Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)

Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)

-1-

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Ngô Thị Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMIC MÔ GAN CỦA NGƯỜI

BỊ UNG THƯ GAN NGUYÊN PHÁT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

-2-

MỞ ĐẦU

Ung thư gan là một trong năm dạng ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng hàng thứ ba về nguyên nhân gây chết do ung thư trên toàn cầu Cơ hội sống sót của bệnh nhân mắc ung thư gan là rất thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt ở một số nơi tỷ lệ này chỉ là 17% sau 1 đến 3 năm được chẩn đoán mắc bệnh [31] Hàng năm

có khoảng 600.000 người được chẩn đoán mắc ung thư gan và gần bằng con số đó

là số lượng người đã chết vì nó mỗi năm [36] Từ những con số trên cho thấy một thực tế rằng việc chẩn đoán và điều trị ung thư gan trên thế giới hiện nay gặp rất nhiều khó khăn

Proteomics là công cụ số một trong phân tích hệ protein của cơ thể sinh vật

Kỹ thuật proteomics đã được áp dụng cho các nghiên cứu chỉ thị sinh học của các bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư thanh quản, ung thư vòm họng, ung thư gan, ung thư máu Việc nghiên cứu bằng kỹ thuật proteomics đang ngày càng được mở rộng, đem lại kết quả ngày càng lớn ứng dụng trong sinh học, y học, dược học và nghiên cứu cơ chế của các quá trình sinh học [39]

Ung thư gan nguyên phát là dạng ung thư xuất phát từ các tế bào gan và nó chiếm đến hơn 90% các trường hợp ung thư gan Nhiễm virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) mạn tính và xơ gan được cho là các nguyên nhân chính dẫn đến ung thư gan [35] Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát cao do nhiễm HBV và HCV Do đó, việc phát hiện sớm ung thư gan rất quan trọng đối với việc điều trị loại ung thư này

Thực hiện luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích

proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích:

 Phân tích protein ty thể, microsome và phần còn lại của tế bào tách từ

mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan

-3-

 Phân tích và so sánh sự biểu hiện của các protein ty thể, microsome và phần còn lại trong mô gan ung thư và mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan nhằm tìm ra các protein đặc trưng có liên quan đến bệnh

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

-4-

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới Bệnh này khó chẩn đoán, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao và tử vong trong thời gian ngắn kể từ khi phát hiện Trong năm 2008 ước tính có 12 triệu trường hợp được chẩn đoán mắc ung thư, 7 triệu người chết và khoảng 25 triệu người đang sống chung với ung thư trên thế giới Tại Mỹ, năm 2009 ước tính có 22.620 trường hợp được chuẩn đoán mắc ung thư, 18.160 người chết Ung thư gan (UTG) gồm hai loại là nguyên phát và thứ phát Dạng nguyên phát hình thành từ các mô của gan, trong khi dạng thứ phát tạo nên bởi các tế bào từ những cơ quan khác trong cơ thể

di căn thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan và tạo khối u (nên còn gọi là ung thư gan do di căn) Dưới kính hiển vi, các tế bào ung thư di căn gan nhìn giống như các

tế bào ung thư mà chúng xuất phát Do đó, trong phạm vi khoá luận này, chúng tôi chỉ xin đề cập đến ung thư gan nguyên phát với dạng ung thư phổ biến nhất của nó

là ung thư biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [52]

1.1.1 Phân loại ung thư gan nguyên phát

Các khối u ác tính nguyên phát của gan có thể phát sinh từ thành phần biểu

mô hoặc không phải biểu mô, trong đó ung thư biểu mô là loại hay gặp nhất, chiếm

vị trí quan trọng nhất trong bệnh học UTG Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hoá tế bào, UTG nguyên phát được phân loại thành các dạng sau [3]:

- Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) là dạng ung thư ác tính xuất phát từ các tế bào gan, chiếm khoảng 90% các dạng UTG nguyên phát Bệnh nhân mắc HCC có nguy cơ tử vong rất cao

- Ung thư biểu mô đường mật (Cholangio carcinoma) là dạng có những khối u

ác tính trong gan bao gồm các tế bào giống tế bào biểu mô đường mật Bệnh thường gặp ở lứa tuổi cao hơn so với ung thư tế bào gan, trung bình khoảng

1.1.2 Các giai đoạn của ung thư gan

Ung thư gan được chia làm 4 giai đoạn:

 Trong giai đoạn I, có một khối u và không lây lan sang các mạch máu gần đó

 Trong giai đoạn II, có một khối u đã lan ra các mạch máu gần đó; hoặc nhiều hơn một khối u, không cái nào trong số đó lớn hơn 5 cm

 Giai đoạn III được chia thành các giai đoạn IIIA, IIIB, và IIIC; Trong giai đoạn IIIA, một trong những điều sau đây được tìm thấy: nhiều hơn một khối u lớn hơn 5 cm hoặc một khối u đã lan rộng đến một chi nhánh chính của các mạch máu gần gan Trong giai đoạn IIIB, có một hay nhiều khối u của bất kỳ kích thước mà có một trong hai: lây lan đến các cơ quan lân cận khác với các túi mật, hoặc bị hỏng thông qua các màng của khoang phúc mạc Trong giai đoạn IIIC, ung thư đã lan đến hạch bạch huyết gần đó

 Trong giai đoạn IV, ung thư đã lan tràn vượt ra ngoài gan đến những nơi khác trong cơ thể, chẳng hạn như xương hay phổi Các khối u có thể có kích thước bất kỳ và cũng có thể đã lan ra các mạch máu gần

đó và các hạch bạch huyết [53]

-6-

1.1.3 Nguyên nhân ung thư gan

Mỗi một tác động xấu đều làm tăng nguy cơ mắc một căn bệnh bất kì và có thể là ung thư Các bệnh ung thư khác nhau có các tác nhân gây bệnh khác nhau Ví

dụ, để làn da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh là tác nhân dẫn đến ung thư da Hút thuốc là một tác nhân dẫn đến ung thư phổi, miệng, thanh quản, bàng quang, thận, và nhiều cơ quan khác Nhưng việc có một, hay có vài tác nhân không

có nghĩa rằng một người sẽ mắc bệnh Các nhà khoa học đã tìm thấy một số tác nhân làm tăng khả năng dẫn đến ung thư biểu mô tế bào gan

UTG được xem là biến chứng phổ biến nhất của các bệnh mãn tính thường gặp ở gan Chúng thường được gặp ở nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng 5,5–14,9/100.000 người mắc bệnh và ước tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử vong [31] Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhau nhiều tuỳ theo khu vực địa lý trên thế giới, nhất là giữa phương Đông và phương Tây Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao nhất là Đông Á, Đông Nam Á và khu vực Nam sa mạc Sahara Nghiên cứu dịch tễ học đã xác định được các yếu tố nguy cơ chính của UTG bao gồm: nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) dẫn đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); các loại hoá chất gây ung thư như rượu, asen, dioxin (hình 1),… và các rối loạn chuyển hoá apocphirin, thiếu hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền Ngoài ra những yếu tố như độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền,… cũng ảnh hưởng đến nguy cơ mắc bệnh Mặc dù các yếu tố nguy cơ gây UTG tác động đến tế bào gan theo các con đường khác nhau nhưng cuối cùng đều dẫn đến biến đổi di truyền và hình thành tế bào ung thư

-7-

Hình 1: Các nguyên nhân chính gây ung thư gan [57]

