Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)

Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Ngô Thị Hà PHÂN TÍCH PROTEOMIC MÔ GAN CỦA NGƢỜI BỊ UNG THƢ GAN NGUYÊN PHÁT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 -1- MỞ ĐẦU Ung thƣ gan năm dạng ung thƣ phổ biến giới, đứng hàng thứ ba nguyên nhân gây chết ung thƣ toàn cầu Cơ hội sống sót bệnh nhân mắc ung thƣ gan thấp, tỷ lệ sống sót khoảng 36%, đặc biệt số nơi tỷ lệ 17% sau đến năm đƣợc chẩn đoán mắc bệnh [31] Hàng năm có khoảng 600.000 ngƣời đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ gan gần số số lƣợng ngƣời chết năm [36] Từ số cho thấy thực tế việc chẩn đoán điều trị ung thƣ gan giới gặp nhiều khó khăn Proteomics công cụ số phân tích hệ protein thể sinh vật Kỹ thuật proteomics đƣợc áp dụng cho nghiên cứu thị sinh học bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ phổi, ung thƣ quản, ung thƣ vòm họng, ung thƣ gan, ung thƣ máu Việc nghiên cứu kỹ thuật proteomics ngày đƣợc mở rộng, đem lại kết ngày lớn ứng dụng sinh học, y học, dƣợc học nghiên cứu chế trình sinh học [39] Ung thƣ gan nguyên phát dạng ung thƣ xuất phát từ tế bào gan chiếm đến 90% trƣờng hợp ung thƣ gan Nhiễm virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) mạn tính xơ gan đƣợc cho nguyên nhân dẫn đến ung thƣ gan [35] Việt Nam nƣớc có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao nhiễm HBV HCV Do đó, việc phát sớm ung thƣ gan quan trọng việc điều trị loại ung thƣ Thực luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích proteomic mô gan người bị ung thư gan nguyên phát” với mục đích:  Phân tích protein ty thể, microsome phần lại tế bào tách từ mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan -2-  Phân tích so sánh biểu protein ty thể, microsome phần lại mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan nhằm tìm protein đặc trƣng có liên quan đến bệnh Đề tài đƣợc thực phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội -3- Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ GAN Ung thƣ gan bệnh lý ác tính phổ biến giới Bệnh khó chẩn đoán, tiên lƣợng xấu, tỷ lệ tử vong cao tử vong thời gian ngắn kể từ phát Trong năm 2008 ƣớc tính có 12 triệu trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ, triệu ngƣời chết khoảng 25 triệu ngƣời sống chung với ung thƣ giới Tại Mỹ, năm 2009 ƣớc tính có 22.620 trƣờng hợp đƣợc chuẩn đoán mắc ung thƣ, 18.160 ngƣời chết Ung thƣ gan (UTG) gồm hai loại nguyên phát thứ phát Dạng nguyên phát hình thành từ mô gan, dạng thứ phát tạo nên tế bào từ quan khác thể di thông qua máu, hạch bạch huyết tới gan tạo khối u (nên gọi ung thƣ gan di căn) Dƣới kính hiển vi, tế bào ung thƣ di gan nhìn giống nhƣ tế bào ung thƣ mà chúng xuất phát Do đó, phạm vi khoá luận này, xin đề cập đến ung thƣ gan nguyên phát với dạng ung thƣ phổ biến ung thƣ biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [52] 1.1.1 Phân loại ung thƣ gan nguyên phát Các khối u ác tính nguyên phát gan phát sinh từ thành phần biểu mô biểu mô, ung thƣ biểu mô loại hay gặp nhất, chiếm vị trí quan trọng bệnh học UTG Dựa vào đặc điểm hình thái sinh hoá tế bào, UTG nguyên phát đƣợc phân loại thành dạng sau [3]: - Ung thƣ biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma – HCC) dạng ung thƣ ác tính xuất phát từ tế bào gan, chiếm khoảng 90% dạng UTG nguyên phát Bệnh nhân mắc HCC có nguy tử vong cao - Ung thƣ biểu mô đƣờng mật (Cholangio carcinoma) dạng có khối u ác tính gan bao gồm