Biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu đã được thực hiện để sàng lọc các biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở 86 cặp mẫu mô, 9 mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (UTĐTT) và 67 mẫu máu của người khỏe mạnh làm đối chứng. Sử dụng phương pháp giải trình tự ADN khuếch đại từ gen COX-1 ty thể ở 25 mẫu mô UTĐTT, chúng tôi đã phát hiện được 4/17 biến đổi làm thay đổi axit amin, trong đó có biến đổi C6340T.

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 Biến đổi gen COX-1 ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phạm Thị Bích, Lê Thị Quỳnh Thơ, Trịnh Hồng Thái* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Nghiên cứu thực để sàng lọc biến đổi gen COX-1 ty thể 86 cặp mẫu mô, mẫu máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng (UTĐTT) 67 mẫu máu người khỏe mạnh làm đối chứng Sử dụng phương pháp giải trình tự ADN khuếch đại từ gen COX-1 ty thể 25 mẫu mô UTĐTT, phát 4/17 biến đổi làm thay đổi axit amin, có biến đổi C6340T Tiếp đó, biến đổi C6340T phân tích phương pháp PCR-RFLP mẫu nghiên cứu lại Kết hợp hai phương pháp giải trình tự PCR-RFLP xác định biến đổi C6340T dạng đồng tế bào chất dị tế bào chất mô u lân cận u, khơng xác định biến đổi mẫu máu bệnh nhân ung thư máu đối chứng Mức độ biến đổi C6340T mô u bệnh nhân UTĐTT xác định với tỷ lệ cao (từ khoảng 80% trở lên) Biến đổi C6340T dạng đột biến sơma yếu tố có xu hướng làm tăng nguy bệnh người mang biến đổi Nhận ngày 16 tháng 10 năm 2015, Chỉnh sửa ngày 07 tháng 11 năm 2015, Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 12 năm 2016 Từ khóa: Gen COX-1 ty thể, biến đổi C6340T, PCR -RFLP, giải trình tự, ung thư đại trực tràng Mở đầu * biến hệ gen ty thể thường tồn dạng dị tế bào chất (bản bị đột biến dạng không đột biến tồn tế bào) Đa số đột biến gây hại tồn dạng dị tế bào chất [2, 3] Lượng ADN ty thể đột biến tế bào gọi mức độ dị tế bào chất, yếu tố để đánh giá mức độ ảnh hưởng đến bệnh Mối liên quan rối loạn chức ty thể ung thư Warburg đưa vào năm 1930, sau có loạt nghiên cứu khác xác định đột biến ADN ty thể có liên quan đến nhiều loại ung thư khác ung thư vú, buồng trứng, tuyến giáp, dày, đại trực tràng [4] Tùy vào mức độ nghiêm trọng đột biến mà vai trò bệnh ung thư chia thành hai nhóm: (1) đột biến nghiêm trọng làm ức chế trình Ty thể bào quan có mặt tế bào chất hầu hết tế bào nhân chuẩn với số lượng hàng trăm, hàng ngàn tế bào, có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân Vai trò ty thể máy sản xuất lượng cho tế bào, tham gia vào chế chết theo chu trình tế bào q trình lão hóa Khác với hệ gen nhân, hệ gen ty thể khơng có protein histone, chế sửa chữa đơn giản gần nơi phát sinh gốc tự chuỗi hô hấp tế bào nên dễ bị đột biến so với hệ gen nhân Do đó, hệ gen ty thể có tiến hóa nhanh hệ gen nhân khoảng 17 lần [1] Đột _ * Tác giả liên hệ ĐT: 84-4-38582798 Email: thaith@vnu.edu.vn 17 18 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 OXPHOS (oxidative phosphorylation) tăng sản xuất gốc tự thúc đẩy tăng sinh