Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá đặc điểm hình thái mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối UBTG người. Nghiên cứu là cơ sở cho việc thử nghiệm các liệu pháp chẩn đoán điều trị UBTG.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MƠ U TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN NGƢỜI Nguyễn Văn Ba* CS TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, chúng tơi ghép tế bào (TB) ung thư gan người dòng Hep 3B2 vào d a đùi chuột tạo khối ung thư phát triển chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice” Kết cho thấy chuột hình thành khối u sau tuần ghép 10 TB ung thư Hep 3B Kích thước khối u phát triển đạt kích thước xấp xỉ 600 mm sau tuần ghép TB Phân tích giải phẫu bệnh lý chứng minh khối u tạo thành chuột có hình ảnh TB đa diện, tăng sản, nhân quái, nhân chia, số TB có sắc tố mật * Từ khóa: Tế bào ung thư gan người dòng Hep 3B; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài Study on morphological characteristics of tumor tissue in nude mice bearing human hepatocellular carcinoma Summary In this study, we had implanted human hepatocellular carcinoma Hep 3B2 cells into subcutanous thigh of athymic mice Results showed that mice developed tumor after week of injection Hep 3B cell line with 106 cells/mouse The size of tumors were 600 mm approximately after transplated weeks The tumor histologic analysis indicated that the tumors contained hyperchromasia, nuclear enlargement with atypia and bile pigments inside cytoplasm * Key words: Hep 3B; Nude mice; Xenograft ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư biểu mơ tế bào gan (UBTG) bệnh ác tính thường gặp Trong tổng số bệnh nhân (BN) UBTG, châu Á chiếm 70%, châu Phi chiếm 12%, châu Âu có 9% Bắc Mỹ 2% Khu vực có tỷ lệ mắc UBTG cao châu Á, từ 27,6 36,6 BN/100.000 dân [4] Ở Việt Nam, UBTG đứng hàng thứ loại ung thư (sau ung thư phế quản ung thư dày) Phan Thị Phi Phi CS khám 1.251 BN bị bệnh gan phát 193 BN UBTG (15,4%), sàng lọc 4.677 người quần thể phát BN UBTG [1] Đứng trước thách thức mức độ ác tính, kháng điều trị ung thư gan, ngày người ta phát triển liệu pháp dược chất điều trị Để ứng dụng kỹ thuật, vật liệu điều trị ung thư, cần phải có mơ hình bệnh lý để áp dụng cho thử nghiệm tiền lâm sàng * Häc viƯn Qu©n y Ng-ời phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com) Ngày nhận bài: 27/7/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 5/9/2013 Ngày báo đ-ợc đăng: 26/9/2013 TP CH Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Các mơ hình ung thư trước tạo động vật có nguồn gốc đồng lồi Tuy nhiên, hạn chế mơ hình khối u khơng mang đặc tính sinh học giống khối u người, điều làm hạn chế nghiên cứu chế bệnh lý áp dụng thử nghiệm điều trị cho loại ung thư người Do vậy, yêu cầu cấp thiết cần phải có mơ hình động vật bị ung thư mang đặc tính sinh học ung thư nguyên TB ung thư người Để phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng ung thư gan, tiến hành đề tài nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái mơ u chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối UBTG người Nghiên cứu sở cho việc thử nghiệm liệu pháp chẩn đoán điều trị UBTG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, khơng có TB lympho T (nude mice, Foxn1 nu) nhập từ Công ty CharlesRiver (Hoa Kỳ) - Môi trường nuôi cấy bảo quản TB: môi trường EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), Catalog No.30-2003, ATCC bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh penicillin streptomycine - Dòng TB ung thư biểu mơ gan Hep 3B2 mua từ Công ty ATCC (Hoa Kỳ) Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy ghép TBUT vào chuột: Nuôi cấy UBTG người môi trường