Bài viết này nghiên cứu với mục đích nhằm đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người.
TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA VIRUT VẮC XIN SỞI VÀ QUAI BỊ DÙNG PHỐI HỢP TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGƢỜI Lê Duy Cương*; Hồ Anh Sơn*; Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Lĩnh Tồn* TĨM TẮT Mục tiêu: đánh giá hiệu kháng ung thư virut vắc xin sởi quai bị dùng phối hợp chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người Đối tượng phương pháp: virut vắc xin sởi quai bị (MeV MuV) tách dòng từ vắc xin Priorix (Hãng GlaxoSmithKline, Anh) Chuột nude (Hãng Charles River, Mỹ) - tuần tuổi, chia thành 6-7 nhóm (10 con/nhóm) ghép u tế bào HT29 (10 tế bào/con) da đùi, khối u có kích thước khoảng 20 - 40 mm (sau - 10 ngày ghép), tiến hành tiêm virut vào khối u với liều 10 CFU/con, lần/tuần, tuần, nhóm chứng tiêm PBS Kết kết luận: khối u nhóm tiêm virut phát triển chậm thời gian sống dài có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng; nhóm tiêm phối hợp virut có kích thước u phát triển chậm thời gian sống dài có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm tiêm đơn virut Như vậy, phối hợp vắc xin MeV MuV kháng u tế bào HT29 chuột nude tốt so với loại virut * Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Vắc xin virut sởi quai bị; Tác dụng kháng ung thư Assessing Anti-Cancer Efficacy of Measles and Mumps Virus Vaccine Combination on Nude Mice Bearing Human Colorectal Cancer Tumors Summary Objectives: Evaluation of the anti-cancer effects of measles and mumps virus vaccine combination on nude mice bearing human colorectal cancer tumor Materials and methods: Measles and mumps virus vaccine (MeV and MuV) were separated from Priorix vaccine (GlaxoSmithKline, UK) Nude mice (Charles River, USA), - weeks old, were divided into 6-7 groups (10 mice/group) Nude mice were injected subcutaneously at thighs with 10 HT29 cells, when the tumor was about 20 - 40 mm (posttreatment - 10 days) carry out to inject MeV and MuV into the tumor with a dose of 10 CFU/mice, twice weekly for weeks, the control group was injected by PBS Results and conclusions: The tumor size grew slowly and survival time of the virus-treated groups was significantly long (p < 0.05) versus that of the control group The tumor size grew slowly and survival time of the virus-treated combination group was significantly long (p < 0.05) versus that of viral-treated single groups Thus, MeV and MuV combination virotherapy treated colorectal tumor on nude mice was better than virus-treated single therapy *Keywords: Colorectal cancer; Measles and mumps virus vaccine; Anti-cancer effect * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 03/01/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/02/2018 Ngày báo đăng: 02/03/2018 38 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng gánh nặng lớn cho sức khỏe cộng đồng Trên giới, loại ung thư phổ biến thứ ba nam giới thứ hai nữ Ở nước phương Tây, hàng năm khoảng 917.000 trường hợp mắc UTĐTT, nguyên nhân đứng hàng thứ hai gây tử vong ung thư [1] Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị UTĐTT, bao gồm phương pháp điều trị đích sản phẩm thuốc có hoạt tính sinh học kháng thể đặc hiệu kháng nguyên… Virotherapy Oncolytic (OV) phương thức điều trị ung thư mới, phương pháp biến nhân lên virut thành vũ khí tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào lành Có 11 loại virut, bao gồm: adenovirus, vaccinia virut, coxsackievirut, reovirus, virut sởi (MeV), virut quai