tế bào giống tế bào biểu mô đƣờng mật Bệnh thƣờng gặp lứa tuổi cao so với ung thƣ tế bào gan, trung bình khoảng -4- 65 tuổi Dạng chia thành thể thể ngoại vi thể trung tâm - Ung thƣ hỗn hợp tế bào gan – đƣờng mật (hepatocholangiocarcinoma) dạng mang đặc điểm mô bệnh học hai loại nói trên, nói chung gặp - Ung thƣ nguyên bào gan (hepatoblastoma) dạng thƣờng gặp trẻ em, ngƣời trƣởng thành - Ung thƣ nội mạch máu dạng biểu bì (Epithelioid hemangioendothelioma) loại đƣợc mô tả, thƣờng gặp tuổi 50, 2/3 số trƣờng hợp phát phụ nữ 1.1.2 Các giai đoạn ung thƣ gan Ung thƣ gan đƣợc chia làm giai đoạn:  Trong giai đoạn I, có khối u không lây lan sang mạch máu gần  Trong giai đoạn II, có khối u lan mạch máu gần đó; nhiều khối u, không số lớn cm  Giai đoạn III đƣợc chia thành giai đoạn IIIA, IIIB, IIIC; Trong giai đoạn IIIA, điều sau đƣợc tìm thấy: nhiều khối u lớn cm khối u lan rộng đến chi nhánh mạch máu gần gan Trong giai đoạn IIIB, có hay nhiều khối u kích thƣớc mà có hai: lây lan đến quan lân cận khác với túi mật, bị hỏng thông qua màng khoang phúc mạc Trong giai đoạn IIIC, ung thƣ lan đến hạch bạch huyết gần  Trong giai đoạn IV, ung thƣ lan tràn vƣợt gan đến nơi khác thể, chẳng hạn nhƣ xƣơng hay phổi Các khối u có kích thƣớc lan mạch máu gần hạch bạch huyết [53] -5- 1.1.3 Nguyên nhân ung thƣ gan Mỗi tác động xấu làm tăng nguy mắc bệnh ung thƣ Các bệnh ung thƣ khác có tác nhân gây bệnh khác Ví dụ, để da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời mạnh tác nhân dẫn đến ung thƣ da Hút thuốc tác nhân dẫn đến ung thƣ phổi, miệng, quản, bàng quang, thận, nhiều quan khác Nhƣng việc có một, hay có vài tác nhân nghĩa ngƣời mắc bệnh Các nhà khoa học tìm thấy số tác nhân làm tăng khả dẫn đến ung thƣ biểu mô tế bào gan UTG đƣợc xem biến chứng phổ biến bệnh mãn tính thƣờng gặp gan Chúng thƣờng đƣợc gặp nhiều độ tuổi khác nhau, hàng năm có khoảng 5,5–14,9/100.000 ngƣời mắc bệnh ƣớc tính khoảng 600.000 – 1.000.000 ca tử vong [31] Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh khác nhiều tuỳ theo khu vực địa lý giới, phƣơng Đông phƣơng Tây Khu vực có tỷ lệ phát bệnh cao Đông Á, Đông Nam Á khu vực Nam sa mạc Sahara Nghiên cứu dịch tễ học xác định đƣợc yếu tố nguy UTG bao gồm: nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV), viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) dẫn đến viêm gan mãn tính; xơ gan; nhiễm độc aflatoxin (AF); loại hoá chất gây ung thƣ nhƣ rƣợu, asen, dioxin (hình 1),… rối loạn chuyển hoá apocphirin, thiếu hụt α–1 antitrypsin, bệnh Wilson, chứng nhiễm sắc tố sắt di truyền Ngoài yếu tố nhƣ độ tuổi, giới tính, yếu tố di truyền,… ảnh hƣởng đến nguy mắc bệnh Mặc dù yếu tố nguy gây UTG tác động đến tế bào gan theo đƣờng khác nhƣng cuối dẫn đến biến đổi di truyền hình thành tế bào ung thƣ -6- Hình 1: Các nguyên nhân gây ung thƣ gan [57] Nhiễm virus HBV yếu tố nguy hàng đầu UTG toàn giới, phân bố địa lý tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tỷ lệ mắc bệnh có mối tƣơng quan chặt chẽ Ví dụ nhƣ Trung Quốc, nƣớc thuộc khu vực Đông Nam Á, Nam sa mạc Sahara có tỉ lệ mức cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), tiêm vaccine dự phòng HBV ngăn ngừa đƣợc khoảng 70% UTG vùng có tỷ lệ nhiễm HBV cao HBV retrovirus có vật chất di truyền dạng ADN sợi đơn Những báo cáo từ đầu thập niên 80 cho thấy diện ADN HBV hệ gen tế bào gan khoảng 90% trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ gan [3] Nhiều nghiên cứu chứng minh ADN