tế bào khối u (2) đột biến nhẹ cho phép khối u thích ứng với môi trường [5] Gen COX-1 ty thể (còn gọi gen COXI, MT-CO1) có kích thước 1552bp từ vị trí base 5904 đến 7455 hệ gen ty thể Gen COX-1 ty thể mã hóa cho protein cytochrome c oxidase I (MTCO1) tiểu phần thuộc phức hệ hơ hấp IV (cytochrome c oxidase) đóng vai trò quan trọng hơ hấp tế bào [6] Protein cytochrome c oxidase I (P00395) có hai vùng vùng xuyên màng vùng nằm chất ty thể Chức protein MTCO1 tham gia vào q trình vận chuyển điện tử hơ hấp tế bào [7] Sự thay đổi cấp độ gen khiến protein MTCO1 bị thay đổi ảnh hưởng đến q trình vận chuyển điện tử chuỗi hơ hấp từ làm ảnh hưởng đến q trình sản xuất lượng cho tế bào, tăng trình phát sinh gốc tự do, ảnh hưởng đến chức thể Đặc biệt số đột biến gen COX-1 ty thể tìm thấy số bệnh người bao gồm bệnh ung thư có UTĐTT [8] Vì vậy, việc điều tra biến đổi gen COX-1 ty thể cần thiết để đánh giá biến đổi gen, đồng thời hỗ trợ hiệu chẩn đoán điều trị bệnh UTĐTT Trên giới, ung thư đại trực tràng loại ung thư phổ biến với tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao Tại Việt Nam, UTĐTT xếp thứ nam giới, xếp thứ nữ giới tỷ lệ mắc tử vong, bệnh có xu hướng trẻ hóa [9] Tuy nhiên, UTĐTT loại ung thư có tiên lượng tốt chẩn đốn điều trị giai đoạn sớm [10] Các biến đổi ADN ty thể bệnh nhân UTĐTT xác định nhiều gen khác gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, vùng Dloop số gen khác [4] Tại Việt nam, nay, chúng tơi chưa thấy có cơng bố biến đổi gen COX-1 ty thể bệnh nhân UTĐTT, nghiên cứu thực để sàng lọc đánh giá mối liên quan biến đổi gen COX-1 ty thể với bệnh UTĐTT Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu 86 cặp mẫu mô (gồm mô u mô lân cận u - lấy cách trung tâm khối u 5-10 cm) 86 bệnh nhân UTĐTT bệnh nhân có cung cấp kèm theo mẫu máu đến điều trị Bệnh viện K Bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ năm 2012 đến 2015 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu ung thư mẫu lấy từ bệnh nhân có kết giải phẫu bệnh sau phẫu thuật ung thư biểu mô tuyến, dạng ung thư nguyên phát (được xác định Khoa giải phẫu bệnh bệnh viện) 67 mẫu máu người khỏe mạnh Viện Huyết học Truyền máu Trung ương cung cấp dùng làm đối chứng 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số Sử dụng kit tách chiết ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) GeneJET Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô mẫu máu Các bước tách chiết tiến hành theo quy trình nhà sản xuất Nồng độ ADN tổng số đo máy quang phổ NanoDrop 2000c (Thermoscientific, Mỹ) bảo quản -200C Thiết kế mồi nhân gen COX-1 Sử dụng chương trình Primer-BLAST thuộc NCBI (Mỹ), trình tự ADN ty thể chuẩn (NC_012920.1) để thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR dùng cho việc sàng lọc biến đổi thuộc gen COX-1 ty thể phương pháp giải trình tự PCR-RFLP Giải trình tự ADN Tồn gen COX-1 ty thể nhân lên với cặp mồi (5851F; 7595R), sản phẩm PCR tinh kit ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix, Mỹ) giải trình tự trực nguyên lý Sanger