Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi của một số gen mt-tRNA ở một nhóm bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam và dự đoán ảnh hưởng của một số vị trí biến đổi tìm được đến cấu trúc bậc hai của tRNA. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP, giải trình tự ADN để sàng lọc biến đổi và phương pháp mô hình hóa phân tử RNA để dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc hai của chúng.
VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 Original article Novel Alterations of Some Mitochondrial tRNA Genes in Vienamese Colorectal Cancer Patients Pham Thi Bich1, Nguyen Thi Van1, Ta Van To2, Trinh Hong Thai1,* Faculty of Biology, VNU University of Science Department of Anatomical Pathology - Cytopatology, Vietnam National Cancer Hospital Received 14 January 2019 Revised 13 March 2019; Accepted 15 March 2019 Abstract: Some mutations of mt-DNA which encode tRNA (mt-tRNA) were previously reported to be associated with clinical manifestations of neuromuscular disorders syndrome In addition, alterations of the mitochondrial genome have been suggested to contribute to mitochondrial dysfunction and tumorigenesis Alterations in some mt-tRNA genes have also been identified in breast cancer, lung cancer and colorectal cancer However, so far, we have not found any report on mt-tRNA gene alteration in the Vietnamese colorectal cancer patients So that, in this study, we analyzed the alterations of some mt-tRNA genes in a group of Vietnamese colorectal cancer patients and predicted influence of the alterations to secondary structure of tRNA based on bioinformatic tools PCR-RFLP and DNA sequencing methods were used to screening alterations, secondary structure of tRNA was predicted in silico by using a tool of the Vienna RNA Websuite Results: both A12309G and A12310G of tRNALeu were identified together in two out of 98 patients, and both T12150G and C12154G of tRNAHis were indentified in one out of 19 patients All of these alterations were heteroplasmic and have not been reported in cancer patients In particular, the C12154G alteration in the DHR loop led to change of secondary structure of tRNAHis and may affect to function of this tRNA molecule Keywords: mt-tRNA, Vietnamese colorectal cancer, PCR-RFLP, DNA sequencing. * Corresponding author Email address: thaith@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4856 VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 Biến đổi số gen ty thể mã hóa cho tRNA bệnh nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam Phạm Thị Bích1, Nguyễn Thị Vân1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1,* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, Khoa Giải phẫu bệnh -Tế bào, Bệnh viện K, Hà Nội Nhận ngày 14 tháng năm 2019 Chỉnh sửa ngày 13 tháng 03 năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 15 tháng 03 năm 2019 Tóm tắt: Một số đột biến ADN ty thể mã hóa cho phân tử tRNA (mitochondrial tRNA: mt-tRNA) xác định có liên quan đến biểu lâm sàng thường gây hội chứng liên quan đến bệnh thần kinh Bên cạnh đó, thay đổi hệ gen ty thể dẫn đến rối loạn chức ty thể từ lâu giả thiết góp phần vào phát sinh khối u Ở ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng (UTĐTT), biến đổi gen mt-tRNA xác định, nhiên, chúng tơi chưa tìm thấy nghiên cứu