bị (MuV)… nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiều loại ung thư khác Hiện nay, virut Herpes simplex biến đổi gen IMLYGIC™ (T-VEC/Talimogene Laherparepvec) phê chuẩn điều trị bệnh nhân (BN) bị ung thư hắc sắc tố tái phát sau điều trị phẫu thuật Mỹ nước liên minh châu Âu [2] Virut vắc xin sởi quai bị (MeV MuV) thuộc gia đình Paramyxoviridae có tiềm ly giải tế bào u cao Chúng có nhiều đặc điểm tự nhiên thích hợp để phát triển thành tác nhân điều trị ung thư như: tính ổn định gen cao, độ an toàn cao người [2], kết hợp với tiềm biến đổi gen tạo MeV MuV tái tổ hợp có thuộc tính trị liệu ung thư tốt Lợi ly giải tế bào u lớn MeV MuV khả hình thành hợp bào, hợp tế bào bị nhiễm virut với tế bào lân cận không nhiễm virut, chế tạo cho chúng lây lan mà khơng cần giải phóng hạt virut trưởng thành tế bào Sự hợp tế bào hình thành hợp bào (50 - 100 tế bào) tương quan với tiềm ly giải tế bào u chúng Sự hình thành hợp bào góp phần vào hiệu virut gây ly giải tế bào u, làm cho virut nhân lên hạn chế tiếp xúc với kháng thể trung hòa máu vật chủ Hợp bào tiết lượng lớn “syncytiosome”, túi giống exosome biểu kháng nguyên khối u (TAA) cao qua phân tử MHC Ngoài ra, tế bào DC trình diện chéo TAA tăng cường mạnh glycoprotein hợp màng MeV MuV Một lợi MuV MeV protein HN N hoạt động sialidase, có khả loại bỏ dư lượng axít sialic từ bề mặt tế bào khối u làm giảm tăng trưởng tế bào ác tính, kích hoạt tế bào NK tiết IFN-γ [4] Tuy nhiên, đến chưa có nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu phối hợp vắc xin MeV MuV điều trị UTĐTT người Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài nhằm: Đánh giá hiệu phối hợp virut vắc xin sởi quai bị kháng khối u tế bào dòng UTĐTT người (HT29) chuột nude ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Tế bào Vero HT29: ni cấy phòng thí nghiệm với môi trường nuôi cấy DMEM hay RPMI (thêm 10% foetal bovine serum, 1% glutamine 1% kháng sinh), trì tế bào tủ ấm 370C, 5% CO2 39 TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 104 tế bào/200 l/giếng, trì tế bào đĩa 96 giếng tủ ấm 370C, 5% CO2 - Vắc xin MeV MuV sống, giảm độc lực: phân lập, tăng sinh MeV MuV nguồn gốc từ vắc xin priorix (Hãng GlaxoSmithKline, Anh), thực Trường Đại học Quốc gia Singapore Sau 24 giờ, kiểm tra kính hiển vi thấy tế bào Vero bám đáy tốt Tiến hành nhiễm virut vào giếng theo hàng A, B, C, D, E, F, I, tương ứng với nồng độ 10-2 đến 10-8 stock virut, cột 11 12 nhóm chứng (khơng nhiễm) Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virut giếng đĩa 96 giếng hàng ngày kính hiển vi Đến ngày thứ nhiễm virut, giếng có hình ảnh nhiễm virut rõ, tiến hành nhuộm xanh methylen tính TCID50 theo cơng thức: - Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice): chuột nude - tuần tuổi (Hãng Charles River, Mỹ) nuôi phòng Phƣơng pháp nghiên cứu * Chuẩn độ virut (TCID50): - Nhiễm virut tế bào Vero đĩa 96 giếng: gieo tế bào Vero vào giếng đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào I: Tính khoảng tỷ lệ (PD): (% CPE nồng độ pha lỗng có % CPE > 50%) - (50%) (% CPE nồng độ pha lỗng có % CPE > 50%) - (% CPE nồng độ pha lỗng có % CPE < 50%) II: Tính (-Log) nồng độ pha lỗng có % CPE > 50% (10-3 3) TCID50/ml = 10I+II/ml (CPE: giếng có tế bào nhiễm virut) Đổi chuẩn độ TCID50 sang CFU: CFU/ml = 0,7 x TCID50/ml * Tạo khối u chuột nude điều trị: Tiêm tế bào HT29 (107 tế bào/chuột) vào da đùi chuột nude Sau - 10 ngày tiêm tế bào u, kích thước khối u đạt khoảng 20 - 30 mm3, chuột có khối u chia ngẫu nhiên thành nhóm (10 con/1 nhóm), nhóm điều trị tiêm virut