Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ) Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Tú PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC HÌNH Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU i Chƣơng 1- TỔNG QUAN iii 1.1 TY THỂ iii 1.1.1 Hệ genome ty thể iii 1.1.2 Đột biến ADN ty thể bệnh ty thể v 1.1.3 Đột biến ADN ty thể bệnh ung thƣ vii 1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG .x 1.2.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng x 1.2.2 Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng xi 1.2.3 Phân loại dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học xi 1.2.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20] xv 1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG xv 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể xvi 1.3.2 Đa hình gen ND3 ADN ty thể xviii 1.3.3 Các phƣơng pháp phát đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh xxi 1.3.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc xxiii CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP xxv 2.1 NGUYÊN LIỆU xxv 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu xxv 2.1.2 Hóa chất xxv 2.1.3 Thiết bị xxvi 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU xxvii 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô xxvii 2.2.2 Khuếch đại đoạn gen 398 v đoạn gen 3243 ADN ty thể PCR xxviii 2.2.3 Phân tích RFLP xxix 2.2.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzym giới hạn xxxi 2.2.5 Tinh ADN xxxiv Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN xxxvi 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP xxxvi 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng xxxvi 3.1.2 Kết nhân đoạn gen 3243 ADN ty thể xxxvii 3.1.3 Kết phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể xxxvii 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A1 398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP xxxix 3.2.1 Kết nhân đoạn gen 10398 ADN ty thể xxxix 3.2.2 Kết phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A1 398G xl 3.2.3 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G xli 3.2.4 Phân tích mối iên quan đa hình A1 398G với đ c điểm bệnh học âm s ng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng xliv KẾT LUẬN lvi KIẾN NGHỊ lvii TÀI LIỆU THAM KHẢO lviii PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined Phụ lục Danh sách bệnh nhân đ c điểm lâm sàng Error! Bookmark not defined Phụ lục Kết giải trình tự đoạn 10398 Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU Ty thể bào quan phổ biến tế bào nhân chuẩn Ty thể đƣợc coi trung tâm ƣợng tế bào, diễn trình chuyển hóa hợp chất hữu th nh ƣợng mà tế bào sử dụng đƣợc ATP Ngoài ra, ty thể đóng vai trò quan trọng nhiều trình chuyển hóa khác nhƣ apoptosis (quá trình tự chết tế bào), điều khiển tín hiệu Ca ci, điều khiển trình trao đổi chất tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] Cho đến nay, ngƣời ta thống kê đƣợc 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác ADN ty thể định Các bệnh rối loạn ADN ty thể thƣờng đƣợc biểu đa dạng, chúng iên quan đến rối loạn trình mã hóa protein ho c đơn đột biến thay đổi nucleotide [57] Trong v i năm trở lại đây, rối loạn ty thể iên quan đến bệnh ty thể đƣợc xem mục tiêu nghiên cứu di truyền học y học Đ c biệt, hƣớng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể nhƣ thị sinh học phát triển nhanh chóng nhiều ĩnh vực khác iên quan đến bệnh chuyển hóa g p, lão hóa, xác định đ c tính di truyền quần thể sử dụng dấu chuẩn di truyền mẹ… Trong số ĩnh vực phải kể đến ung thƣ – đề t i thu