Trình tự cặp mồi gồm: mồi xuôi 5’- CTT TAG ATT TAC AGT CCA ATG CTT -3’, mồi ngược: 5’CAT GTG CCA TTA AGA TAT ATA GGA T 3’ Thành phần PCR bao gồm: OneTaq Hot Start 2X Master Mix (NEB, Mỹ); 200nM mồi P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 xi mồi ngược; ng/µl ADN khn, sau bổ sung H2O đến 12.5µl Chu trình nhiệt gồm bước: biến tính 940C 30 giây, khuếch đại 35 chu kỳ (940C: 30 giây, 600C: 30 giây, 680C: 130 giây), 680C: phút Kết giải trình tự so sánh với trình tự ADN ty thể chuẩn (NC_012920.1) chương trình BLAST NCBI PCR - RFLP Trình tự cặp mồi (6221F; 6381R) gồm: mồi xi 5’-TCC CTC TCT CCT ACT CCTGTT C -3’, mồi ngược: 5’-CTA AGA TAG AGG AGA CAC CTG CTA -3’ Chu trình nhiệt thành phần phản ứng PCR với cặp mồi (6221F; 6381R) tương tự cặp mồi (5851F; 7595R) thay đổi thời gian kéo dài chuỗi ADN 560C 15 giây Sản phẩm PCR 161bp cắt enzyme BccI với trình tự nhận biết 5’- CCATC(N4)↓ 3’ (Neb, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp 6340C (trường hợp không biến đổi), enzyme BccI có vị trí nhận biết cắt đoạn ADN vị trí tạo thành đoạn có kích thước 128bp, 33bp Trong trường hợp 6340T (có biến đổi), enzyme BccI khơng có vị trí nhận biết đoạn ADN 161bp enzyme khơng cắt, nên kích thước đoạn ADN có biến đổi sau cắt có kích thước kích thước sản phẩm PCR- 161bp Sản phẩm PCR-RFLP điện di kiểm tra gel polyacylamide 10% nhuộm ethidium bromide Định lượng mức độ dị tế bào chất phần mềm Image J Sản phẩm cắt enzyme giới hạn mẫu có biến đổi C6340T dạng dị tế bào chất điện di gel polyacrylamide 10%, chụp ảnh phân tích hình ảnh phần mềm Image J Sử dụng phần mềm ImageJ để đo mật độ điểm ảnh: Sản phẩm sau cắt enzyme trường hợp biến đổi khơng hồn tồn gồm 19 băng: 161bp đại diện cho ADN mang biến đổi ví trí 6340 - có mật độ điểm ảnh b, băng 128bp đại diện cho ADN không mang biến đổi vị trí 6340 - có mật độ điểm ảnh c Như vậy: Tỷ lệ % đột biến = [b/(b+c)]*100 Phân tích thống kê Dùng tỷ số chênh odd ratio (OR) để đánh giá nguy biến đổi C6340T bệnh UTĐTT So sánh nhóm bệnh nhóm đối chứng Kết thảo luận 3.1 Các biến đổi gen COX-1 ty thể Đoạn ADN dài 1745bp chứa toàn gen COX-1 ty thể khuếch đại thành công 25 mẫu mô u 25 bệnh nhân UTĐTT cặp mồi (5851F; 7595R) Sản phẩm PCR sau tinh giải trình tự trực tiếp Sử dụng chương trình BLAST NCBI phần mềm Bioedit để so sánh đọc trình tự ADN Kết PCR, giải trình tự minh họa hình hình Từ hình nhận thấy sản phẩm PCR cho băng rõ nét, không xuất băng phụ, băng lạ Kích thước băng khoảng 1745bp theo tính tốn lý thuyết Giếng đối chứng âm không lên băng Như vậy, với cặp mồi 5851F - 7595R, khuếch đại thành công đoạn ADN chứa toàn gen COX-1 ty thể phục vụ cho việc xác định trình tự gen Trong 25 mẫu giải trình tự, chúng tơi xác định 17 biến đổi, có biến đổi làm thay đổi axit amin (C6340T; T6253T; A7299G; T6455C) (hình 2) 13 biến đổi dạng đồng nghĩa (bảng 1) Một điều đặc biệt số biến đổi đồng nghĩa, biến đổi C7028T biến đổi xuất với tần suất cao (24/25 mẫu) 20 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 Hình Một số vị trí biến đổi gen COX-1 ty