nội u MeV + MuV, MuV MeV, nhóm chứng tiêm dung dịch PBS Liều điều trị 107 CFU/con, lần/tuần, tuần Dùng thước kẹp đo khối u (2 lần/tuần) Thực bước thí nghiệm chuột tuân theo hướng dẫn sử dụng chăm sóc động vật thí nghiệm Cơng thức tính thể tích khối u: Chiều rộng2 (mm) x chiều dài (mm) Thể tích khối u (mm ) = Tiêm tế bào HT29 vào đùi chuột gây u Đo kích thước khối u đùi chuột Hình 1: Ghép u da đùi chuột đo kích thước u 40 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 * Phương pháp phân tích kết quả: Dùng thuật tốn thống kê, sử dụng phần mềm STATVIEW SPSS KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kích thƣớc u C o n tro l Thểthước tích khối u Kích u M uV (mm ) M eV 10000 M uV +M eV P 0,05) Thời gian sống chuột nude Thời giansống sốngtrung trungbình bình (ngày) Thời gian 60 MuV+MeV MuV MeV Control 40 20 p 0,05) BÀN LUẬN Với tiến công nghệ sinh học hiểu biết virut ly giải tế bào ung thư thúc đẩy nhà nghiên cứu khám phá nhiều lồi virut kháng ung thư có hiệu Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu phối hợp vắc xin virut MeV MuV ly giải tế bào UTĐTT người HT29 in vivo, ghép u tế bào HT29 khu trú da đùi chuột nude, phù hợp cho liệu pháp điều trị tiêm virut nội u, gia tăng khả virut tiếp xúc xâm nhập vào khối u Số lượng thụ cảm thể chứng minh yếu tố quan trọng định đến tính lây nhiễm hay hiệu lan truyền virut vào tế bào u đích [5] Sử dụng nhiều loại tế bào biểu từ thấp đến cao mức thụ thể CD46, xác định khả lây nhiễm virut sởi tăng lên theo số lượng thụ cảm thể Hợp bào mức 42 thụ cảm thể biểu thấp đòi hỏi mức tới hạn thụ cảm thể CD46 để tạo hợp bào lớn hơn, gây tổn thương phá hủy tế bào đáng kể [5] Chúng ta biết thụ cảm thể CD46, Nectin-4 virut sởi thụ cảm thể MuV-JL virut quai bị Ngồi ra, axít sialic có nhiều tế bào ác tính làm cho chúng lây nhiễm tế bào ung thư có tính chọn lọc cao Tế bào ung thư biểu mức cao CD46, Nectin-4 hay axít sialic nhằm bảo vệ chúng khỏi hoạt động ly giải tế bào qua đường bổ thể [5] Mức độ phong phú thụ cảm thể xác định tính đặc hiệu hiệu lây nhiễm virut vào tế bào u Tính đặc hiệu khối u virut xảy mức nội bào sau virut xâm nhập vào tế bào, virut tận dụng yếu tố khiếm khuyết gen (interferon, kích hoạt Ras, p53, Rb) có tế bào khối u, làm cho chúng có tính chọn lọc tế bào khối u không xảy tế bào bình thường [5] Trong đó, nhiều tài liệu cho thấy virut ly giải tế bào khối u tận dụng khiếm khuyết gen tế bào khối u để khuếch đại gen chúng tăng biểu gen Tuy nhiên, chưa rõ phạm vi mà MeV MuV tận dụng đường khiếm khuyết gen để ly giải tế bào u nào, cần có nhiều nghiên cứu sâu vấn đề Nghiên cứu cho thấy virut MeV MuV có tác dụng làm chậm phát triển khối u tế bào HT29 đùi chuột nude bắt đầu vào ngày thứ ba sau tiêm virut (hình 2) Khả virut lây lan tạo hoạt động kháng u virut nhân lên tế bào đích “bắt kịp” với TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 trình tăng sinh tế bào u, hầu hết khối u điều trị MeV MuV cho thấy giảm khơng phát triển kích thước Kết chúng tơi phù hợp với nghiên cứu khác sử dụng vắc xin virut sởi quai bị sống giảm độc lực điều trị ung thư [6, 7] Bên cạch đó, việc phân chia liều lượng, với liều 107 PFU virut liệu trình điều trị cần thiết để tăng khả ly giải tế bào khối u virut [6, 7] Chúng thấy tiêm nội u tạo lây nhiễm sớm virut vào tế bào khối u lây lan virut có giới hạn khối u làm tăng khả ly giải tế bào khối u Tiêm virut nội u nhiều lần hiệu so với tiêm tổng liều [6, 7] Kết có giá trị định hướng phương pháp phối hợp MeV MuV tiêm nội u điều trị ung thư cho nghiên cứu tương lai ngại độ an toàn