Nhiễm virus HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTG trên toàn thế giới, sự phân bố địa lý giữa tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính và tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan chặt chẽ Ví dụ như Trung Quốc, các nước thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa mạc Sahara có những tỉ lệ này đều ở mức cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV có thể ngăn ngừa được khoảng 70% UTG ở các vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao HBV là một retrovirus có vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy

sự hiện diện của ADN của HBV trong hệ gen các tế bào gan của khoảng 90% trường hợp bệnh nhân ung thư gan [3] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi ADN của HBV chèn vào hệ gen của người làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt

hoá các gen ung thư như c–Myc, c–Fos,… và bất hoạt một số gen ức chế khối u như

TP53 Ngoài ra, các sản phẩm protein của hệ gen HBV như HBx, protein của gen pre S/S cũng hoạt hoá các gen ung thư dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào và ức

chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis)

Nhiễm virus HCV là yếu tố nguy cơ thứ 2 của UTG Có khoảng 2–4% số trường hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG Ở những quốc gia, vùng lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thường cũng có tần suất UTG thấp hoặc

-8-

trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV là yếu tố nguy cơ số 1) Số ca tử vong

do UTG ở Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, cùng thời gian đó tỷ lệ nhiễm HBV

là không đổi, chỉ có viêm gan HCV là tăng lên tương ứng với tỷ lệ tử vong Những nghiên cứu gần đây cho thấy sản phẩm protein của HCVcó thể tương tác với các protein vật chủ tham gia vào quá trình phát triển, tăng sinh và điều hòa hoạt động tế bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính Có ba protein được xem là bằng chứng tham gia vào quá trình này đó là protein lõi (core protein), NS3 và NS5A

Aflatoxin (AF) là một mycotoxin được tiết ra từ các chủng nấm mốc

Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thường mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc

ẩm ướt, đã được chứng minh là có thể gây UTG thực nghiệm trên súc vật (hình 2)

AF là chất tương tác với virus HBV tăng đáng kể nguy cơ mắc UTG AF gây ra các

đột biến gen, trong đó đột biến gen p53 được quan sát thấy nhiều nhất Hàng loạt

nghiên cứu đã chỉ ra đột biến gen này, đặc biệt là đột biến G/T ở codon 249 luôn được tìm thấy ở bệnh nhân UTG tại những khu vực có sự phơi nhiễm AF cao [31]

Hình 2: Cơ chế gây ung thư của các tác nhân ung thư gan [13]

-9-

Ngoài các nguyên nhân trên thì các yếu tố khác như tuổi, giới tính, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, hoặc các rối loạn trao đổi chất như nhiễm sắt ở mô, thiếu hụt α1-antitrypsin cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư gan [35]

1.1.4 Chẩn đoán và điều trị ung thư gan

1.1.4.1.Chẩn đoán

Gan được cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả năng tái sinh mạnh, do đó ung thư gan phát triển rất nhanh Đồng thời, các triệu chứng của ung thư gan thường biểu lộ khi bệnh đã nghiêm trọng, do đó, việc điều trị ung thư gan gặp rất nhiều khó khăn Đây chính là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ

tử vong do ung thư gan rất cao

Việc chẩn đoán ung thư gan ở giai đoạn sớm là vô cùng cần thiết Có hai phương pháp thông dụng nhất hiện nay để chẩn đoán ung thư gan là các x t nghiệm chẩn đoán vật lý và xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư

Để chẩn đoán khi có các triệu chứng của ung thư gan, một số phương pháp chẩn đoán vật lý được áp dụng như: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hưởng

từ (MRI - Magnetic Resonance Imaging), chụp X- quang Tuy nhiên, những phương pháp này tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc và không hiệu quả để phát hiện khối u ở giai đoạn sớm

Cách chẩn đoán thứ hai rất thông dụng đó là việc xét nghiệm chỉ thị AFP trong huyết thanh AFP là một glycoprotein có khối lượng 70kDa, được tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng trong giai đoạn thai nhi, và sau đó nó được tiết vào huyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh giảm

và hầu như không phát hiện được ở người trưởng thành khỏe mạnh AFP có thể

-10-

được dùng để sàng lọc người có nguy cơ bị ung thư gan cao AFP mất đi ngay sau khi trẻ sinh ra, nếu hiện diện ở máu người lớn có nghĩa là có biến đổi về tế bào gan

và có khả năng mắc ung thư gan cao [10]

Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vì có thể nó cũng tăng ở những người bị viêm gan Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp AFP cũng không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thư gan mà hàm lượng AFP trong máu vẫn bình thường (đặc biệt ở những bệnh nhân có khối u nhỏ hơn 3cm) [11]

Hàm lượng AFP cao có thể cho chúng ta nghi ngờ chứ không thể chắc chắn bệnh nhân đã mắc ung thư gan Các x t nghiệm có thể giúp chẩn đoán ung thư gan, nhưng trong đa số trường hợp cách duy nhất để chắc chắn là lấy một mảnh của khối

u và xem x t nó dưới kính hiển vi Điều này được gọi là sinh thiết Có nhiều cách khác nhau để có được những mẫu khối u Trong một số trường hợp, một mẫu sinh thiết có thể được thực hiện trong khi phẫu thuật Nếu khối u đã lớn hoặc đã lan rộng khắp gan, một kim rỗng có thể được đặt qua da trong bụng và vào trong gan Sinh thiết mẫu cũng có thể được thực hiện trong thời gian phẫu thuật nội soi

1.1.4.2 Điều trị

Có 2 nhóm điều trị chính: phẫu thuật và không phẫu thuật Nhóm phẫu thuật

là phương thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hơn hẳn, và trong đó cắt gan là điều trị chọn lựa, tuy nhiên chỉ có khoảng 10-20% bệnh nhân có khả năng cắt bỏ UTG Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa và UTG, tuy nhiên, vấn đề là thiếu gan cho để ghép

 Điều trị không phẫu thuật có thể dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn qua da, phá hủy u bằng nhiệt, phá hủy u bằng sóng tần số radio, hóa trị toàn thân với Doxorubicin, xạ trị qui ước, điều trị nhắm đích

 Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, ngoài ra có thể hủy u bằng laser hay đông lạnh cho các u bề mặt

Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học Chỉ thị sinh học có thể đơn thuần là một chất, như glucose là chỉ thị của bệnh tiểu đường, hoặc phân tử protein, như các kháng thể là chỉ thị của bệnh nhiễm trùng, hay các dấu ấn ADN là chỉ thị cho các bệnh liên quan đến di truyền Với phát triển của những kỹ thuật sinh học hiện đại, người ta có thể nghiên cứu nhiều phân tử trên cùng một mẫu bệnh phẩm như microarray, proteonomics [16]

Trong nghiên cứu bệnh học, chỉ thị sinh học có thể là những phân tử gây bệnh hay những phân tử được tạo ra sau khi bệnh phát triển Biomarker còn được gọi là

“chỉ thị” của một hiện tượng sinh học, những nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu dụng của chỉ thị sinh học cho nhiều bộ môn sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng Các nhà nghiên cứu chỉ thị sinh học tin tưởng rằng chỉ thị sinh học chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm chỉ thị sinh học sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học Những ứng dụng này gồm các phương pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh ), hoặc các bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường Chỉ thị sinh học cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc [5]

1.2.2 Các phương pháp nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thư

-12-

Các chỉ thị ung thư là những đại phân tử xuất hiện ở bệnh nhân ung thư, có nồng

độ thay đổi liên quan đến sự phát sinh và tăng trưởng của những khối u ác tính Chỉ thị ung thư là những chất do các tế bào hoặc mô ung thư tổng hợp và tiết ra từ khối

u bị phá vỡ hoặc được tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormon và những biến đổi di truyền của tế bào Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm các chất hóa sinh phát hiện ở những nồng độ không bình thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu, và các loại dịch của cơ thể

Hiện nay, có ba phương pháp chính đang được tiến hành để nghiên cứu các chỉ thị phân tử phục vụ cho việc chẩn đoán sớm ung thư:

- Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gen lạ thường có liên quan đến các loại ung thư riêng biệt Tuy nhiên, các kết quả của những nghiên cứu này mới chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ chưa tìm được cơ chế thực sự của bệnh Có hai lý do chính về giới hạn phương pháp genomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư Thứ nhất, phần lớn các gene liên hệ đến di truyền có tần số rất thấp trong quần thể

đa dạng sinh học; thứ hai, các bệnh đều có sự tham gia của một phức hệ gene, mà phần lớn chưa biết tới, chứ không phải từ một gene

- Phương pháp proteomics xác định được hầu hết các protein có triển vọng trở thành các protein chỉ thị ung thư Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác các đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lượng bệnh, dự đoán được các ảnh hưởng của việc điều trị và giúp phát triển y học cho từng cá nhân Hạn chế của phương pháp này là nhiều protein chỉ thị ung thư chỉ được tìm thấy ở mô ung thư mà không có mặt trong máu

- Phương pháp sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng nguyên ung thư Tuy nhiên, do có hiện tượng phản ứng

-13-

chéo trong phản ứng miễn dịch, do đó kết quả của phương pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu [18]

Proteomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư

Proteomics ung thư là từ được dùng để chỉ các ứng dụng của kỹ thuật proteomic trong nghiên cứu ung thư Như chúng ta đều biết ung thư là một bệnh kì

lạ bởi các đột biến diễn ra ở tế bào ung thư Những thay đổi ADN ở các tế bào này được dùng trong chẩn đoán nguy cơ bệnh, chẩn đoán sớm và đưa ra hướng điều trị Việc sử dụng kỹ thuật proteomic để xác định các tế bào người bệnh sẽ mang lại một cuộc cách mạng trong y học

Việc tìm các chỉ thị sinh học hiệu quả nhất là việc tìm các chỉ thị protein, vì protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác động trực tiếp đến các hiện tượng sinh học Lý do quan trọng hơn nữa là protein là thành phần sinh học phong phú nhất của tế bào so với mRNA hay xa hơn nữa là gene Một gene có thể có nhiều bản sao mRNA, biến đổi dịch mã và sau dịch mã thường tạo ra nhiều protein hơn số bản sao mRNA Theo ước lượng hiện nay, có khoảng từ 300.000 đến 500.000 protein từ

số lượng khoảng 30.000 gene của bộ gene người [2]

Trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các chỉ thị ung thư đã trở thành mục đích chính của các nghiên cứu ung thư Thành công trong ứng dụng của kháng nguyên tuyến tiền liệt (PSA) trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt đã thúc đẩy các nghiên cứu để tìm ra những chỉ thị thích hợp cho các loại ung thư khác Các chỉ thị sinh học cũng được ứng dụng trong chẩn đoán, theo dõi ung thư, chẩn đoán sự tái phát bệnh, và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Với các đích đã được xác định, các thuốc điều trị như imatinib (Novartis Gleevec), trastuzumab (Roche s Herceptin),

và rituximab (Roche s Mabthera) đã được tạo ra để tác động đặc hiệu nhằm điều trị

có hiệu quả bệnh ung thư Hiện nay, xu hướng lựa chọn các chỉ thị và bệnh nhân để tiến hành điều trị sẽ tốt cho việc dự đoán tình trạng kháng thuốc Các chỉ thị sinh học thực sự rất cần cho việc phát triển điều trị cho từng cá nhân Các protein có thể

-14-

được tiết ra một cách tích cực hoặc được giải phóng ra bởi các tế bào khối u như là kết quả của sự hoại tử hay quá trình apoptosis và sau đó chúng được lưu thông trong máu Điều này dẫn đến sự thay đổi hệ thống protein Sự khác biệt về cường độ tín hiệu có thể được tìm ra bằng cách so sánh với huyết tương của những người bình thường Các kỹ thuật như Antibody Microarray, điện di hai chiều và khối phổ là những kỹ thuật chính được sử dụng để tìm các chỉ thị cho bệnh ung thư [43]

Kết quả từ Viện nghiên cứu Y học Hoa Kỳ (NIH) đã cho biết có 14 protein

có khả năng dùng làm chỉ thị cho bệnh ung thư vú từ các phân tích khối phổ với mẫu sữa lấy từ vú bệnh nhân[9] Trong các nhóm được thử nghiệm, độ chính xác của các chỉ thị này rất cao so với việc dùng các gene BRCA (BRCA là gene của bệnh ung thư vú di truyền, tuy nhiên gen này chỉ có tỉ lệ thấp từ 2-5% của bệnh này khi dùng để chẩn đoán chung) Một số chỉ thị protein khác cũng đã được phát hiện

từ nghiên cứu các bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ung thư phổi, ung thư bàng quang,

và ung thư buồng trứng; về các bệnh tim mạch đã có một số chỉ thị protein được cho là có liên quan đến bệnh nghẽn động mạch

1.2.3 Nghiên cứu chỉ thị sinh học với ung thư gan

Với ung thư gan, việc nghiên cứu các chỉ thị sinh học đã và đang được tiến hành với cả ba hướng, bao gồm việc dò tìm các chỉ thị ADN, protein và các kháng thể đặc hiệu Trong đó, một trong những hướng nghiên cứu quan trọng nhất là phân tích tìm ra các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của các tế bào ung thư gan Các phân tử chỉ thị này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh

tế bào, gây biến đổi ADN (protein PCNA, Ki-67, Mcm2, MIB1, MIA, và CSE1L/CAS); gen TP53 và phân tử liên quan đến MDM2; các protein khác tham gia điều khiển chu trình tế bào (cyclin A, cyclin E, cdc2, p27, p73); các gen gây ung thư và các thụ thể của chúng (ras, c-myc, c-fms, HGF, c-met, và erb-B); các yếu tố liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào (Fas và FasL) và sự hoạt động của các telomerase Một hướng nghiên cứu khác là tìm ra các chỉ thị phân tử liên

-15-

quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thư, các chỉ thị phân tử loại này gồm các phân tử bám dính (E-cadherin, catenins, các dạng CD44 khác nhau), các enzyme thủy phân protein làm giảm chất gian bào (MMP-2, MMP-9, Upa, Upar, PAI), các yếu tố sinh trưởng tham gia vào sự hình thành mạch giúp khối u phá vỡ

vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể [40]…

1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ THỊ UNG THƯ

GAN

1.3.1 Proteomics

Thuật ngữ “proteomics” lần đầu tiên được Marc Wilkins và cộng sự đưa ra năm 1994 đã mở ra một thời kỳ phát triển mạnh mẽ các nghiên cứu về protein Proteomics là ngành khoa học nghiên cứu hệ protein, tập hợp tất cả các protein được mã hóa và biểu hiện bởi hệ gen của cơ thể sinh vật [26]

Proteomics là một nhánh của nghiên cứu chức năng hệ gen, nó được sinh ra khi các nhà nghiên cứu về gen đối mặt với câu hỏi “chức năng của tất cả các protein

là gì ?” Proteomics có thể được định nghĩa là những nghiên cứu rộng rãi mọi mặt protein như là sự biểu hiện, những tương tác của protein trong tế bào cũng như việc

mô hình hóa protein Protein là sản phẩm của ARN thông tin, nó thực hiện phần lớn các phản ứng của tế bào và nó không có một mối quan hệ tuyến tính nào giữa mức

độ cấu trúc ARN thông tin và protein hay “proteome”trong tế bào Ngoài ra, hầu hết các đích tác dụng của thuốc là protein; do đó, các phương pháp để nghiên cứu có hiệu quả phức hợp protein trong tế bào có thể đóng vai trò trực tiếp cho việc phát

triển thuốc

Ngày nay, các nghiên cứu proteomics tập trung vào ba mặt chính là: nhận dạng protein, mô tả sự biểu hiện protein, mô hình hóa hệ thống và sự cải biến protein