EMEM, bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh penicillin streptomycine Mỗi chai ni cấy diện tích 75 cm cấy chứa 106 TB TB nuôi cấy tăng sinh thay môi trường lần/tuần điều kiện nhiệt độ 370C, CO2 5% Khi TB phát triển đạt 75 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang chai Trước ghép, rửa TB lần dung dịch PBS 1X, sau đó, tách dung dịch Trypsin-EDTA 1X Hút dung dịch TBUT chuẩn bị, bơm tiêm ml với số lượng 107/ml Cố định chuột nude tiêm 0,1 ml vào da đùi phải (106 TB/chuột) Quá trình thao tác thực điều kiện vô trùng tuyệt đối * Theo dõi xác định hình thành khối ung thư chuột: - Đánh giá theo dõi phát triển khối u vị trí tiêm (đùi phải) lần/tuần, quan sát, sờ nắn đo kích thước khối u thước xác NSK - Xác định kích thước khối u: đo theo hai kích thước dài x rộng thước xác NSK (Nhật Bản), lần/tuần Xác định kích thước u theo phương pháp Yamaura CS [5] - Theo dõi trọng lượng chuột lần/tuần, xác định biến đổi trọng lượng chuột lần cân * Xác định hình thái vi thể khối ung thư chuột: - Sau tuần tiến hành giết chuột, bóc tách khối u, bảo quản dung dịch formalin 10% 24 - 48 Tiếp theo, khối u đúc khối paraffin, cắt lát dày µm, nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) đọc phân tích kết mơ ung thư hình thành kính hiển vi quang học Phân tích đặc điểm hình thái học TB, cấu trúc mơ hình thành, mạch máu, xâm lấn… Kỹ thuật tiến hành Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh viện 103 * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm SPSS15.0 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết nuôi cấy, tăng sinh tế bào ung thƣ gan Tế bào ung thư gan người lựa chọn dòng Hep 3B2 công ty ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp Đây dòng TB ung thư chuẩn quốc tế nhiều nhà nghiên cứu giới áp dụng thử nghiệm in vitro in vivo TB ung thư gan Hep 3B2 TB biểu mơ, có tính bám dính tốt, có khả tăng sinh nhanh Để chủ động thời gian nuôi cấy phục vụ cho thử nghiệm in vitro sau ghép TB lên chuột nude, tiến hành quan sát tốc độ tăng sinh dòng TB Tế bào ung thư gan người nuôi cấy, tăng sinh chai 75 cm Sau 24 gieo TB, TB bắt đầu tăng sinh Với số lượng TB gieo ban đầu khoảng 0,3 - 0,4 x 106/chai, diện tích che phủ chai đạt khoảng 25 - 30% Tốc độ tăng sinh TB cao khoảng - ngày sau gieo Sau ngày, diện tích che phủ chai ni lên tới 65 - 70% Sau thời điểm này, tốc độ tăng sinh TB chậm lại đạt 80% diện tích chai ni sau - ngày Theo khuyến cáo nhà cung cấp, lúc thời điểm thu hoạch TB để tiến hành thử nghiệm lưu giữ Số lượng TB chai ni đạt trung bình 106 TB Theo dõi xác định hình thành khối ung thƣ chuột Kết 10 ngày sau ghép TB có 10/10 chuột (100%) hình thành khối u, kích thước khối u đạt 38,4 ± 7,2 mm Sau tuần, khối u phát triển đạt kích thước trung bình 585,9 ± 114,9 mm Bảng 1: Kích thước khối ung thư gan đùi chuột Hình 1: TB ung thư gan gieo vào mơi trường Hình 2: Hình ảnh TB ung thư gan người Hep 3B2 phủ ~70% diện tích chai ni sau ngày ni cấy Ngµy KÝch th-íc khèi sau ghÐp u (mm3, n = 10) t_11 38,4 7,2 t_14 74,1 11,4 t_18 108,5 10,7 t_21 218,4 34,7 t_25 383,9 85,3 t_28 585,9 114,9 SE Dễ dàng nhận thấy, sau khối ung thư xuất vào thời điểm 11 ngày sau ghép, khối phát triển liên tục theo thời gian đến kết thúc thí nghiệm Tốc độ phát triển mạnh khối u đạt kích thước khoảng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ - 2013 200 mm 3, thời điểm 21 ngày sau ghép TB Chỉ vòng tuần, khối u tăng gần gấp lần kích thước Kết nghiên cứu phù hợp với Kubota T (1994) [3] Sau ghép, kiểm tra vị trí tiêm TB ung thư lần/tuần, liên tục kết thúc, tiến hành làm giải phẫu bệnh lý sau ghép TB khoảng tuần Khối ung thư gan người phát triển da đùi chuột có màu tím sẫm, khác biệt với dòng TB ung thư người kích thước Hình 3: Hình ảnh khối u xâm lấn vào khối đùi (HE x100) Qua kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ thành công tạo khối UBTG người chuột thiếu hụt miễn dịch cao, đạt 100% tổng số chuột ghép Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả công bố: tỷ lệ thành công kỹ thuật ghép dị loài từ 85 - 100% [2, 3] Đặc điểm hình thái vi thể mơ u hình thành chuột thiếu hụt miễn dịch Khối u sau bóc tách khỏi đùi chuột, cắt thành mảnh nhỏ, bảo quản -800C, lấy mảnh bảo quản dung dịch formalin 10% 24 - 48 Sau đó, đúc mảnh mơ ung thư khối parafin, cắt lát μm, nhuộm HE để phân tích hình ảnh mơ bệnh học mơ ung thư hình thành chuột Kết nghiên cứu giải phẫu bệnh cho thấy cấu trúc tổ chức sinh thiết gồm TB hình đa diện xếp thành đám ổ, chúng xoang mạch máu Các TB u có bào tương rộng, nhân không đều, tăng sắc, chất nhân thô, có nhiều nhân quái nhân chia bất thường Trong bào tương, số TB u có chứa sắc tố mật U xâm lấn tổ chức vân Đây hình ảnh UBTG biệt hố thấp, xâm lấn vân Hình 4: Hình ảnh TB đa diện xếp thành đám, xoang mạch máu (HE x 200) Hình 5: Hình ảnh TB u có bào tương rộng, nhân khơng đều, tăng sắc, chất nhân thơ, có nhiều nhân quái nhân chia bất thường (HE x 400) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Như xây dựng thành cơng mơ hình UBTG người động vật thiếu hụt miễn dịch, đáp ứng tốt cho đòi hỏi điều kiện thực tế nghiên cứu ung thư Việt Nam Các điều kiện nuôi động vật, TB đáp ứng yêu cầu nghiêm ngặt vô khuẩn, tuân thủ theo hướng dẫn nhà cung cấp, tổ chức FDA (Hoa Kỳ) KẾT LUẬN - Đã ghép thành công TB tạo khối UBTG người chuột thiếu hụt miễn dịch kỹ thuật ghép dị lồi Tế bào UBTG Hep 3B ni cấy, tăng sinh phát triển tốt phòng thí nghiệm Với số lượng TB ghép x 106/con, toàn số chuột nude phát triển khối u vị trí ghép Sau cấy ghép lên chuột nude, TB ung thư gan phát triển thành khối u có kích thước 600 mm sau tuần ghép chuột nude - Hình thái vi thể tiêu nhuộm HE cho thấy mơ u có hình ảnh UBTG biệt hoá thấp Khối u xâm lấn tổ chức vân, có cấu trúc gồm TB hình đa diện xếp thành đám ổ, chúng xoang mạch máu Các TB u có bào tương rộng, nhân khơng đều, tăng sắc, chất nhân thơ, có nhiều nhân quái nhân chia bất thường, bào tương số TB u có chứa sắc tố mật Kết chứng minh khối ung thư gan người phát triển chuột nude TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Thị Phi Phi CS Góp phần nghiên cứu ung thư gan nguyên phát Việt Nam, tần suất HBsAg huyết người lành người bị UBTG Y học Việt Nam 1993, 171, tr.26-30 GG Steel, MJ Peckham Human tumour xenografts: A critical appraisal Br J Cancer 1980, 41, Suppl, IV, pp.133-139 Kubota T Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation J Cell Biochem 1994, 56 (1), pp.4-8 Myron J Tong et al Surveillance for hepatocellular carcinoma in patients with chronic viral hepatitis in the United States of America Journal of Gastroenterology and Hepatology 2001, 16, pp.553-559 Yamaura et al Solitary lung tumors and their spontaneous metastasis in athymic nude mice orthotopically implanted with human nonsmall cell lung cancer Neoplasia 2000, 2, pp.315-324 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ... đi u trị cho loại ung thư người Do vậy, u c u cấp thiết cần phải có mơ hình động vật bị ung thư mang đặc tính sinh học ung thư nguyên TB ung thư người Để phục vụ nghiên c u tiền lâm sàng ung thư. .. toàn số chuột nude phát triển khối u vị trí ghép Sau cấy ghép lên chuột nude, TB ung thư gan phát triển thành khối u có kích thư c 600 mm sau tuần ghép chuột nude - Hình thái vi thể ti u nhuộm HE... phát triển đạt kích thư c trung bình 585,9 ± 114,9 mm Bảng 1: Kích thư c khối ung thư gan đùi chuột Hình 1: TB ung thư gan gieo vào mơi trường Hình 2: Hình ảnh TB ung thư gan người Hep 3B2 phủ