HBV chèn vào hệ gen ngƣời làm biến đổi ADN nhiễm sắc thể, hoạt hoá gen ung thƣ nhƣ c–Myc, c–Fos,… bất hoạt số gen ức chế khối u nhƣ TP53 Ngoài ra, sản phẩm protein hệ gen HBV nhƣ HBx, protein gen pre S/S hoạt hoá gen ung thƣ dẫn tới thúc đẩy nhanh chu trình tế bào ức chế trình chết theo chƣơng trình (apoptosis) Nhiễm virus HCV yếu tố nguy thứ UTG Có khoảng 2–4% số trƣờng hợp nhiễm HCV mạn tính phát triển thành UTG Ở quốc gia, vùng lãnh thổ tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính thấp thƣờng có tần suất UTG thấp -7- trung bình, trừ Nhật Bản (nơi mà virus HCV yếu tố nguy số 1) Số ca tử vong UTG Nhật tăng mạnh từ năm 1975 trở đi, thời gian tỷ lệ nhiễm HBV không đổi, có viêm gan HCV tăng lên tƣơng ứng với tỷ lệ tử vong Những nghiên cứu gần cho thấy sản phẩm protein HCVcó thể tƣơng tác với protein vật chủ tham gia vào trình phát triển, tăng sinh điều hòa hoạt động tế bào dẫn đến hình thành tế bào ác tính Có ba protein đƣợc xem chứng tham gia vào trình protein lõi (core protein), NS3 NS5A Aflatoxin (AF) mycotoxin đƣợc tiết từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, thƣờng mọc lạc hạt ngũ cốc ẩm ƣớt, đƣợc chứng minh gây UTG thực nghiệm súc vật (hình 2) AF chất tƣơng tác với virus HBV tăng đáng kể nguy mắc UTG AF gây đột biến gen, đột biến gen p53 đƣợc quan sát thấy nhiều Hàng loạt nghiên cứu đột biến gen này, đặc biệt đột biến G/T codon 249 đƣợc tìm thấy bệnh nhân UTG khu vực có phơi nhiễm AF cao [31] Hình 2: Cơ chế gây ung thƣ tác nhân ung thƣ gan [13] -8- Ngoài nguyên nhân yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid, rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt mô, thiếu hụt α1-antitrypsin góp phần làm tăng nguy dẫn đến ung thƣ gan [35] 1.1.4 Chẩn đoán điều trị ung thƣ gan 1.1.4.1.Chẩn đoán Gan đƣợc cấu tạo chủ yếu tế bào biểu mô gan, loại tế bào có khả tái sinh mạnh, ung thƣ gan phát triển nhanh Đồng thời, triệu chứng ung thƣ gan thƣờng biểu lộ bệnh nghiêm trọng, đó, việc điều trị ung thƣ gan gặp nhiều khó khăn Đây nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ tử vong ung thƣ gan cao Việc chẩn đoán ung thƣ gan giai đoạn sớm vô cần thiết Có hai phƣơng pháp thông dụng để chẩn đoán ung thƣ gan x t nghiệm chẩn đoán vật lý xét nghiệm máu tìm alpha fetoprotein (AFP) huyết bệnh nhân bị ung thƣ Để chẩn đoán có triệu chứng ung thƣ gan, số phƣơng pháp chẩn đoán vật lý đƣợc áp dụng nhƣ: siêu âm, chụp cắt lớp (CT), chụp cộng hƣởng từ (MRI - Magnetic Resonance Imaging), chụp X- quang Tuy nhiên, phƣơng pháp tốn kém, phụ thuộc nhiều vào máy móc không hiệu để phát khối u giai đoạn sớm Cách chẩn đoán thứ hai thông dụng việc xét nghiệm thị AFP huyết AFP glycoprotein có khối lƣợng 70kDa, đƣợc tổng hợp gan túi noãn hoàng giai đoạn thai nhi, sau đƣợc tiết vào huyết tuần thứ 13 thai kỳ Sau sinh, nồng độ AFP huyết giảm hầu nhƣ không phát đƣợc ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh AFP -9- đƣợc dùng để sàng lọc ngƣời có nguy bị ung thƣ gan cao AFP sau trẻ sinh ra, diện máu ngƣời lớn có nghĩa có biến đổi tế bào gan có khả mắc ung thƣ gan cao [10] Tuy vậy, AFP máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan tăng ngƣời bị viêm gan Hơn nữa, độ nhạy phƣơng pháp AFP không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP máu bình thƣờng (đặc biệt bệnh nhân có khối u nhỏ 3cm) [11] Hàm lƣợng AFP cao cho nghi ngờ chắn bệnh nhân mắc ung thƣ gan Các x t nghiệm giúp chẩn đoán ung thƣ gan, nhƣng đa số trƣờng hợp cách để