thể Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi (5851F, 7595R) (gel agarose 1%) Giếng M: Thang chuẩn 1kb, Giếng 2-7: Sản phẩm PCR mô u tương ứng bệnh nhân: #4120, #8619, #17401, #19563, #37047, #40557, Giếng 7: Đối chứng âm A, B: biến đổi T6253C, C6340T/C (dạng dị tế bào chất) - mẫu #17401, C: biến đổi C6455T- mẫu #17180; D: biến đổi A7299G - mẫu #3753 Bảng Các vị trí biến đổi gen COX-1 ty thể 25 mẫu UTĐTT STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Vị trí biến đổi 6253 6338 6340 6392 6445 6455 6515 6752 6800 6884 6932 6960 6962 7028 7196 7250 7299 Loại biến đổi T>C A>G C>T T>C C>T C>T T>C A>G C>T C>T A>G C>T G>A C>T C>A A>G A>G Thay đổi axit amin M117T L-L T 146I N-N T181M F-F A-A L-L V-V L-L G-G L-L L-L A-A L-L T-T M466V Số lượng mẫu Tần suất Cơng bố có biến đổi (%) MITOMAP + + + 12 + + + + + 12 + 16 + + + 12 + 24 96 + + + + Ghi chú: +: Đã có cơng bố Kết bảng cho thấy phần lớn biến đổi xác định dạng đồng nghĩa (13/17 trường hợp) Các dạng biến đổi hay gặp dạng biến đổi C>T (7/17 trường hợp), tiếp A>G (5/17 trường hợp) 3.2 Tần suất biến đổi C6340T mẫu nghiên cứu Kết đọc trình tự tồn gen COX-1 ty thể 25 bệnh nhân UTĐTT xác định biến đổi C6340T biến đổi làm thay đổi axit amin có liên quan đến bệnh ung thư [8] Vì vậy, chúng tơi tiến hành sàng lọc biến đổi C6340T phương pháp PCR-RFLP 61 cặp mẫu gồm mô u lân cận u 61 bệnh nhân UTĐTT khác, 67 mẫu máu đối chứng, mẫu máu bệnh nhân UTĐTT để xác định tần suất biến đổi đánh giá mối liên quan với bệnh Kết PCR-RFLP minh họa hình P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR cắt enzyme BccI mô u, lân cận u, mẫu máu bệnh nhân UTĐTT (gel polyacrylamide 10%) Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp Giếng (+): Đối chứng dương sản phẩm cắt enzyme (mẫu có biến đổi vị trí 6340 dạng dị tế bào chất khẳng định giải trình tự); cặp giếng (1, 2); (3, 4); (5, 6) sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzyme tương ứng mô lân cận u (dạng dị tế bào chất), mô u (dạng biến đổi hồn tồn) mẫu máu (dạng khơng biến đổi) bệnh nhân #16689, giếng sản phẩm cắt mô u bệnh nhân #17401 dạng dị tế bào 21 chất, giếng (-) đối chứng âm sản phẩm PCR thay H2O phản ứng cắt Kết điện di hình cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 1, 3, 5) có kích tương ứng 161bp, băng rõ, khơng có băng phụ, chứng tỏ cặp mồi (6221F; 6381R) thiết kế đặc hiệu Sản phẩm cắt enzyme bệnh nhân #16689 (giếng 2, 4, 6) cho thấy mô lân cận u xuất biến đổi dạng không đồng nhất, mô u biến đổi hồn tồn, mẫu máu khơng xuất biến đổi Như vậy, biến đổi C6340T xuất mô u, lân cận u không xuất mô máu bệnh nhân Trên sở phân tích chứng tỏ biến đổi C6340T dạng đột biến sôma Để đánh giá nguy biến đổi C6340T bệnh UTĐTT, tần suất dạng biến đổi C6340T tính tốn theo nhóm bệnh nhóm đối chứng Tần suất dạng biến đổi mô bệnh nhân UTĐTT 3.48% có xu hướng cao so với máu đối chứng máu bệnh (0%), nhiên chưa tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0.05) (bảng 2) Bảng Phân bố biến đổi T6340C nguy bệnh UTĐTT Loại mô Mô bệnh nhân