al Adiponectin inhibits proliferation and induces apoptosis in colorectal cancer HCT116 cells Xi bao yu fen zi mian yi xue za zhi = Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology; 2018; 34(3):253-259 Wang, Z., et al., AMPK and Cancer in AMP-activated Protein Kinase, M.D Cordero and B Viollet, Editors 2016, Springer International Publishing: Cham p 203-226 Ramzan, A.A., et al Adiponectin receptor agonist AdipoRon induces apoptotic cell death and suppresses proliferation in human ovarian cancer cells Mol Cell Biochem; 2019; 461(12):37-46 49 ... triển tế bào HEK293 RPE1 Sự biểu mức Adiponectin làm giảm tăng sinh tế bào ung thư đại tràng [4] 48 Nghiên cứu Huang M CS (2018) cho thấy khả Adiponectin ức chế tăng sinh gây apoptosis tế bào HCT116... cứu * Kỹ thuật nuôi cấy tế bào: Nuôi cấy tế bào thực với dịng tế bào UTĐTT người: HCT116 Mơi trường nuôi cấy tế bào gồm RPMI bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh (Penicillin), tế bào nuôi đĩa ni cấy đường... Adiponectin Một số nghiên cứu gần cho thấy đặc tính chống ung thư mơ hình ung thư tiền lâm sàng khác AdipoRon, chất chủ vận thụ thể Adiponectin, nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng AdipoRon