-16-

- Nhận dạng protein là nhiệm vụ cơ bản của proteomics nhằm xác định tất cả các protein có trong mẫu nghiên cứu Mục đích của việc này là đưa ra một danh sách các protein hoàn chỉnh đã được biểu hiện trong thực tế chứ không phải là suy ra từ dữ liệu về biểu hiện gen

- Mô tả sự biểu hiện protein là việc xác định sự biểu hiện của các protein trong một thời điểm nhất định của tế bào, mô Mô tả protein thực chất

là một trường hợp đặc biệt của việc nhận dạng Ứng dụng phổ biến nhất là các phân tích sự khác biệt, trong đó có hai trạng thái riêng biệt của hệ được

so sánh với nhau Ví dụ như việc nghiên cứu so sánh các mô bình thường và

mô bệnh để xác định xem protein nào biểu hiện khác nhau trong các trạng thái đó Các protein biểu hiện khác nhau đó có thể trở thành chỉ thị sinh học của bệnh

- Mô hình hóa hệ protein là xác định xem các protein liên hệ như thế nào với các thành phần khác trong hệ thống sống Hầu hết các protein thực hiện chức năng của nó trong việc kết hợp chặt chẽ với các protein khác Nghiên cứu các tương tác này giúp xác định được chức năng của protein Mô hình hóa sự cải biến protein là nhiệm vụ xác định xem các protein biến đổi như thế nào Nói chung, nhiều cải biến sau dịch mã đã chi phối cấu trúc, chức năng và hoạt động của các protein

1.3.2 Hệ protein gan người

Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể người Gan có vai trò quan trọng trong các quá trình tiêu hóa, trao đổi chất và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein sinh chất, là vị trí có hiệu quả nhất để phân giải các chất ngoại sinh, cho quá trình thực bào đối với các chất rắn, tham gia bảo vệ bộ máy tiêu hóa và các bộ phận khác của

cơ thể Gan có vai trò chính trong việc xác định động dược học của thuốc, vì đây là

cơ quan chính để đào thải nhờ khả năng chuyển hóa và bài tiết của mật, và cũng là

1.3.3 Proteomics trong nghiên cứu ung thư gan

Tác hại của ung thư gan đối với sức khỏe con người và xã hội là vô cùng lớn Việc phân tích proteomics ung thư gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thư gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn nữa là đưa ra các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC Việc phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở việc xác định các chỉ thị trong mô, hay chỉ với nghiên cứu proteomics huyết tương Việc tìm kiếm các chỉ thị trong huyết tương kết hợp với nghiên cứu trên mô sẽ giúp chúng ta tiến gần hơn đến việc chẩn đoán ung thư một cách đơn giản và chính xác hơn chỉ với một xét nghiệm máu đơn giản Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics trên các dòng tế bào ung thư, phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung thư gan đã và đang được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu được một số kết quả khả quan [14]

Vì nguyên nhân chính của ung thư gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đối tượng là bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan Để

-18-

tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thư gan có tiền sử viêm gan

B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thư, các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thư bằng kĩ thuật điện di

2 chiều DIGE (điện di 2 chiều các mẫu khác nhau trên cùng một bản gel) Mẫu lấy

từ 12 bệnh nhân HCC có tiền sử viêm gan B được phân tích Hàm lượng protein tương đương từ 12 cặp mẫu (bệnh và bình thường) được trộn lại với nhau làm thành nội chuẩn và được đánh dấu bằng Cy2 trong khi đó mẫu ung thư và không ung thư được đánh dấu ngẫu nhiên bằng Cy3 hoặc Cy5 Tổng số 61 spot được xác định là biểu hiện tăng lên trong các mẫu ung thư trong khi đó 158 spot có biểu hiện giảm

Có 71 sản phẩm của gen đã được xác định từ những spot này Các thành viên của họ protein sốc nhiệt 70 và 90 có biểu hiện tăng, trong khi các protein chuyển hóa lại giảm ở bệnh nhân HCC Sự giảm các protein ti thể và protein peroxisom trong nghiên cứu này đưa ra cho chúng ta một gợi ý rằng có sự mất đi những chức năng chuyên biệt của cơ quan tử trong tế bào gan ung thư 4 enzyme chuyển hóa trong chu trình methyl hóa ở gan biểu hiện giảm ở các mô gan ung thư, biểu thị bằng sự thiếu hụt S-adenomethionine trong ung thư gan Hai sản phẩm của gen là glycerandehyde-3-phosphate dehydrogenase và formimidoyltransferase- cycledeaminase được xác định từ các spot biến đổi nghịch, từ đó chỉ ra rằng các đồng phân hoặc các dạng cải biến sau dịch mã của hai protein này có thể đóng vai trò khác nhau trong ung thư gan Nghiên cứu này lần đầu tiên chỉ ra rằng sự biểu hiện tăng của protein Hsp70/Hsp90 và các thể dị hợp ribonulceoprotein nhân C1/C2 trong các mô HCC là các chỉ thị ung thư, được khẳng định bằng Western blot và kĩ thuật nhuộm hóa miễn dịch tế bào ở 70 mẫu HCC [41]

Ung thư gan là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, nó tác động đến nhiều nước trong những năm gần đây Theo thống kê có khoảng 53% các trường hợp HCC trên thế giới có liên quan đến HBV Nguy cơ tiến triển thành HCC từ những người mang HBsAg cao gấp 25 37 lần so với những người không bị nhiễm [27] Khi các virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể sẽ làm cho cơ thể sinh ra các kháng thể chống lại chúng Bằng việc nghiên cứu sự biểu hiện các protein huyết

-19-

thanh của người bình thường, người nhiễm virus và người bị ung thư gan đã chỉ ra rằng sự tồn tại của từng kháng thể tự miễn này có liên quan với HCC và là yếu tố chẩn đoán sớm hiệu quả đối với các trường hợp viêm gan nguy cơ cao [25] Nghiên cứu được thực hiện trên huyết thanh của 37 bệnh nhân HCC và 31 trường hợp viêm gan B/C không bị HCC Huyết thanh lấy từ các bệnh nhân bị ung thư không phải HCC và 24 trường hợp khỏe mạnh được dùng làm đối chứng Có 8 loại protein tạo

ra đáp ứng thể dịch trong huyết thanh từ 70% trong tổng số 37 bệnh nhân trong nghiên cứu, với tỉ lệ biểu hiện của từng protein riêng biệt từ 11 27% Các kháng thể

tự miễn kháng β-tobulin, creatine kinase B, hsp60 và cytokeratin18 được phát hiện trong huyết thanh của các bệnh nhân viêm gan B/C, trong khi đó, kháng thể kháng calreticulin, cytokeratin8, F1-ATP synthase β-subunit và NDPKA chỉ thấy xuất hiện nhiều ở bệnh nhân HCC Calretibulin và một dạng bị cắt của nó (Crt32) đã được xác định là phổ biến nhất ở các bệnh nhân HCC với tần suất biểu hiện là 27%[25]

Việc lựa chọn nguồn bệnh nhân để lấy mẫu và cách lấy mẫu sinh phẩm là rất quan trọng, có vai trò quyết định đến kết quả của một nghiên cứu Năm 2003, Các nhà khoa học tại Seoul, Hàn Quốc tiến hành một phương pháp lấy mẫu độc đáo với 21 cặp mẫu (các mô ung thư và các mô không ung thư xung quanh gan) được lấy từ 21 bệnh nhân ung thư gan Các bệnh nhân này được chia ra làm 3 dạng HCC bởi các chỉ thị virus: 7 HBsAg dương tính (HCC dạng B), 7 anti-HCV dương tính (HCC dạng C) và 7 HBsAg và anti-HCV âm tính Protein tổng số được phân tích bằng điện di 2 chiều và khổi phổ MALDI-TOF-MS và những thay đổi trong hệ protein đã được chỉ ra Kết quả nghiên cứu cho thấy có 60 protein có mức