UTĐTT, % (n) Máu đối chứng, % (n) Tần suất T6340C 6340T, % (n) 6340C, % (n) 3.48(3) 96.52(83) 0(0) 100(67) OR (CI 95%) P 5.65 (0.28-111.69) 0.25 Ghi chú: n: Số bệnh nhân 3.3 Xác định mức độ dị tế bào chất biến đổi C6340T Để đánh giá mức độ dị tế bào chất, mẫu có biến đổi khơng hồn tồn vị trí 6340 điện di lặp lại giếng thuộc gel, điện di lặp lại lần sau chụp ảnh phân tích định lượng phần mềm phân tích hình ảnh Image J Ở hình 4A điện di sản phẩm cắt enzyme có kèm theo sản phẩm PCR với lượng tương đương Mức độ dị tế bào chất xác định theo công thức nêu phần phương pháp Kết điện di, phân tích hình ảnh minh họa theo hình 4, bảng Từ kết phân tích hình 4, bảng nhận thấy bệnh nhân #17401 có tượng biến đổi khơng hồn tồn mơ u mơ lân cận u Tuy nhiên, mức độ biến đổi mơ u mơ lân cận u có khác biệt lớn Ở mô lân cận u, gel điện di băng 161bp đại diện cho mang đột biến mờ so với băng 128bp đại diện cho không mang đột biến (giếng 2, hình 4A; giếng 1, hình 4B) Tính trung bình, tỷ lệ phần trăm dạng 6340T bệnh nhân #17401 mô lân cận u mô u tương ứng 16.2% 79.8% Ở mô lân cận u bệnh nhân #16689, biến đổi vị trí 6340 khơng hồn tồn với tỷ lệ dạng 6340T 89.7% mơ u bệnh nhân dạng biến đổi hoàn toàn (dạng 6340T chiếm 100%) Trên sở kết phân tích thấy số ADN ty thể dạng 6340T mô u cao so với mô lân cận u 22 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 J Hình Hình ảnh điện di gel polyacrylamid 10 % phân tích định lượng phần mềm Image J bệnh nhânbiến đổi khơng hồn tồn vị trí 6340 A) Kết điện di phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 1: Giếng 1, 4, sản phẩm PCR, giếng (2,3); (5,6); (8,9) sản phẩm cắt mẫu #17401LCU (lân cận u), #17401U (mô U), #16689LCU tương ứng B) Kết điện di phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 2: Giếng 1, 2: mẫu #17401 LCU; giếng 3,4: mẫu #17401U; giếng 5, 6: mẫu #16689LCU Các đỉnh đảo ngược a,b,c,d (thu từ phân tích ImageJ) tương ứng với băng sản phẩm PCR trước cắt (a) sau cắt với enzyme (b, c, d) Bảng Mức độ đột biến C6340T phân tích phần mềm Image J Mã bệnh nhân Số lần lặp lại Diện tích băng Diện tích băng 161bp 128bp Tỷ lệ đột biến (%) 17401 LCU 356.33 1842.37 16.2 17401U 3,831.49 1687.79 79.8 16689LCU 4806.33 548.59 89.7 l Thảo luận Theo liệu thống kê ngân hàng gen ty thể Mitomap, có nhiều biến đổi gen COX-1 ty thể xác định nhiều bệnh ung thư khác ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đại trực tràng [11-16] Có số biến đổi gen COX-1 ty thể gây hậu nghiêm trọng làm thay đổi cấu trúc, chức phân tử protein Trên đối tượng ung thư đại trực tràng (UTĐTT), nghiên cứu Chihara cs (2011) 10 dòng tế bào UTĐTT, phương pháp PCR-RFLP giải trình tự sản phẩm PCR từ 28 cặp mồi thiết kế gối lên tìm nhiều biến đổi có biến đổi gen COX-1 Biến đổi vị trí 6709 gen COX-1 biến đổi khơng đồng nghĩa làm thay đổi nucleotit G thành A, làm thay đổi axit amin G thành E vị trí 269 Biến đổi làm P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 thay đổi cấu trúc xoắn α protein MTCO1 thuộc vùng xuyên màng, ảnh hưởng đến chức phân tử protein Ngồi