đối tượng UTĐTT người Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành sàng lọc biến đổi số gen mt-tRNA nhóm bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam dự đốn ảnh hưởng số vị trí biến đổi tìm đến cấu trúc bậc hai tRNA Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP, giải trình tự ADN để sàng lọc biến đổi phương pháp mơ hình hóa phân tử RNA để dự đoán thay đổi cấu trúc bậc hai chúng Kết xác định thấy 98 bệnh nhân có đồng thời hai biến đổi A12309G A12310G thuộc tRNALeu, 19 bệnh nhân có đồng thời hai biến đổi T12150G C12154G thuộc tRNAHis Các biến đổi nêu dạng dị tế bào chất chưa công bố đối tượng bệnh nhân ung thư Đặc biệt, biến đổi C12154G thuộc vùng DHU tRNAHis dự đoán làm thay đổi cấu trúc bậc hai phân tử ảnh hưởng đến chức phân tử tRNA Từ khóa: Biến đổi gen mt-tRNA, UTĐTT người Việt Nam, PCR-RFLP, giải trình tự ADN Mở đầu rối loạn ADN ty thể xem yếu tố nguy Trong đó, mối liên quan biến đổi gen tRNA với ung thư ngày quan tâm Ở ung thư gan, số dạng biến đổi xác định bao gồm biến đổi T1659C thuộc gen tRNAVal, G5650A thuộc gen tRNAAla, T10463C thuộc gen tRNAArg, A14679G thuộc gen tRNAGlu C15975T thuộc gen tRNAPro ; biến đổi A12308G thuộc gen tRNALeu tìm thấy UTĐTT bệnh ung thư miệng Ngoài ra, biến đổi Hiện nay, t lệ m c tử vong UTĐTT mức cao giới Việt Nam, điều cho thấy bệnh nguy hiểm gánh nặng toàn cầu Trong yếu tố liên quan đến ung thư Tác giả liên hệ Địa email: thaith@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4856 T T.H Thai et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 A7460G thuộc gen tRNASer, G5563A thuộc gen tRNATrp A12172G thuộc gen tRNAHis xác định ung thư phổi Tuy nhiên, việc sàng lọc đột biến mt-tRAN chưa thực UTĐTT người Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu biến đổi tRNA UTĐTT ảnh hưởng số biến đổi tìm đến cấu trúc chức phân tử tRNA cần thiết Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng phương pháp PCR-RFLP, giải trình tự để sàng lọc biến đổi gen mt-tRNA dùng phương pháp mơ hình hóa phân tử RNA in silico để mơ hình hóa phân tử RNA dự đoán thay đổi cấu trúc RNA số vị trí biến đổi xác định Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu mẫu mô bệnh nhân UTĐTT lấy vị trí khối u vị trí lân cận khối u (cách khối u tối thiểu 5cm, diện c t xác định khơng tế bào ung thư) Mẫu nghiên cứu với thông tin bệnh nhân độ tuổi, giới tính, vị trí, kích thước u, độ biệt hóa giai đoạn bệnh Khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, bệnh viện K cung cấp Trong nghiên cứu này, tập trung sàng lọc đột biến A3243G 30 cặp mẫu, đột biến G12300A 68 cặp mẫu, đột biến A12308G 98 cặp mẫu giải trình tự ADN để sàng lọc biến đổi khác gen mã hóa cho số tRNA trên19 mẫu 2.2 Phương pháp Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số từ mẫu mô bệnh nhân UTĐTT tách chiết b ng kit QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) Kit tách chiết đảm bảo việc tách ADN ty thể Các bước tiến hành theo quy trình nhà sản xuất ADN sau tách chiết xác định nồng độ độ b ng máy quang phổ Nano drop 2000c (Thermo, Mỹ) bảo quản -200C Phương pháp PCR-RFLP: Các đoạn gen mt-tRNA chứa vị trí 3243, 12300, 12308 khuếch đại b ng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế b ng phần mềm Primer-BLAST NCBI Trình tự cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu trình bày Bảng