độ biểu hiện khác nhau giữa các mẫu ung thư và không ung thư, trong số đó 14 protein bị thay đổi trong cả 3 dạng HCC, trong khi đó, 46 protein lại là chỉ thị đặc hiệu về virus Tóm lại, các protein đã xác định được phân loại theo tác nhân virus

có liên quan đến HCC dạng B và C Các kết quả này chỉ ra một cách rõ ràng rằng

sự biểu hiện của hệ protein của các mô trong HCC liên quan mật thiết với các yếu

tố gây bệnh và cơ chế ung thư gan có thể diễn ra khác nhau do các yếu tố HBV và HCV [21]

-20-

Cũng trên đối tượng các bệnh nhân ung thư gan có tiền sử viêm gan B, tháng

4 năm 2008, Min He và cộng sự [16] đã công bố kết quả nghiên cứu phát hiện và xác định NAP-2 như là một chỉ thị sinh học của ung thư gan liên quan đến viêm gan

B bằng kĩ thuật proteomic Nghiên cứu được tiến hành trên 81 bệnh nhân HCC có tiền sử HBV và 33 người khỏe mạnh với kĩ thuật SELDI-TOF-MS đã mô tả hệ protein của các mẫu huyết thanh

Năm 2006, nhóm các nhà khoa học Mỹ đứng đầu là Mary Ann Comunale đã tiến hành phân tích proteomic các glycoprotein huyết thanh bị fuco hóa trong giai đoạn đầu ung thư gan Các tác giả đã chỉ ra rằng với sự gia tăng các mức độ fuco hóa có thể được quan sát qua phân tích polysaccharide với huyết thanh tổng số và

có liên quan đến sự tiến triển HCC Như đã biết AFP là một chỉ thị sinh học trong ung thư gan (trên 50ng/mL gặp ở 30 60% trường hợp HCC tại thời điểm chẩn đoán), tuy vậy, AFP thường biểu thị không đầy đủ ở những mô nhỏ Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã tiếp cận phương pháp glycoproteomics để xác định các glycoprotein huyết thanh liên quan tới tiến triển ung thư và GP73 đã được phát hiện với mức độ gia tăng trong các đối tượng HCC Protein này đã được phân tích

kĩ và được chỉ ra như là một chỉ thị HCC tốt hơn AFP ở người Ngoài ra, người ta còn phát hiện ra một dạng đồng phân khác của AFP khi bị fuco hóa là DCP (Desgamma carboxyprothrombin) cũng liên quan đến HCC [30]

Nhằm làm rõ hơn bằng chứng về sự biểu hiện của đáp ứng miễn dịch cơ thể, bằng việc chỉ ra sự xuất hiện các kháng thể tự miễn tương tác với các kháng nguyên

mô ở người bị ung thư Nghiên cứu của Paradis và cộng sự (2007) với mục đích đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên liên quan đến khối u trong huyết thanh (tumor-associated antigens-TAAs) trong chẩn đoán ung thư gan Các tác giả đã sàng lọc huyết thanh của 142 bệnh nhân HCC bằng việc sử dụng 8 TAAs chọn trước (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, Cyclin B1, surviving và p16) không liên quan đến các

mô gan Các TAAs được định lượng bằng ELISA trên mẫu huyết thanh và được so sánh giữa một nhóm HCC và một nhóm huyết thanh bình thường Nghiên cứu này

-21-

đã giải quyết vấn đề miễn dịch ung thư từ đó cho ph p phân tích toàn diện các kháng thể tương tác với các kháng nguyên trong một khối u và đánh dấu cho sự phát triển trong nghiên cứu chỉ thị sinh học bệnh đặc biệt là ung thư [37]

Năm 2010, Pleguezuelo và các cộng sự tại đại học Reina Sofia Cordoba Tây Ban Nha đã tiến hành nghiên cứu nhận dạng chỉ thị mới của ung thư gan bằng phương pháp proteomics Các bệnh nhân HCC với 3 nguyên nhân chính là nhiễm virus viêm gan B, viêm gan C và do rượu Mẫu được phân tích bằng điện di hai chiều để xác định các protein có biểu hiện khác biệt Các protein được phân tách trên một thanh trip có gradient pH từ 3 đến 10 và điện di biến tính với SDS Phân cắt protein bằng trypsin và phân tích nhận dạng peptide Kết quả là 3 apolipoprotein biểu hiện khác biệt đã được nhận dạng: Apo-A1, Apo-A4 và Apo-E Apo-A4 có biểu hiện thấp hơn ở bệnh nhân HCC so với mẫu không có HCC Nhiều ý kiến cho rằng Apo-A4 và Apo-A1 là các nhân tố độc lập liên quan đến chẩn đoán HCC Nghiên cứu đưa ra kết luận rằng Apo-A4 và Apo-A1 có thể được sử dụng như một chỉ thị có độ nhạy và đặc hiệu cao với HCC [29]

Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây khối u ác tính gây tử vong cao Tỷ lệ mắc HCC ở Hoa Kỳ đang gia tăng Matos và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu proteomics ung thư gan của người Mỹ Khối u và mô từ ba bệnh nhân HCC người Mỹ bị viêm gan và không liên quan đến viêm gan đã được phân tích để tìm sự khác biệt phổ biến trong biểu hiện protein Protein đã được phân tách bởi điện di 2D (gel 10% SDS-PAGE) Gel đã được cố định và sau đó nhuộm màu với xanh Coomassie Số hóa và xử lý được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm PDQuest Sử dụng kiểm định t-student để phát hiện

sự thay đổi protein giữa khối u mà mô lành của tất cả các cặp mẫu với xác suất P < 0,01 Kết quả thu được với 19 spots biểu hiện khác biệt có ý nghĩa ( 2 lần) Trong

số 19 spots, 9 spots biểu hiện tăng và 10 biểu hiện giảm ở u Các protein biểu hiện tăng bao gồm: beta-5-tubulin, beta-actin, vimentin, carbamoyl-phosphate, synthetase-1, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, serum albumin, catalase,

-22-

autoimmune regulator, and transcription factor, ets Các protein biểu hiện giảm bao gồm: BiP protein, A-kinase anchoring protein 18 gamma, inorganic pyrophosphatase, keratin 8, repulsive guidance molecule, butyrophilin, superoxide dismutase, TSA, heat-shock 70-kDa protein 9B, and hemoglobin alpha-2 Đặc biệt, các protein tự miễn dịch được biểu hiện cao 14 lần trong mô khối u, cho thấy nó có thể có một vai trò trong HCC Xác nhận và tiếp tục điều tra về những thay đổi protein này có thể dẫn đến việc phát hiện ra phân tử chỉ thị mới [19]

Trong dự án tin sinh học proteomic, Kondo đã chỉ ra rằng 23 protein xuất hiện trở lại khi tái phát ung thư gan sau phẫu thuật Hơn nữa, khi tập trung vào những khác nhau về tế bào học, tác giả đã chỉ ra rằng APC gắn protein EB1 là một chỉ thị sinh học mới cho tiên lượng HCC Protein EB1 liên quan đến con đường dẫn truyền tín hiệu có biểu hiện khác thường ở bệnh nhân HCC và ung thư thực quản Kiểm tra hóa miễn dịch tế bào sự biểu hiện EB1 sẽ giúp xác định các trường hợp có nguy cơ tái phát cao và tác động điều trị có thể được cải thiện thông qua theo dõi và điều trị bệnh [23]