ra, kết giải trình tự số biến đổi khác gen COX-1 vị trí 5973 - biến đổi G thành A, làm thay đổi axit amin A24T, biến đổi vị trí 6146 khơng làm thay đổi axit amin [14] Cũng đối tượng ung thư đại trực tràng nghiên cứu Greaves cs (2006) tìm thấy đột biến vị trí 6277 làm biến đổi nucleotit từ A thành G gen COX-1 dạng biến đổi không đồng nghĩa dẫn đến thay đổi axit amin G125A Một điều đáng quan tâm axit amin Glycine (G) vị trí 125 có tính bảo thủ cao suốt q trình tiến hóa có khả biến đổi nguyên nhân thiếu hụt cytochrome c oxidase Ngồi ra, biến đổi vị trí 7275 làm biến đổi nucleotit từ T thành C làm thay đổi axit amin từ Serine thành pronine vị trí 458 phân tử protein MTCO1 xác định bệnh nhân khác [17] Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Ấn Độ, nghiên cứu Ghatak cs (2014) xác định tổng số 20 biến đổi gen COX-1 ty thể Những biến đổi dẫn đến thay đổi axit amin có tính chất bảo thủ cao có biến đổi làm thay đổi cấu truc bậc phân tử protein Sự biến đổi không đồng nghĩa xảy gen COX-1 cao so với vùng khác ADN ty thể bệnh nhân ung thư vú người Ấn Độ Mặt khác biến đổi lại sàng lọc mẫu máu đơn giản cho việc lấy mẫu để phân tích Như vậy, biến đổi gen COX-1 trở thành thị sinh học tiềm hỗ trợ cho chẩn đoán bệnh ung thư vú [11] Biến đổi gen COX-1 ty thể xác định bệnh ung thư tuyến tiền liệt Trong nghiên cứu Arnold cs (2013) xác định đột biến sai nghĩa vị trí 6124 gen COX-1 dẫn đến thay đổi nucleotit từ T thành C, biến đổi trạng thái heteroplasmy T6124C gen COX-1 ty thể làm thay đổi axit amin từ Methionine - axit amin không phân cực thành Threonine một axit amin phân cực Mặt khác, Methionine axit amin có 23 tính bảo thủ cao dẫn đến làm suy yếu q trình oxy hóa cytochrome c phức hệ IV Kết nghiên cứu số đột biến gen COX-1 nguyên nhân gây bệnh ung thư [16] Như vậy, theo nghiên cứu công bố số biến đổi gen COX-1 có ảnh hưởng đến biểu số bệnh có bệnh ung thư Vì vậy, sàng lọc biến đổi gen COX-1 ty thể trở thành hướng nghiên cứu tiềm giúp hỗ trợ cho chẩn đốn bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành sàng lọc biến đổi gen COX-1 86 bệnh nhân UTĐTT Kết xác định vị trí biến đổi làm thay đổi axit amin T6253C, C6340T, C6445T, A7229G Cho tới nay, bốn biến đổi điều công bố sở liệu ngân hàng gen ty thể Tuy nhiên, bốn biến đổi chưa công bố đối tượng bệnh nhân UTĐTT, kết nghiên cứu chúng tơi góp phần cung cấp thêm thông tin số biến đổi gen COX-1 ty thể bệnh nhân UTĐTT Việt Nam Trong biến đổi này, có biến đổi làm thay đổi axit amin thuộc chuỗi xoắn α xuyên màng ty thể (biến đổi T6253C, A7299G), hai biến đổi mã hóa cho axit amin thuộc vùng chất ty thể (C6340T, C6445T) [7] Tuy nhiên, vai trò biến đổi chưa nghiên cứu rõ Biến đổi C6340T xác định dạng đột biến sôma tồn dạng biến đổi đồng tế bào chất dị tế bào chất mẫu khác Kết nghiên cứu hồn tồn phù hợp với cơng bố trước phổ biến đột biến sơma ADN ty thể tính khơng đồng đột biến gây bệnh [2, 18] Vai trò đột biến ADN ty thể biểu lâm sàng bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Mức độ dị tế bào chất đột biến, mơ khác có mức độ nhạy cảm khác nhau, mơ não nhạy cảm với khiếm khuyết ADN ty thể tiếp đến tim, mô cơ, thận hệ tiết niệu Tỷ lệ ty thể đột biến phải đạt đến ngưỡng 24 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 gây kiểu hình lâm sàng bệnh Ngưỡng biểu đột biến thay đổi phụ thuộc loại đột biến loại mô [19] Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định mức độ dị tế bào chất biến đổi C6340T ba mẫu xác định mức độ đột biến 16.2%, 79.8% 89.7% nhận thấy, tỷ lệ phần trăm đột biến mô u cao mô lân cận u [4] [5] [6] Kết luận Chúng xác định thấy 17 biến đổi gen COX-1 ty thể bệnh nhân UTĐTT, có biến đổi làm thay đổi axit amin Biến đổi C6340T dạng đột biến sôma yếu tố làm tăng nguy gây bệnh Biến đổi C6340T xác định dạng đồng tế bào chất dị tế bào chất với mức độ đột biến mô u cao (từ khoảng 80% trở lên) [7] [8] [9] [10] [11] Lời cảm ơn [12] Cơng trình hồn thành từ nguồn kinh phí Đề tài QG.15.05 Quy trình thủ tục lấy mẫu giúp đỡ từ bác sỹ, y tá Bệnh viện K, Bệnh viện Việt Đức - Hà Nội Viện Huyết học Truyền máu Trung ương [13] Tài liệu tham khảo [14] [1] N Neckelmann, K Li, R.P Wade, R.Shuster D.C Wallace, cDNA sequence of a human skeletal muscle ADP/ATP translocator: Lack of a leader peptide, divergence from a fibroblast translocator cDNA and coevolution with mitochondrial DNA genes, Proc Natl Acad Sci USA 84(21) (1987) 7580 [2] Y Goto, I Nonaka, S Horai, Mutation in the tRNA(Leu)(UUR) gene associated with the MELASsubgroup of mitochondrial encephalomyo pathies, Nature 348(6302) (1990) 651 [3] J.S Park, L.K Sharma, H Li, R Xiang, D Holstein, J Wu, J Lechleiter, S.L Naylor, J.J Deng, J Lu, Y Bai, A heteroplasmic, not [15] [16] homoplasmic, mitochondrial DNA mutation promotes tumorigenesis via alteration in reactive oxygen species generation and apoptosis, Hum Mol Genet 18(9) (2009) 1578 A Chatterjee, E Mambo, D Sidransky, Mitochondrial DNA mutations in human cancer, Oncogene 25(34) (2006) 4663 M Brandon, P.Baldi, D.C Wallace, Mitochondrial mutations in cancer, Oncogene 25 (2006) 4647 S Anderson, A.T Bankier, B.G Barrell, Sequence and organization of the human mitochondrial genome, Nature 290(5806) (1981) 457 http://www.uniprot.org/uniprot/P00395)(2016) http://www.mitomap.org A human mitochondrial genome database (2016) http://globocan.iarc.fr/Default.aspx (2016) American Cancer Society Colorectal Cancer facts and figures: 2014-2016 S Ghatak, D Lallawmzuali, Lalmawia, R Sapkota, J Zothanpuia, L Pautu, R.B N Muthuku maran, S Kumar, Mitochondrial DLoop and cytochrome oxidase C subunit I polymorphisms among the breast cancer patients of Mizoram, Northeast India Curr Genet 60(3) (2014) 201 J.A Petros, A.K Baumann, E Ruiz-Pesini, M.B Amin, C.Q Sun, J Hall, S Lim, M.M Issa, W.D Flanders, S.H Hosseini, F.F Marshall, D.C Wallace, mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cance, Proc Natl Acad Sci USA 102(3) (2005) 719 I Namslauer, P Brzezinski, Mitochondrial DNA mutation linked to colon cancer results in proton leaks in cytochrome c oxidase, Proc Natl Acad