Bảng Các cặp mồi dùng phản ứng PCR-RFLP Tên mồi Trình tự mồi F 3243 12300 7375 11718 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’ R 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’ F 5’-CTGACAACAGAGGCTTACGA-3’ R 5’-AACTTCTTGGTCTAGGCACAT-3’ F 5’-ATGAGGAATAGTGTAAGGAGTA-3’ R 5’-ACCTGGAGTGACTATATGGAT-3’ F 5’-AACTTCTTGGTCTAGGCACAT-3’ R Kích thước sản phẩm PCR (bp) Mục đích 218 Nhân đoạn ADN chứa vị trí 3243 346 Nhân đoạn ADN chứa vị trí 12300 12308 1059 Nhân đoạn ADN dùng cho giải trình tự trực tiếp 801 5’-GGCTTACATCCTCATTACTATTCT-3’ Phản ứng PCR gồm thành phần: 6,25 l OneTaq Hot Start 2x Master Mix (Neb, Mỹ); 0,2 M mồi gồm mồi xi mồi ngược, 12,531 ng ADN khn, sau bổ sung H2O đến T.H Thai et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 12,5 l Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm biến tính 940C 30 giây, g n mồi 540C 30 giây kéo dài mạch 680C 30 giây, thực phản ứng PCR với 35 chu kỳ Dựa trình tự sản phẩm PCR nhân theo cặp mồi thiết kế, lựa chọn enzyme giới hạn phù hợp để phát biến đổi b ng RFLP, trình tự nhận biết enzyme dùng nghiên cứu trình bày Bảng 2: Bảng Các enzyme sử dụng nghiên cứu Loại đột biến Loại RE Trình tự nhận biết A3243G G12300A HaeIII 5' GG↓C C 3' A12308G/A12309G ApoI 5’ R↓AATTY 3’ (R: A/G) (Y: C/T) Sản phẩm PCR sản phẩm c t b ng enzyme điện di kiểm tra gel agarose , nhuộm ethidium bromide gen polyacrylamide nhuộm bạc Quan sát chụp ảnh gel b ng hệ thống máy Gel Doc TM XR (Biorad) Giải trình tự ADN: Bên cạnh sử dụng phương pháp PCR-RFLP để xác định đột biến quan tâm, chúng tơi sử dụng phương pháp giải trình tự ADN để sàng lọc đột biến khác gen mt-tRNA Hai cặp mồi ký hiệu 7375 11718 (trình tự Bảng 1) nhân lên đoạn ADN có kích thước 1059 bp 801 bp chứa gen mã hóa cho tRNASer có vị trí: 7446-7514, tRNAAsp: 75187585, tRNALys: 8295-8364 tRNAHis: 1213812206, tRNASer: 12207-12265, tRNALeu: 1226612336 Đoạn ADN giải trình tự thơng qua cơng ty thương mại (cơng ty the 1st BASE) Phần mềm Bioedit dùng để phân tích kết giải trình tự Kết giải trình tự so sánh với trình tự ADN ty thể tham chiếu NCBI mã số NC_012920.1 b ng chương trình BLAST nucleotide NCBI để xác định biến đổi Mơ hình hóa phân tử RNA: Sử dụng chương trình RNAfold Server The Vienna RNA Websuite để dự đốn cấu trúc RNA [7] Kích thước sản phẩm c t (bp) ADN không bị đột ADN đột biến biến 22, 27, 169 22, 27, 72 97 128 218 346 346 135 211 Như vậy, tiến hành sàng lọc biến đổi số vị trí 3243, 12300, 12308 12309 thuộc gen ty thể mã hóa cho tRNALeu mẫu mơ nhóm bệnh nhân UTĐTT Tuy nhiên, tần suất biến đổi thấp Vì vậy, chúng tơi thiết kế hai cặp mồi 7375 11718 để nhân đoạn ADN dài 1059 bp 801 bp tương ứng chứa gen mã hóa cho tRNASer vị trí: 7446-7514, tRNAAsp: 7518-7585, tRNALys: 8295-8364 tRNAHis: 12138-12206, tRNASer: 12207-12265, tRNALeu: 12266-12336, tinh sản phẩm PCR giải trình tự ADN để xác định biến đổi Kết phân tích trình tự đoạn ADN nhân lên b ng cặp mồi 7375 từ 19 mẫu mô ung thư, khơng có mẫu xuất biến đổi vùng mã cho tRNA nghiên cứu (Hình 2A) Trong đó, với đoạn ADN nhân lên từ cặp mồi 11718 xác định thấy hai biến đổi đáng quan tâm vị trí 12150 biến đổi T thành G vị trí 12154 biến đổi C thành G Đặc biệt, biến đổi hai vị dạng dị tế bào chất, xuất mẫu nghiên cứu thuộc gen tRNAHis (Hình 2B) Tra cứu sở liệu ngân hàng gen ty thể Mitomap chúng tơi chưa thấy có