hút đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học Ung thƣ đại trực tràng loại ung thƣ phổ biến giới, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ phế quản nam giới v ung thƣ vú nữ giới Trên giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh n y v h ng năm có thêm khoảng trƣờng hợp đƣợc phát [79] Ở Việt Nam, ung thƣ đại trực tr ng chiếm tỷ lệ cao, đứng thứ hai tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ đƣờng tiêu hóa, đứng sau ung thƣ dày Để đạt đƣợc hiệu điều trị tốt bệnh nhân cần đƣợc chẩn đoán c ng sớm tốt Với phát triển khoa học, ngày nghiên cứu mức độ phân tử, có nghiên cứu đột biến ADN ty thể, ng y c ng góp phần vào công tác chẩn đoán v điều trị bệnh có hiệu Trong khuôn khổ luận văn n y, tiến h nh đề tài nghiên cứu: “Phân tích đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng” với mục đích: Phát đột biến gen tARN v ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng kỹ thuật PCR-RFLP Đánh giá mối liên quan đột biến gen tARN v ND3 ADN ty thể với đ c điểm lâm sàng bệnh ung thƣ đại trực tràng ngƣời Việt Nam Đề t i đƣợc thực phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 TY THỂ Ty thể bào quan có chức chuyển hóa ƣợng chất dinh dƣỡng th nh ƣợng ATP Ty thể có tất tế bào nhân chuẩn Ty thể đƣợc Atman phát v o năm 1894 v đến năm 1897 đƣợc Benda đ t tên mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito sợi chondria hạt) chúng thƣờng có dạng sợi, ho c dạng hạt quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng [3] Ty thể đƣợc coi trung tâm ƣợng tế bào nơi chuyển hóa chất hữu th nh ƣợng tế bào sử dụng đƣợc ATP Ngoài ra, ty thể đóng vai trò quan trọng nhiều trình chuyển hóa nhƣ: Apoptosis (quá trình tự chết tế bào), điều khiển tín hiệu Ca ci, điều khiển trình trao đổi chất tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] 1.1.1 Hệ genome ty thể Ty thể có chứa ADN, hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền nhân tế bào ADN ty thể phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thƣớc 16569bp, gồm hai chuỗi khác thành phần nucleotide: chuỗi n ng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine Chuỗi n ng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho gen tổng số 37 gen hệ gen ty thể Trong 37 gen có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa Số gen lại ghi mã cho 22 tARN, rARN có vai trò dịch mã ty thể [10] (hình 1) Các chuỗi polypeptide lại cần thiết cho cấu trúc chức ty thể đƣợc ghi mã genome nhân v đƣợc tổng hợp ribosome tế bào chất Các nghiên cứu ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có đ c trƣng riêng, phân biệt với hệ gen nhân Hệ gen ty thể có đ c tính di truyền theo dòng mẹ, có từ v i trăm đến vài nghìn copy tế bào Các tế bào khác có số ƣợng copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu ƣợng mô [60] Hệ gen ty thể vùng intron gen không có, ho c có bazo không mã hóa chúng Trong nhiều trƣờng hợp không xuất codon kết thúc mà có polyadenin hóa sau phiên mã D- Loop vùng hệ gen ty thể không tham gia mã hóa Vùng D-Loop có kích thƣớc 1,1 kb chứa yếu tố quan trọng cho trình phiên mã dịch mã nhƣ chứa promoter phiên mã chuỗi n ng chuỗi nhẹ, có vùng gắn với yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy đột biến ảnh hƣởng tới tính toàn vẹn chuỗi po ypeptide đƣợc mã hóa ty thể [41] Hình Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75] Các đ c điểm hệ gen ty thể nhƣ intron, histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphory hóa oxy hóa, nơi m gốc tự đƣợc tạo trình phosphory hóa oxy hóa, m cho khả bị đột biến ADN ty thể cao nhân (khoảng 10 lần) [51] Bởi