Sci USA 106(9) (2009) 3402 N Chihara, T Amo, A Tokunaga, R Yuzuriha, A.M Wolf, S Asoh, H Suzuki, E.U Chida, S Ohta, Mitochondrial DNA alterations in colorectal cancer cell lines, J Nippon Med Sch 78(1) (2011); 13 B.G Heerd, H.K.Halsey, L.H Augenlicht, Expres sion of mitochondrial cytochrome c oxidase In human colonic cell differentia on, transformation, and risk for colonic cancer, Cancer Res 50(5) (1990) 1596 R.S Arnold, Q Sun, C.Q Sun, An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene C OI in patients with prostate cancer altersreactive oxygen, reactive nitrogen and pro lifer ation, Biomed Res Int 2013: 239257, doi: 10.1155/2013/239257 P.T Bích nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 17-25 [17] L.C Greaves, S.L Preston, J Tadous Mitochondri al DNA mutations are established in human colonic stem cells and mutated clones expand bycrypt fission, Proc Natl Acad Sci USA 103(3): (2006) 714 [18] V.W Liu, H.H Shi, A.N Cheung, High incidence of somatic mitochondrial DNA 25 mutations in human ovarian carcinomas, Cancer Res 61(16) (2001) 5998 [19] D.C Wallace, D Chalkia, Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease, Cold Spring Harb Perspect Biol 5(11) (2013), doi: 10.1101 Alterations of Mitochondrial COX-1 Gene in Vietnamese Colorectal Cancer Patients Pham Thi Bich, Le Thi Quynh Tho, Trinh Hong Thai VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: This study aimed to screen alterations of mitochondrial COX-1 gene (mtCOX-1 gene) in 86 pairs of tissue samples (tumor and adjacent tumor tissues), blood samples from Vietnamese colorectal cancer patients and 67 samples of blood donor used as controls 17 alterations of mtCOX-1 gene in 25 tumor tissue samples were detected by using DNA sequencing method Four detected alterations including C6340T were involved in amino acid substitutions Then, the C6340T alteration was confirmed by PCR-RFLP method Combining two methods (DNA sequencing and PCR-RFLP), the C6340T alteration was detected in both homoplasmy and heteroplasmy tissue samples but was not detected in blood samples Heteroplasmy level of the C6340T alteration in two CRC patients was high (about ≥ 80% ) The C6340T alteration was determined to be a somatic mutation and a tendency to increase risk of CRC in the patients harbouring the C6340T alteration Keywords: Mitochondrial COX-1 gene, C6340T alteration, DNA sequencing, colorectal cancer  ... hàng gen ty thể Mitomap, có nhiều biến đổi gen COX-1 ty thể xác định nhiều bệnh ung thư khác ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đại trực tràng [11-16] Có số biến đổi gen COX-1 ty thể. .. đột biến gen COX-1 nguyên nhân gây bệnh ung thư [16] Như vậy, theo nghiên cứu cơng bố số biến đổi gen COX-1 có ảnh hưởng đến biểu số bệnh có bệnh ung thư Vì vậy, sàng lọc biến đổi gen COX-1 ty thể. .. việc điều tra biến đổi gen COX-1 ty thể cần thiết để đánh giá biến đổi gen, đồng thời hỗ trợ hiệu chẩn đoán điều trị bệnh UTĐTT Trên giới, ung thư đại trực tràng loại ung thư phổ biến với tỷ lệ