1.3.4 Nghiên cứu hệ protein ty thể

Ty thể được xem như là cái đích lý tưởng cho việc phân tích hệ protein vì chúng có độ phức tạp không cao và có nguồn gốc từ các tế bào prokaryote Ngoài

ra, người ta còn thấy vai trò của chúng trong rất nhiều các rối loạn, gây lên nhiều các bệnh tật khác nhau Ngoài chức năng tạo nguồn năng lượng sinh học, ty thể tham gia điều hòa quá trình gây chết của tế bào, điều chỉnh ổn định nội môi ion, oxy hóa các hydrate cacbon và axit béo, tham gia trong nhiều quá trình đồng hóa và dị hóa khác nhau Vì vậy, rối loạn chức năng của ty thể có thể gây những hậu quả nặng

nề, từ những khuyết tật trong chuyển hóa năng lượng đến các bệnh lý có nguyên nhân phức tạp, bao gồm cả bệnh Alzheimer, Parkinson, ung thư, đái tháo đường typ

2, tim mạch và viêm khớp xương mạn tính Sự liên quan của ty thể với các bệnh phát sinh kể trên đã và đang hướng những nghiên cứu thực nghiệm vào xác định hệ

Ty thể là bào quan phổ biến trong gan Mỗi tế bào gan có hàng nghìn ty thể Trong ung thư gan, sự rối loạn chức năng ty thể có thể có những mối liên quan trực tiếp đến bệnh Đặc biệt ty thể có một vai trò quan trọng trong con đường hoạt hóa apoptosis nội bào Những sai hỏng trong con đường apoptosis có khả năng cho tế bào được sống sót, góp phần gây nên tình trạng ác tính của u Quan trọng hơn nữa là

sự thay đổi biểu hiện và những đột biến trong quá trình apoptosis liên quan tới các protein có trong các cơ chế quan trọng làm cho các u trở lên kháng thuốc Vì vậy, vai trò chủ chốt của con đường apoptosis trong sự phát triển ung thư và đáp ứng điều trị cho thấy rằng các protein ty thể có liên quan đến quá trình này có khả năng như là các chỉ thị sinh học chẩn đoán ung thư

Các protein có liên quan đến quá trình apoptosis thông qua ti thể thường xuyên được nghiên cứu để được đánh giá là các chỉ thị sinh học trong ung thư Cụ thể, là những chất điều hòa chủ chốt của con đường này, các phân tử họ Bcl-2 được nghiên cứu thường xuyên như các chỉ thị sinh học apoptosis trong nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư gan

Những sai hỏng chức năng của ty thể được cho là có vai trò quan trọng trong

sự phát triển của ung thư Hơn 70 năm trước, Warburg [44] đã mở đường cho việc nghiên cứu những biến đổi trong vai trò hô hấp nội bào của ty thể đối với ung thư

và đã đề xuất ra một cơ chế để giải thích quá trình phát sinh ung thư Trong một loạt các bài báo, ông đã đưa ra giả thiết rằng sự kiện chìa khóa trong việc phát sinh ung thư là sự phát triển của một “tổn thương” trong bộ máy hô hấp nội bào, dẫn đến sự

-24-

tăng sinh bù lượng ATP glycolytic Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lượng của mình bằng cách sản xuất một phần lớn ATP của mình thông qua cơ chế glycolytic hơn là thông qua phosphoryl hóa oxy hóa Do sự sản sinh ATP glycolytic kém hiệu quả, điều này phần nào phản ánh cơ chế trao đổi chất duy nhất của các tế bào ác tính và điều đó sẽ yêu cầu tiêu thụ một lượng lớn glucose để đáp ứng nhu cầu năng lượng của tế bào Điều này xảy ra trái ngược ở nhiều tế bào bình thường, các tế bào sử dụng phosphoryl hóa oxy hóa như là cách chủ yếu để tổng hợp ATP với hiệu suất cao Sự khác biệt trong chuyển hóa năng lượng giữa các

tế bào ung thư và các tế bào bình thường tạo thành một cơ sở hóa sinh để suy đoán rằng các hướng điều trị có thể được phát triển để chọn lọc tiêu diệt các tế bào ung thư trong trạng thái tổn thương hô hấp tế bào

Kể từ khi ấn phẩm phẩm đầu tiên của Warburg được xuất bản hơn nửa thế kỷ trước, một số bệnh ung thư liên quan đến khuyết tật ti thể đã được xác định và được

mô tả trong các tài liệu Những khiếm khuyết bao gồm thay đổi biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị chuỗi hô hấp và các enzym glycolytic, giảm quá trình oxy hóa các chất NADH được liên kết, cũng như đột biến ADN ti thể (mtDNA) Trong khi có nhiều báo cáo về các hiện tượng, các cơ chế chịu trách nhiệm về việc bắt đầu

và tiến triển của đột biến mtDNA, vai trò của nó trong sự phát triển của bệnh ung thư, và tiến triển bệnh vẫn còn chưa được làm sáng tỏ [20]

Hơn 300 triệu người đang bị nhiễm mạn tính với virus viêm gan B, và nhiều người trong số này có khả năng phát triển thành ung thư gan HBV mang 7 protein virus, trong đó có protein không có cấu trúc X (nonstructural X) (HBx) Các kết quả nghiên cứu với các tế bào bất tử hay các tế bào chuyển gen và với HBx của chuột biến đổi gen đã chứng minh rằng HBx có thể tương tác với các ty thể Tuy nhiên, không có những nghiên cứu mô tả chính xác vị trí HBx trên ty thể hay ảnh hưởng của nó đến các trạng thái sinh lý của ty thể Clippingen và cộng sự [6] đã tiến hành nuôi cấy tế bào gan chuột mô hình đặc trưng để mô tả trí của HBx ti thể và ảnh hưởng của nó về mặt sinh lý học Kết quả, đã cho thấy sự định vị của HBx với mật

-25-

độ cao và liên kết với màng ngoài ty thể Họ đã chứng minh rằng HBx có khả năng điều hòa màng ti thể trong các tế bào gan và chức năng này của HBx thay đổi tùy theo tình trạng hoạt động của NF-αB Trong các tế bào gan chuột sơ cấp, sự hoạt hóa HBx của NF-αB ngăn cản sự khử cực màng ti thể, tuy nhiên, khi hoạt động của NF-αB bị ức chế, HBx gây sự khử cực màng thông qua sự điều khiển tính thấm lỗ

ti thể Tóm lại, các kết quả này xác định con đường tiềm năng mà qua đó có thể kích hoạt HBx để điều chỉnh quá trình sinh lý của ti thể, do đó làm thay đổi nhiều hoạt động tế bào và cuối cùng góp phần vào sự phát triển các nghiên cứu ung thư gan liên quan đến HBV

1.3.5 Nghiên cứu hệ protein microsome

Microsome là những túi tiết được hình thành từ mạng lưới nội chất khi các tế bào eukaryote bị phá vỡ Ở điều kiện bình thường microsome không tồn tại trong các tế bào sống Microsome có thể được tách và thu lấy từ những mảnh vỡ tế bào bằng cách ly tâm Các tế bào không vỡ, nhân, và ty thể sẽ bị lắng xuống ở khoảng 11.000g, trong khi các enzyme hòa tan và lưới nội chất chứa cytochrome P450 vẫn còn trong dung dịch Khi sử dụng máy siêu ly tâm tốc độ lên tới 100.000g các microsome bị lắng xuống thành cặn còn các enzyme hòa tan thì vẫn nổi trên mặt Bằng cách này microsome được tách ra Microsome thu được có màu nâu đỏ do sự

có mặt của các cofactor có chứa sắt, nhân heme trong enzyme P450 có rất nhiều trong gan của người và động vật

Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao đổi chất của các hợp chất và kiểm tra các tương tác thuốc Các nhà nghiên cứu thường chọn microsome dựa trên mức độ hoạt động đặc trưng của các enzyme CYP

Năm 2008 Nakamura và cộng sự [22] đã tiến hành nghiên cứu proteomic microsome trên mô gan chuột thí nghiệm được thực hiện bằng sự kết hợp các kỹ thuật điện di biến tính 1 chiều và sắc ký lỏng nano kết hợp với khối phổ (nano-LC-MS/MS) để nghiên cứu hệ protein màng Hơn 100 protein đã được nhận dạng bằng

-26-

phân tích khối phổ, và hầu hết các protein trong đó đã được chỉ ra là có liên quan với các protein màng như microsomal glutathione S- transferase 1, cytochrome P-

450 và một số ít các protein liên quan đến thụ thể lipoprotein

Trong microsome thì hệ cytochrome P450 (CYP) là hệ protein được quan tâm nhất Hệ protein này tham gia vào sự khử độc và đáp ứng thuốc trong tế bào

Do đó, việc nghiên cứu hệ protein microsome giúp chúng ta tiến gần đến việc dự đoán và điều trị thuốc cho các vấn đề bệnh lý

Năm 2006, Aderson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích proteomics so sánh đáp ứng của CYP trong mô gan chuột xử lý vơi 1,4-bis-2- (3,5-dichloropyridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán đáp ứng của thuốc Trong nghiên cứu này, họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics P450 của gan chuột dưới tác động của TCPOBOP Phương pháp nghiên cứu gồm thu microsome bằng ly tâm, phân tách các protein microsome bằng phương pháp điện di, phân cắt protein bằng enzyme trypsin, và đánh dấu đồng vị 18O/16O, sau đó nhận dạng các peptide bằng kỹ thuật khối phổ nano-LC-MS/MS và LC-MS 17 protein trong họ P450 đã được xác định Tất cả các P450 phát hiện ra được nhận dạng một cách rõ ràng ngoại trừ CYP2A4/2A5 Trong đó CYP1A2, -2A4 /5, -2B10, -2B20, -2C29, -2C37, -2C38, -3A11, và -39A1 có biểu hiện tăng và CYP2C40, -2E1, -3A41, và -27A1 có biểu hiện giảm so với đối chứng Sự biểu hiện khác biệt của các protein này cho ta thấy CYP đã có những đáp ứng với thuốc và việc nghiên cứu hệ protein microsome có thể giúp ta nghiên cứu những đáp ứng với độc chất trong tế bào [5]

Việc phân tích hệ protein microsome trong những biến đổi của bệnh ung thư gan vẫn chưa được tiến hành nhiều Tuy nhiên, với vai trò của nó trong việc đáp ứng với những thay đổi trong tế bào thì việc nghiên cứu hệ protein microsome hứa hẹn sẽ đem lại những kết quả tốt cho việc tìm các chỉ thị cho bệnh và tiến đến chẩn đoán phát hiện sớm ung thư đặc biệt là với ung thư gan

-27-

1.3.6 Nghiên cứu proteomics ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay, nhà nước đã đầu tư kinh phí để xây dựng các Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia với các thiết bị nghiên cứu proteomic tiên tiến được trang bị Cho đến nay, có 3 Phòng thí nghiệm như thế đã được đưa vào triển khai hoạt động tại Viện Công nghệ Sinh học (năm 2002), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội (năm 2004) và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học thuộc Học Viện Quân Y (năm 2006) Tại các Phòng thí nghiệm này, các nghiên cứu proteomic đã được triển khai và đã bước đầu đạt được những kết quả nhất định

Bằng cách sử dụng sắc ký lỏng Nano đa chiều và hệ khối phổ liên tục, Vũ Minh Thiết và cộng sự [4] đã xác định được hơn 900 trình tự protein có trong mẫu huyết thanh người như các tác nhân đông máu, bổ thể, các protein gắn kết, vận chuyển, các loại enzym, các loại protease và chất ức chế protease, các loại cytokine, các protein thụ thể v.v

Tiếp cận theo hướng phân tích proteomic, Trịnh Hồng Thái và cộng sự (2005) đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ để phân tích proteomic huyết tương người bị bệnh leukemia cấp dòng tủy [42] Bằng việc so sánh các bản gel điện di hai chiều, nhóm nghiên cứu đã nhận ra 12 protein biểu hiện khác nhau trong đó có một số là chất chỉ thị ung thư Trong số các protein này có enzym ADN topoisomerase được biểu hiện tăng lên ở người bị leukemia cấp dòng tủy, enzym này đã được chứng minh có liên quan tới sự chuyển vị NST 8;21 trong bệnh này Tiếp theo nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phân tách được trung bình

600 spot protein trên các bản gel điện di huyết tương các thể bệnh leukemia cấp dòng tủy Phân tích so sánh đã chỉ ra được 2 protein chỉ xuất hiện ở người bình thường mà không có ở các bản gel bệnh, 4 spot protein chỉ có mặt trên các bản gel bệnh mà không tìm thấy trên mẫu đối chứng [17] Để mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các thể bệnh leukemia, nhóm nghiên cứu này đã có một số nghiên cứu như

-28-

năm 2006 Trịnh Thị Thanh Hương và Trịnh Hồng Thái [17]đã công bố kết quả phân tích proteomic huyết tương người bệnh leukemia cấp dòng lympho Trong kết quả này, sự khác biệt trong biểu hiện protein giữa mẫu đối chứng và các thể bệnh cũng được phát hiện Trong báo cáo gửi hội nghị proteomics năm 2008, Nguyễn Minh Đức và Trịnh Hồng Thái đã đưa ra kết quả “phân tích proteomic tế bào máu tủy của bệnh nhân leukemia” Nghiên cứu này đã nhận ra được 44 protein biểu hiện khác biệt giữa bệnh nhân và người bình thường Đặc biệt, trong nghiên cứu này chú

ý đến 2 protein Cdk 6 và BAX có thể có giá trị cao trong việc nghiên cứu chỉ thị bệnh [12]

Ngoài ra cũng tại hội nghị proteomics năm 2009, Ngô Thị Mai, Hoàng Thị Thùy Dung và Trịnh Hồng Thái [28] cũng đã công bố kết quả nghiên cứu “phân tích proteomic gan của gia cầm ở vùng bị rải chất độc hóa học dioxin (Mã Đà, Đồng Nai)” Với việc phát hiện nhiều protein có biểu hiện bất thường đã được chứng minh là có liên quan đến đáp ứng của sự phơi nhiễm TCDD, sự biểu hiện tăng của các protein hệ thống miễn dịch trong cơ thể một số động vật nghiên cứu đã góp phần chứng minh rằng tại vùng Mã Đà, Đồng Nai đã có những nhân tố trong môi trường ảnh hưởng không tốt đến hệ protein sinh vât

Ung thư gan là một căn bệnh hiểm nghèo phổ biến ở nước ta Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu proteomics ung thư, đặc biệt là ung thư gan, tuy nhiên, ở Việt Nam hiện rất ít nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích proteomics mô gan ở bệnh nhân ung thư gan Do vậy, trong đề tài này chúng tôi đã

sử dụng phương pháp proteomics để bước đầu phân tích hệ protein mô gan ung thư,

so sánh với mô gan bình thường trên cùng một bệnh nhân nhằm tìm ra những protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này

-29-

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí khối u của bệnh nhân ung thư tế bào gan Mẫu đối chứng là mô gan lành cách 5cm trên lá gan đó tại vị trí không có khối u

Mô gan sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức cung cấp Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80OC