ADN ty thể có nhiều nên phân tử bị đột biến tồn với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên tƣợng không đồng (heteroplasmy) ADN ty thể dạng đồng (homoplasmy) tất genome ty thể nhƣ Trong nhiều trƣờng hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây biểu lâm sàng hay biểu hóa sinh đạt tới ngƣỡng đột biến [51] Vì vậy, xác định đƣợc mức độ không đồng đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao chẩn đoán bệnh ty thể 1.1.2 Đột biến ADN ty thể bệnh ty thể Những đ c điểm hệ gen ty thể đƣợc phát từ đầu năm 198 , v tới năm 1988 đột biến có liên quan tới bệnh đƣợc tìm thấy [68] Bệnh ty thể thuật ngữ đƣợc dùng để nhóm bệnh gây hƣ hại trình tạo ATP Khi ƣợng ATP đƣợc sinh thấp nhu cầu tối thiểu mô bệnh ty thể xuất hƣ hỏng protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa Số ƣợng phân tử ADN mô, quan khác có nhu cầu ƣợng khác Bởi vậy, mô bị ảnh hƣởng nhiều đột biến ADN ty thể hệ thống thần kinh trung ƣơng, xƣơng, tim, thận, gan, tụy Các bệnh đƣợc mô tả rõ dựa biểu lâm sàng, hình thái hóa sinh, bệnh khó nhận biểu lâm sàng bệnh biến đổi khởi đầu bệnh diễn âm thầm, đ c biệt giai đoạn đứa trẻ nhỏ [57] Tuy nhiên, nay, tiến phƣơng pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể có nhiều khả quan Các nghiên cứu dịch tễ học năm gần cho thấy bệnh ty thể bệnh iên quan đến đột biến gen phổ biến ngƣời, ảnh hƣởng tới ngƣời quần cƣ dân [22] (hình 2) Hình Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] Cho đến có 15 đột biến ADN ty thể gây bệnh ngƣời đƣợc phát Các bệnh xuất giai đoạn đời, từ đứa bé sinh đến ngƣời trƣởng thành lứa tuổi Ngoài ra, nhiều đột biến đƣợc di truyền theo dòng mẹ, mà chẩn đoán cho ngƣời đƣợc dùng cho nhiều hệ gia đình [57] Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có iên quan đến tình trạng cơ, thần kinh tim mạch Các đột biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm v đột biến đoạn có liên quan tới bệnh ngƣời, hầu hết số ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng v ngoại biên Sau số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]: Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm gây bệnh, có ba đột biến gây bệnh chiếm tới 90% G3460A, G11778A T14484C Cả ba đột biến n y gen thuộc phức hệ I chuỗi hô hấp Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, thị lực trung tâm dẫn đến chức thị giác chung giảm kèm chứng loạn màu sắc Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, điều hòa (NARP): bệnh gây đột biến T8993G gen ATPasa thuộc phức hệ V Ngƣời bệnh có biểu chậm phát triển, sắc tố võng mạc, trí nhớ, điều hòa, yếu thần kinh Hội chứng Leigh: Bệnh gây đột biến T8993G gen ATPasa 6, giống với bệnh NARP, nhiên bệnh nhân mang % đột biến thể hội chứng Leigh Ngƣời bệnh có biểu rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu sớm năm trẻ, có tổn thƣơng ho c nhiều khu vực hệ thần kinh trung ƣơng Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với biểu tương tự đột quỵ (MELAS): bệnh gây đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu) Bệnh có triệu chứng rối loạn thần kinh trung ƣơng, iệt nửa ngƣời, mù nôn mửa Chứng động kinh co giật có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA ( ys) Ngƣời bệnh có biểu tai biến, co giật cơ, ƣỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhƣợc thần kinh teo não, nhƣợc 1.1.3 Đột biến ADN ty thể bệnh ung thƣ Mối liên quan chức ty thể với bệnh ung thƣ đƣợc Otto Warburg lần phát từ năm 193 , ông giả thiết tăng tốc độ trình đƣờng phân hiếu khí nhiều loại mô u hƣ hại chuỗi hô hấp tế bào [70] Theo Warburg, số biến đổi ty thể có liên quan đến ung