cơng bố liên quan đến hai biến đổi T12150G C12154G Vì vậy, biến đổi phát bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam T T.H Thai et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 Sử dụng chương trình RNAfold Server The Vienna RNA Websuite để dự đoán cấu trúc bậc hai phân tử tRNAHis, kết dự đoán cho thấy biến đổi T12150G không dẫn đến thay đổi cấu trúc bậc phân tử tRNAHis (Hình 3B) Trong đó, biến đổi C12154G làm thay đổi cấu trúc bậc hai phân tử (Hình 3C), đặc biệt xảy đồng thời hai biến đổi T12150G C12154G (Hình 3D) Phần mềm cho phép xác định thay đổi lượng tự tối thiểu (minimum free energy - MFE) phân tử tRNA có biến đổi Cụ thể, biến đổi tRNAHis dẫn đến làm tăng lượng tự tối thiểu từ -10,4 kcal/mol (dạng không biến đổi) lên -8,9 kcal/mol (khi có biến đổi C12154G) -9,3 kcal/mol (khi có đồng thời hai biến đổi T12150G C12154G) Sự thay đổi cấu trúc tăng lượng tự tối thiểu tRNA dẫn đến giảm độ bền phân tử nên ảnh hưởng đến chức phân tử tRNA Đột biến gen mt-RNA ngày công nhận nhân tố quan trọng liên quan đến phát sinh số bệnh có ung thư 10 Các đột biến điểm tRNA dẫn đến khiếm khuyết trình phiên mã, dịch mã, rối loạn chức chuỗi hô hấp ty thể từ liên quan đến đặc điểm lâm sàng số bệnh Ở ung thư phổi, Wang cs số biến đổi gen tRNA dẫn đến thay đổi cấu trúc tRNA, làm giảm hiệu nhận biết codon - anticodon q trình mã hóa axit amin, điều dẫn đến lượng ATP sản xuất ngưỡng yêu cầu cho chức tế bào bình thường góp phần phát sinh ung thư Cụ thể, đột biến A12172G làm thay đổi cấu trúc lượng tự tối thiểu tRNAHis xác định có vai trò quan trọng ung thư phổi Trong nghiên cứu sàng lọc thấy biến đổi C12154G T12150G tRNAHis bệnh nhân UTĐTT b ng phương pháp mơ hình hóa cấu trúc bậc hai RNA nhận thấy biến đổi C12154G làm thay đổi cấu trúc bậc hai tăng lượng tự tối thiểu phân tử tRNAHis, đặc biệt có tồn đồng thời hai biến đổi C12154G T12150G (Hình 3C 3D) Trong cấu trúc tRNA, đột biến gây bệnh thường xảy vùng gốc sau đến vùng DHU 12], vậy, biến đổi C12154G thuộc vòng DHU làm thay đổi cấu trúc tRNAHis ảnh hưởng đến chức tRNAHis từ liên quan đến phát sinh UTĐTT Hơn nữa, tế bào, số lượng ADN ty thể dao động từ hàng trăm đến hàng nghìn Các giống (dạng đồng tế bào chất, homoplasmy) hay không giống (dị tế bào chất, heteroplasmy) Đa số đột biến ADN ty thể tồn dạng dị tế bào chất 6, 9, 13, 14 Tương đồng với kết nghiên cứu trên, nghiên xác định thấy biến đổi A12309G, A12310G, T12150G C12154G bệnh nhân UTĐTT tồn trạng thái dị tế bào chất Tuy nhiên, ảnh hưởng biến đổi đến biểu lâm sàng bệnh phụ thuộc vào mức độ dị tế bào chất biến đổi Vì vậy, việc nghiên cứu định lượng mức độ dị tế bào chất biến đổi kể cần thiết nghiên cứu Đặc biệt, bốn biến đổi A12309G, A12310G, T12150G C12154G xác định nghiên cứu biến đổi chưa công bố nghiên cứu trước đối tượng bệnh nhân ung thư Vì vậy, biến đổi gen mt-tRNA đối tượng UTĐTT mà xác định Kết luận B ng kỹ thuật PCR-RFLP giải trình tự ADN, biến đổi A12309G, A12310G thuộc gen tRNALeu, C12154G T12150G thuộc gen tRNAHis xác định mẫu mô UTĐTT với tần suất tương ứng 2,04 (với biến đổi A12309G, A12310G) 5,26 (với biến đổi C12154G T12150G) Cả bốn biến đổi nêu trạng thái dị tế bào chất biến đổi chưa công bố đối T.H Thai et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No … (2019) 1-6 tượng bệnh nhân ung thư Đặc biệt, b ng phương pháp mơ hình