2.1.2 Hóa chất

Bảng 1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Biorad – Mỹ

Các peptide chuẩn (Insulin

B, Angiotensin II, chất nền

CHCA)

Sigma Aldrich – Mỹ

CHAPS, DTT, IAA, Ure, Thioure

Biorad – Mỹ

Tất cả các hóa chất khác được sử dụng đều có độ sạch phân tích, một số hóa chất dùng cho phân tích gel điện di hai chiều, khối phổ đạt độ sạch phân tích khối phổ

-30-

2.1.3 Thiết bị

Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad – Mỹ)

Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf

Hệ thống phân tích hình ảnh với phần mềm chuyên dụng phân tích bản gel

điện di hai chiều Phoretix (Shimadzu Nhật Bản)

Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA-CRFPLUS(KRATOS Anh)

ANALYTICAL-Ngoài ra, các dụng cụ và trang thiết bị khác của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein cũng được sử dụng trong nghiên cứu này

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý mẫu mô gan

Mẫu mô gan bình thường và bệnh được lấy ra từ tủ -800C, cân 2 mẫu với lượng tương đương cho vào hai cối sứ riêng biệt gồm một mẫu bệnh và một mẫu đối chứng

0,3g mẫu gan được cắt nhỏ bằng k o, sau đó được nghiền bằng chày sứ cho đến khi nhuyễn thì cho 1,5ml đệm phosphate 0,05M, pH7,4 Lấy xilanh có đầu kim với đường kính 0.5mm hút dịch lên xuống trong khoảng 5 phút cho đến khi thấy dịch đồng nhất Dịch này được ly tâm 1000g trong 10 phút ở 40C thu dịch nổi Dịch nổi được đem ly tâm 14.000g trong 15 phút ở 40C thu lấy cặn Cặn này chứa chủ yếu là các bào quan ty thể Sau đó cặn này được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65mM DTT Phần dịch nổi còn lại được đem đi siêu ly tâm 105.000g trong 70 phút ở 4oC thu lấy phần cặn Trong cặn này chứa phần lớn là microsome, cặn này cũng được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65Mm DTT Cả hai mẫu trên sau khi hòa tan trong đệm được điện di biến tính một chiều để kiểm tra protein trước khi tiến hành điện di hai chiều

-31-

2.2.2 Điện di hai chiều

Để đảm bảo tính đồng nhất về lượng protein giữa các mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford trước khi chạy điện di hai chiều

Điện di hai chiều được bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip bằng đệm Rehydration có chứa protein, dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip Lượng protein tối

đa mà sợi gel IPG strip pH 4-7 dài 17cm có thể thấm được là 405µg Sau 1 giờ thanh strip được đưa vào thiết bị chạy điện di đẳng điện

Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell Mỹ) Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 4 bước theo bảng sau

(Biorad-Bảng 2 Các bước chạy điện di đẳng điện

Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS PAGE) Kết thúc điện di chiều hai, các protein được cố định 45 phút trong dung dịch chứa 1,3% acid phosphoric, 20% methanol, sau đó nhuộm bằng Coomassie G-

(SDS 32-

250 qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988) Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein

2.2.3 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều

Đầu tiên bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản ) Sau đó hình ảnh bản gel được phân tích bằng phần mềm này Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot Dựa vào cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel (được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100), vị trí và thể tích của spot được xác định và có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng

Sau khi phân tích bằng hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot xuất hiện trên bản gel này mà không xuất hiện trên bản gel kia hay các spot biểu hiện tăng, giảm khác nhau giữa hai bản gel Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định được các spot protein cần để phân tích tiếp theo

2.2.4 Cắt và thủy phân spot

Các spot protein được quan tâm trên bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel, tẩy màu và thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ gồm các bước cụ thể như sau:

- Cắt spot ra khỏi bản gel

-33-

- Cho enzyme trypsin vào các spot và ủ ở 370C trong 4 giờ để cắt các phân tử protein thành các peptide và chúng có thể chui ra khỏi gel Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip theo quy trình:

- Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có TFA 0.1% trong acetonitrile

- Cân bằng Ziptip bằng dung dịch chứa 0.1 % TFA

- Hấp phụ peptide trong dịch thủy phân vào Ziptip

- Loại muối bằng 0.1% TFA

- Thôi peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch 0.1%TFA, 70% acetonitrile

- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (0.5% CHCA trong 0.1% TFA, 70% acetonitrile)

2.2.5 Phân tích khối phổ và nhận dạng protein

Mẫu peptide đƣợc phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046.54 Da) và Insulin oxidized B (Mw 3494.65 Da)

Tiến hành phân tích khối phổ MALDI-TOF để xác định khối lƣợng của các peptide của mỗi protein Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm:

-34-

- Phân loại: Homo sapiens

- Enzyme: Trypsin

- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C)

- Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)

- Giá trị khối: MH+

- Độ sai lệch cho phép: 1 amino acid

2.2.6 Xây dựng cây chủng loại phát sinh

Để xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa vào trình tự amino acid của protein chúng tôi tiến hành theo các bước sau:

Bước 1: Lựa chọn trình tự protein nghiên cứu

Bước 2: Sử dụng chương trình Blastp để so sánh trình tự amino acid của protein cần phân tích với các protein trong ngân hàng dữ liệu

Bước 3: Lựa chọn các trình tự tương đồng với trình tự cần phân tích từ kết quả BLAST Lưu tệp tin bằng Notepad

Bước 4: Thực hiện phân tích so sánh nhiều trình tự bằng phần mềm ClustalX2 (lần 1)

- Chương trình ProML sử dụng mô hình xác suất của Jones-Taylor-Thornton hoặc Dayhoff về sự thay đổi giữa các amino acid Giả thuyết của mô hình này là:

+ Mỗi vị trí trong trình tự tiến hóa độc lập với nhau

-35-

+ Các loài khác nhau tiến hóa độc lập

+ Mỗi vị trí này trải qua sự thay thế với một tỷ lệ mong đợi được lựa chọn từ một dãy tỉ lệ

+ Tất cả các vị trí thích hợp trong trình tự đã thay đổi hoặc không thay đổi sẽ cung cấp thông tin cho cây chủng loại phát sinh

+ Xác suất thay đổi giữa các amino acid theo mô hình Jones, Taylor, và Thornton (1992) hoặc mô hình PAM của Dayhoff (Dayhoff và Eck, 1968; Dayhoff

et al., 1979)

- Chương trình PROTPARS sử dụng phương pháp trung gian giữa Eck và Dayhoff (1966) và Fitch (1971) Theo Eck và Dayhoff (1966), bất kỳ amino acid nào đều có thể thay đổi thành amino acid khác, và tính số lượng những thay đổi cần thiết để tiến hóa các trình tự protein tạo ra trên cây phát sinh chủng loại Sự thay đổi này cho phép thay thế các mã di truyền không bảo thủ bằng các mã bảo thủ khác

Để vẽ một nhánh khác, tính số nucleotide nhỏ nhất cần thay thế để tạo thành một trình tự protein mới

Giả thuyết của chương trình này là:

+ Sự thay đổi các vị trí khác nhau là độc lập

+ Sự thay đổi các loài khác nhau là độc lập

+ Xác suất thay đổi một base dẫn đến thay đổi trình tự amino acid là nhỏ hơn độ dài thời gian tiến hóa trên một nhánh của cây phát sinh

+ Số thay đổi dự kiến trong các nhánh khác nhau của cây phát sinh không thay đổi bởi hai thay đổi có tỷ lệ chia nhánh cao hơn, có thể xảy ra hơn một thay đổi trong tỷ lệ chia nhánh thấp

+ Số thay đổi dự kiến không đủ để biến đổi giữa các vị trí, mà hai thay đổi trong một vị trí có thể lớn hơn một thay đổi khác