thƣ đột biến ADN ty thể, biến đổi biểu hoạt động tiểu đơn vị chuỗi hô hấp Hoạt động chuỗi hô hấp ty thể có liên quan với tạo thành loại oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS) Trong điều kiện electron bị thừa mức (ví dụ nhƣ nhu cầu ca o tăng ên), ho c ức chế phức hệ enzym chuỗi hô hấp, ROS đƣợc tạo nhiều Sự tăng ROS, ho c stress oxy hóa gây đột biến ADN ty thể v nhân, m hƣ hại thành phần lipid protein nội bào Hệ gen ty thể đ c biệt dễ dàng chịu tác dụng ROS phân bố gần chuỗi hô hấp, khả sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51] Đột biến ADN ty thể gây biểu khác thƣờng tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử đƣợc mã hóa ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả phosphory hóa oxy hóa Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm chức năng, tác động đến trình tạo thành ATP ROS, làm biến ðổi biểu số gen nhân, tác động đến trình điều hòa protein trình tổng hợp nucleotide tế b o Nhƣ biến đổi hệ gen ty thể có iên quan đến bệnh ung thƣ [27] Một số đột biến ADN ty thể đƣợc xác định nhiều loại ung thƣ khác nhau, nhƣ ung thƣ vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể xuất vùng ghi mã vùng không ghi mã [19] (hình 3) Cho đến nhiều dạng biến đổi ADN ty thể đƣợc xác định ung thƣ Các biến đổi bao gồm: đột biến điểm, thêm ho c base, l p đoạn, đoạn v thay đổi số ƣợng ADN ty thể Vị trí ung thƣ Hạch < 50 15 Đại tràng 30 Trực tràng 29 Gi a đại trực tràng 13 15 >3 27 0,05) - Phân bố đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u Ung thƣ diễn đại tràng, trực tr ng hay đoạn nối đại tràng trực tr ng (ung thƣ đại trực tràng) Kết khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí khối u đƣợc biểu diễn hình 19 Hình 19 Biểu đồ phân bố đa hình A1 G theo vị trí khối u Số liệu từ hình 19 cho thấy vị trí khối u tập trung chủ yếu trực tr ng v đại tràng, phần nhỏ vùng đại trực tràng (2/61 bệnh nhân) Alen G xuất với tần suất cao ung thƣ vùng đại trực tràng (100%), tiếp thƣ trực tràng (62,1%), cuối ung ung thƣ đại tràng (43,33%) Alen A không xuất vùng đại trực tràng Có khác tần suất alen với vị trí khối u, khác n y không mang ý nghĩa thống kê (χ2 = 3,838 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05) - Khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo kích thƣớc u Kích thƣớc khối u đƣợc biết đến nhƣ yếu tố giúp tiên ƣợng bệnh ung thƣ đại trực tr ng, đ c biệt có ý nghĩa chẩn đoán ung thƣ đại tràng Nó có iên quan đến trình tiến triển khả sống sót ung thƣ đại tràng [39] Do tiến h nh phân tích mối iên quan đa hình A1 398G với kích thƣớc khối u Kết phân tích thống kê đƣợc trình b y hình Hình 20 Biểu đồ phân bố đa hình A1 G theo kích thƣớc u Kết từ hình 20 cho thấy tần suất xuất alen A nhóm có kích thƣớc u ≥ 5cm 59%, a en G 41% Trong nhóm có kích thƣớc u < 5cm tần suất alen G lại gần gấp đôi a en A (64,3% v 35,7%) Sự khác biệt phân bố đa hình với kích thƣớc u không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,71 < χ21(0,05) = 3,84, p>0,05 - Khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số hạch lympho Số ƣợng hạch lympho yếu tố quan trọng giúp phân loại giai đoạn bệnh v có ý nghĩa việc tiên ƣợng khả sống sót bệnh nhân Do tiến hành khảo sát đa hình A1 398G theo số hạch ympho để tìm hiểu mối liên quan chúng Kết phân tích đƣợc biểu diễn hình 21 Hình 21 Biểu đồ phân bố đa hình A1 G theo số hạch Kết từ hình 21 cho thấy số hạch tăng ên tần suất xuất a en G tăng ên v đạt nhiều nhóm có số hạch >3 (63%) Tần số alen A lớn nhóm không xuất hạch (66,67%) Nhƣ ngƣời mang a en G có nguy mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng với mức độ nguy hiểm cao ngƣời mang alen A Sự khác biệt tần suất alen số hạch không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,559 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05 - Khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo giai đoạn phát triển khối u Trong nghiên cứu n y giai đoạn phát triển khối u đƣợc phân loại theo hệ thống TNM, với giai đoạn Việc phân loại giai đoạn phát triển bệnh có ý nghĩa lớn việc tiên ƣợng bệnh lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp Chúng tiến hành khảo sát, tìm hiểu mối liên quan đa hình A1 398G với giai đoạn phát triển khối u Kết phân tích đƣợc biểu diễn hình 22 Hình 22 Biểu đồ phân bố đa hình A1 G theo giai đoạn TNM Số liệu hình 22 cho thấy tần suất alen A cao giai đoạn II, đạt tới 60% Ở giai đoạn IV bệnh nhân mang a en A Giai đoạn I giai đoạn bệnh mức nhẹ, ung thƣ bắt đầu ây an, nhƣng lớp lót bên đại trực tr ng, chƣa an đến quan khác Ở giai đoạn I alen G có tần suất đạt 62,5% Tiếp tần suất alen G có giảm giai đoạn II (4 %) v tăng trở lại giai đoạn III (57,14%) Alen G có tần suất xuất lớn giai đoạn IV (100%) Đây giai đoạn n ng bệnh với di khối u tới quan xa (phổi, gan) thông qua hệ bạch huyết Khả sống sót bệnh nhân sau năm giai đoạn đạt từ 0-7% Điều lại lần khẳng định cho giả thuyết a en G m tăng nguy bệnh ung thƣ đại trực tràng Sự khác biệt phân bố đa hình A10398G với giai đoạn phát triển ung thƣ TNM không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 4,675 < χ23(0,05) = 7,814, p>0,05 - Khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo mức độ biệt hóa Mức độ biệt hóa khái niệm dùng để mức độ giống tế bào bình thƣờng loại mô tế bào u Mức độ ác tính ung thƣ có iên quan trực tiếp đến nguồn gốc tế bào biệt hóa Thông thƣờng, khối u có tính biệt hóa cao, tế b o ung thƣ thƣờng phát triển chậm, mức độ ác tính thấp, di chậm M t khác khối u có tính biệt hóa thấp độ ác tính lại cao, di nhanh Kết việc khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể theo mức độ biệt hóa đƣợc biểu diễn hình 23 Hình 23 Biểu đồ phân bố đa hình A1 G theo mức độ biệt hóa Kết từ hình 23 cho thấy tần suất a en G tăng dần với giảm mức độ biệt hóa, đồng nghĩa với việc tăng dần độ ác tính tốc độ di khối u Đối với a en A ngƣợc lại, đạt cao mức đô độ biệt hóa cao (60%), thấp mức biệt hóa (0%) Kết n y phù hợp với giả thuyết a en G m tăng mức độ nguy hiểm với bệnh ung thƣ đại trực tràng Sự khác biệt tần suất alen mức độ biệt hóa không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,366 < χ22(0,05) = 5,991, p>0,05 Nhƣ qua việc khảo sát phân bố đa hình A1 398G theo đ c điểm bệnh học lâm sàng, thấy đƣợc số đ c điểm sau: - Tần suất xuất alen A mô u mô lân cận u 46%, alen G 54% Không có khác biệt tần suất alen mô u mô lân cận u Sự phân bố đa hình phù hợp với nghiên cứu đa hình A1 398G đối tƣợng ngƣời châu Á (khu vực miền Bắc Ấn Độ: 57,3%, Trung Quốc 57,1%) - Alen A G phân bố nam nữ Tần suất alen G nam 50%, nữ 58,1% Ở nhóm có độ tuổi ≥ , tần suất alen G 52,2%, nhóm 0,05) Không tìm thấy đột biến A3243G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tr ng đƣợc nghiên cứu KIẾN NGHỊ Từ trình nghiên cứu thực tế đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục phân tích đột biến gen tARN v ND3 ADN ty thể đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ đại trực tr ng với số ƣợng mẫu ớn để có kết đánh giá xác tần xuất nhƣ mối iên hệ đột biến gen tARN ND3 với bệnh ung thƣ đại trực tr ng ngƣời Việt Nam Tiến h nh phân tích đột biến gen tARN v ND3 ADN ty thể kỹ thuật PCR định ƣợng, dHPLC để xác định mức độ không đồng ADN ty thể