hóa phân tử RNA bước đầu nhận thấy biến đổi C12154G thuộc vùng DHU tRNAHis làm thay đổi cấu trúc bậc hai tRNAHis làm tăng lượng tự tối thiểu phân tử, biến đổi ảnh hưởng đến chức tRNAHis từ góp phần vào phát sinh UTĐTT Tuy nhiên, để đánh giá mối liên quan biến đổi nêu với đặc điểm bệnh học UTĐTT mối liên quan mức độ đột biến với mức độ biểu bệnh việc tăng cỡ mẫu nghiên cứu định lượng mức độ dị tế bào chất biến đổi cần thiết Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp nhà nước KC.04.10/1115 Quy trình thủ tục lấy mẫu nghiên cứu giúp đỡ từ bác sỹ, y tá Bệnh viện K - Hà Nội Bệnh nhân tham gia nghiên cứu tự nguyện Tài liệu tham khảo [1] http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx (30/11/2017) [2] M Brandon, P Baldi, D.C Wallace, Mitochodrial mutations in cancer, Oncogen 25(34) (2006) 4647 [3] G Li, YX Duan, XB Zhang, F Wu, Mitochondrial RNA mutations may be infrequent in hepatocellular carcinoma patients, Genet Mol Res15(2) (2016) doi: 10.4238/gmr.15027665 [4] F Mohammed, AR Rezaee, E Mosaieby, M Houshmand, Mitochondrial A12308G alteration in RNA Leu (CUN)) in colorectal cancer samples, Diagn Pathol (2015) doi: 10.1186/s13000-015-03376 [5] S Datta, M Majumder, NK Biswas, N Sikdar, B Roy, Increased risk of oral cancer in relation to common Indian mitochondrial polymorphisms and Autosomal GSTP1 locus, Cancer, 110 (2007) 1999 [6] L Wang , ZJ Chen , YK Zhang , HB Le, The role of mitochondrial RNA mutations in lung cancer, Int J Clin Exp Med 8(8) (2015) 13341 [7] AR Gruber, R Lorenz, SH Bernhart, R Neubock, IL Hofacker The Vienna ARN Websuite, Nucleic Acids Res 36 (2008) 70 [8] https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (11/2017) [9] Y Goto, I Nonaka, S Horai, A mutation in the RNALeu (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies, Nature 348(6302 (1990) 651 [10] http://www.mitomap.org/MITOMAP (11/2017) [11] A Lorenc, J Bryk Golik P, Homoplasmic MELAS A3243G mtDNA mutation in a colon cancer sample, Mitochondrion 3(2) (2003) 119 [12] EL Blakely, J.W Yarham , C.L Alston , K Craig , J Poulton , C Brierley , SM Park , A Dean , JH Xuereb , KN Anderson , A Compston , C Allen , S Sharif , P Enevoldson , M Wilson , SR Hammans , DM Turnbull , R McFarland , RW.Taylor , Pathogenic mitochondrial tRNA point mutations: nine novel mutations affirm their importance as a cause of mitochondrial disease, Hum Mutat 34(9) (2013) 1260 [13] S DiMauro, Mitochondrial ADN medicine, Biosci Rep 27(3) (2007) [14] DC Wallace, D Chalkia, Mitochondrial ADN genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease”, Cold Spring Harb Perspect Biol 5(11) (2013), doi:10.1101/cshperspect a021220 ... (2019) 1-6 Biến đổi số gen ty thể mã hóa cho tRNA bệnh nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam Phạm Thị Bích1, Nguyễn Thị Vân1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1,* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa... phân tử tRNA Từ khóa: Biến đổi gen mt -tRNA, UTĐTT người Việt Nam, PCR-RFLP, giải trình tự ADN Mở đầu rối loạn ADN ty thể xem yếu tố nguy Trong đó, mối liên quan biến đổi gen tRNA với ung thư ngày... quan tâm Ở ung thư gan, số dạng biến đổi xác định bao gồm biến đổi T1659C thuộc gen tRNAVal, G5650A thuộc gen tRNAAla, T10463C thuộc gen tRNAArg, A14679G thuộc gen tRNAGlu C15975T thuộc gen tRNAPro