sử dụng Chủng Urabe MuV gây biến chứng hệ thần kinh trung ương với tần suất lên đến 1% tiêm chủng vắc xin, tiêm não khỉ sóc gây viêm não viêm màng não [10] Nghiên cứu sử dụng 107 PFU virut vắc xin quai bị sởi để điều trị khối u chuột nude, liều cao gấp 103 lần so với liều thông thường (103-4 PFU) sử dụng để tiêm chủng Chúng ta có nhiều kinh nghiệm sử dụng vắc xin đơn phối hợp chương trình chủng ngừa bệnh sởi, Rubella… với hồ sơ an toàn hai loại vắc xin hàng triệu trẻ em Tuy nhiên, cần có đánh giá tác dụng phụ độc tính virut dùng liều cao điều trị ung thư Điểm bật nghiên cứu việc phối hợp hai vắc xin MeV MuV điều trị khối u tế bào HT29 chuột nude có hiệu MeV MuV sống, giảm độc lực cộng hưởng chế hoạt động kháng ung thư Nhiều nghiên cứu trước chứng minh hoạt tính virut quai bị (chủng Urabe) 290 BN bị khối u ác tính khác BN điều trị với nồng độ lên đến 108-9 PFU virut theo đường tiêm khác (nội u, phúc mạc tiêm tĩnh mạch) [8] Một nghiên cứu khác MuV với kết lâm sàng độc tính, khối u đáp ứng điều trị phần thối lui tồn 37/90 BN [9] cổ trướng 26/37 BN Mặc dù liệu lâm sàng đáng khích lệ, nhà nghiên cứu chưa thực thử nghiệm lâm sàng MuV ly giải tế bào u rộng rãi Có thể lo Kết chúng tơi chứng minh dùng phối hợp virut vắc xin MeV MuV có hiệu kháng khối u tế bào đại tràng HT29 chuột nude Khối u phát triển chậm, thời gian sống chuột mang khối u nhóm tiêm phối hợp virut dài đáng kể so với nhóm tiêm đơn virut KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Mathers C, Boschi-Pinto C Global burden of cancer in the year 2000: Version estimates Geneva: World Health Organization 2006 FDA FDA approves first-of-its-kind product for the treatment of melanoma 2015 Fielding A.K Measles as a potential oncolytic virus Rev Med Virol 2005,15 (2), pp.135-142 43 TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 Cohen M, Elkabets M, Perlmutter M, Porgador A, Voronov E, Apte R.N et al Sialylation of 3methylcholanthrene-induced fibrosarcoma determines antitumor immune responses during immunoediting J Immunol 2010, 185, pp.5869-5878 [PubMed: 20956342] Olga V Matveeva, Zong S Guo, Svetlana A Shabalina, Peter M Chumakov Oncolysis by paramyxovirutes: Multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency Mol Ther Oncolytics 2015 Rae Myers et al Oncolytic activities of approved mumps and measles vaccines for therapy of ovarian cancer Cancer Gene Therapy 2005, 12, pp.593-599 44 Arun Ammayappan, Stephen J Russell, Mark J Federspiel Recombinant mumps virut as a cancer therapeutic agent Molecular Therapy - Oncolytics 2016, 3, p.16019 Shimizu Y, Hasumi K, Okudaira Y et al Immunotherapy of advanced gynecologic cancer patients utilizing mumps virut Cancer Detect Prev 1988, 12, pp.487-495 Asada T Treatment of human cancer with mumps virut Cancer 1974, 34, pp.19071928 10 Saika S, Kidokoro M, Aoki A et al Neurovirulence of mumps virut: Intraspinal inoculation test in marmosets Biologicals 2004, 32, pp.147-152 ... Kết chứng minh dùng phối hợp virut vắc xin MeV MuV có hiệu kháng khối u tế bào đại tràng HT29 chuột nude Khối u phát triển chậm, thời gian sống chuột mang khối u nhóm tiêm phối hợp virut dài đáng... người Do đó, tiến hành đề tài nhằm: Đánh giá hiệu phối hợp virut vắc xin sởi quai bị kháng khối u tế bào dòng UTĐTT người (HT29) chuột nude ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu... u, hầu hết khối u điều trị MeV MuV cho thấy giảm không phát triển kích thư c Kết chúng tơi phù hợp với nghiên cứu khác sử dụng vắc xin virut sởi quai bị sống giảm độc lực điều trị ung thư [6, 7]