bệnh nhân đƣợc nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đái Duy Ban (2 3), "Bƣớc đầu nghiên cứu ung thƣ vú bệnh nhân Việt Nam phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng thị di truyền hệ gen ty thể vùng D- Loop", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, pp 825-830 Phan Văn Chi (2 6), "Nghiên cứu giải mã genome ty thể tộc ngƣời Việt Nam v định hƣớng ứng dụng" Báo cáo đề tài cấp nh nƣớc (mã số: KC-0425) Nguyễn Nhƣ Hiền (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Chu Văn Mẫn (2009), "Tìm hiểu bệnh ty thể ngƣời phƣơng pháp sinh học phân tử" Báo cáo đề t i ĐHQGHN (mã số: QT-08-31) Nguyễn Hữu Nghĩa, Đ ng Trần Trung Tống Quang Vinh (2 8), "Đột biến hệ gen ty thể vùng D-Loop ngƣời ao động thƣờng xuyên tiếp xúc với xạ ion hóa", Tạp chí Y học Việt Nam, 351, pp 29-34 Phan Tuấn Nghĩa (2 12), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Lê Đình Roanh v Nguyễn Văn Chủ (2008), Bệnh học khối u, Nhà xuất y học Hà Nội Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trƣờng hợp bệnh lý thần kinh nhãn cầu LEBER xác định kỹ thuật giải trình tự DNA ty thể tách chiết từ bạch cầu bệnh nhân để phát đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử hóa sinh y học, pp 285-289 Tài liệu tiếng Anh Alonso A., Martin P., and Albarran C et al (1997), "Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis", Electrophoresis, 18, pp 682-685 10 Anderson S., Bankier A T., and Barrell B G (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp 457465 11 Andrew R M., Kubacka I., and Chinnery P F (1999), "Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA", Nature Genetics, 23(147) 12 Bai R K., Leal S M., and Covarrubias D (2007), "Mitochondrial genetic background modifies breast cancer risk", Cancer Research, 67, pp 4687-4694 13 Bassam B J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P M (1991), "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Analytical Biochemistry, 196, pp 80-83 14 Bianchi M S., Bianchi N O., and Bailliet G (1995), "Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients", Cytogenetics and Cell Genetics , 71(1), pp 99-103 15 Bonner M R et al (2009), "Mitochondrial DNA Content and Lung Cancer Risk", Lung Cancer, 63(3), pp 331-334 16 Booker L M et al (2006), "North American white mitochondrial haplogroups in prostate and renal cancer", Journal of Urology, 175(2), pp 468-472 17 Burgart L J et al (1995), "Somatic mitochondrial mutation in gastric cancer", The American Journal of Pathology, 147, pp 1105-1111 18 [...]... D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thƣ của 1 bệnh nhân ung thƣ dạ dày [72] Hai đột biến n y đ c trƣng bởi có 2 ho c 3 đoạn l p lại kế tiếp nhau Thay đổi số bản sao ADN ty thể Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã đƣợc phát hiện ở nhiều loại bệnh ung thƣ Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thƣ tuyến giáp [47], ung thƣ phổi [15], ung thƣ đại trực tràng [44] Biến đổi theo hƣớng giảm số bản sao ADN ty thể đƣợc...Hình 3 Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thƣ [19] Đột biến điểm Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thƣ vú, Tan v cs (2 2) đã giải trình tự genome ty thể trên 19 c p mô ung thƣ v mô bình thƣờng của cùng bệnh nhân v đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) đƣợc xác định trong các gen 16S rRNA, ND2 và ATPase... thống kê giữa mô thƣờng và mô bệnh [49] A onso v cs (1997) xác định sự có m t của đột biến ADN ty thể (23%) trên vùng D-Loop Những đột biến n y đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp, và đột biến thêm 2 bp [9] Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng thấy rằng 88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin... trên gen GAPDH có iên quan tới khối u giai đoạn T3/T4 Nghiên cứu về đa hình của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng trên quần thể ngƣời Anh và Scotland cho thấy có 132 SNPs ở quần thể ngƣời Anh và 140 SNPs ở quần thể ngƣời Scotland [61, 71] Ở quần thể ngƣời Scotland, alen G xuất hiện cao hơn ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng ở vị trí 750, 1438 (trên gen 12 rRNA), 4769 (trên gen ND2) Ở quần thể. .. ở bệnh ung thƣ vú [63], ung thƣ biểu mô tế bào gan [42], ung thƣ buồng trứng [69] Nhƣ vậy biến đổi về h m ƣợng ADN ty thể có liên quan với loại ung thƣ Ngƣời ta cho rằng số ƣợng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thƣ có thể phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thƣ đó Ví dụ nhƣ các đột biến trong vùng DLoop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy M t khác, đột biến ADN ty thể. .. lại đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một purin với một pyrimidine) Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA 6 % đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này làm thay đổi acid amin [56] Trong luận văn n y chúng tôi muốn đi sâu v o đột biến ADN ty thể trên gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí A10398G) 1.3.1 Đột biến gen tARN của ADN ty thể. .. kim nhỏ Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ biến có thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thƣ (CEA), xét nghiệm máu trong phân (FOBT) 1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã hóa và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tr ng Năm 1998, Po... Đột biến điểm tARN ty thể đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty thể gây ra bệnh ty thể Hai đột biến tARN đƣợc phát hiện đầu tiên là A8344G trên tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến v đƣợc nghiên cứu nhiều nhất Đột biến A3243G có iên quan đến rất nhiều biểu hiện âm s ng v thƣờng gây ra hội chứng MELAS [31] MELAS cũng có thể bị gây ra bởi những đột biến khác trên tARNLeu(UUR) Đột biến. .. A3243G ADN ty thể là 10%, trong khi đó tỷ lệ n y trong mô cơ ho c não ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS có thể tới 70% [67] 1.3.1.2 Đột biến A3243 và bệnh ung thƣ đại trực tràng Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh, tiểu đƣờng Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh nhân ung thƣ trực tràng Lorenc v cs (năm 2 3) khi nghiên cứu các đột. .. nghiên cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thƣ, đã phát hiện một mẫu ung thƣ trực tr ng có đột biến A3243G dạng đồng nhất (homoplasmic) [46] 1.3.2 Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể Cũng giống nhƣ genome nhân, hệ gen ty thể mang những trình tự đa hình Đa hình là sự khác biệt về chuỗi ADN giữa những cá thể, các nhóm, ho c các quần thể Nó bao gồm ... văn n y, tiến h nh đề tài nghiên cứu: Phân tích đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng với mục đích: Phát đột biến gen tARN v ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại. .. 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể Đột biến điểm tARN ty thể đột biến chiếm phần lớn đột biến ty thể gây bệnh ty thể Hai đột biến tARN đƣợc phát A8344G tRNALys A3243G tARNLeu(UUR) phổ biến v... chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20] xv 1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG xv 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể xvi 1.3.2 Đa hình gen ND3 ADN ty thể xviii 1.3.3