chắn lấy mảnh khối u xem x t dƣới kính hiển vi Điều đƣợc gọi sinh thiết Có nhiều cách khác để có đƣợc mẫu khối u Trong số trƣờng hợp, mẫu sinh thiết đƣợc thực phẫu thuật Nếu khối u lớn lan rộng khắp gan, kim rỗng đƣợc đặt qua da bụng vào gan Sinh thiết mẫu đƣợc thực thời gian phẫu thuật nội soi 1.1.4.2 Điều trị Có nhóm điều trị chính: phẫu thuật không phẫu thuật Nhóm phẫu thuật phƣơng thức điều trị triệt căn, có dự hậu tốt hẳn, cắt gan điều trị chọn lựa, nhiên có khoảng 10-20% bệnh nhân có khả cắt bỏ UTG Ghép gan nhằm loại bỏ gan bị xơ hóa UTG, nhiên, vấn đề thiếu gan cho để ghép  Điều trị không phẫu thuật dùng: Thuyên tắc mạch hóa trị, chích cồn qua da, phá hủy u nhiệt, phá hủy u sóng tần số radio, hóa trị toàn thân với Doxorubicin, xạ trị qui ƣớc, điều trị nhắm đích  Điều trị phẫu thuât: Phẫu thuật cắt gan, ghép gan, hủy u laser hay đông lạnh cho u bề mặt -10- Hình 20 Cây chủng loại phát sinh protein p53 theo phƣơng pháp maximum likehood Hình 21 Cây chủng loại phát sinh protein p53 theo ClustalX2 Kết phân tích chủng loại phát sinh phƣơng pháp Maximum parsimony, Maximum likelihood ClustalX cho thấy trình tự P53 ngƣời nhóm với Macaca mulatta (khỉ vàng) Vì vậy, kết bảo đảm độ tin cậy -58- Ty thể bào quan quan trọng, đƣợc coi nhà máy sản xuất lƣợng tế bào Tại xảy trình hô hấp tế bào, chuyển ôxy chất dinh dƣỡng thành adenosine triphosphate (ATP) ATP “dòng” lƣợng hóa học tế bào để cung cấp lƣợng cho hoạt động Không có ty thể, động vật bậc cao không tồn tế bào chúng thu nhận lƣợng thông qua hô hấp yếm khí, trình hiệu nhiều Trên thực tế, ty thể giúp tế bào sản xuất lƣợng nhiều gấp 15 lần so với tế bào bào quan Các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm ngƣời, cần lƣợng lớn lƣợng tồn đƣợc ATP synthase protein nằm màng ty thể có vai trò việc tổng hợp adenosine triphosphate (ATP) từ adenosine diphosphate (ADP) phosphat vô ATP synthase đƣợc cấu tạo hai phần F0 F1 Phần F1 bao gồm tiểu đơn vị: alpha, beta, gamma, epsilon, delta Phần F0 bao gồm tiểu đơn vị b2, c từ đến 12 đƣợc xếp đối xứng Phần F0 F1 liên kết lõi trung tâm (dƣới đơn vị gamma epsilon) nhánh bên (b delta) Dòng electron kích hoạt đĩa màng lõi trung tâm quay, quay điều khiển lực tiểu đơn vị beta với nucleotide (ADP ATP) đẫn đến tạo lƣợng ATP (hình 22) Hình 22 Mô hình phân tử ATP synthase [7] -59- Trong nghiên cứu này, nhận thấy biểu tăng mạnh protein ATP synthase Sự biểu tăng protein mẫu protein ty thể phù hợp với giả thiết tăng sinh nhanh chóng tế bào ung thƣ đặc biệt ung thƣ gan đòi hỏi nguồn lƣợng lớn tăng cƣờng enzyme ATP synthase giúp tổng hợp lƣợng nhanh chóng Trong nghiên cứu này, Hexokinase biểu tăng Hexokinase enzyme phosphoryl hóa đƣờng cacbon thành hexose phosphate, có phần lớn các sinh vật, glucose chất quan trọng hexokinase, glucose-6phosphate sản phẩm quan trọng chúng Đây enzyme tham gia vào trình đƣờng phân tế bào Quá trình đƣờng phân trình thiếu tế bào trình cung cấp lƣợng ATP cho tế bào hoạt động [48] Ở động vật có vú, hexokinase gồm bốn dạng isozyme quan trọng, nằm vị trí khác tế bào có động học khác chất, điều kiện chức sinh lý Chúng đƣợc kí hiệu lần lƣợt hexokinase I, II, III IV A, B, C D Hexokinase I, II III isozyme có lực cao với glucose hexokinase II/B dạng chủ yếu giữ vai trò điều hòa kiểu tế bào động vật có vú hàm lƣợng đƣợc tăng lên nhiều loại bệnh ung thƣ Hexokinase II/B có liên quan đến lƣợng sinh học trình apoptosis tế bào Theo nghiên cứu Kim Cộng (2007), họ mối liên quan HK II trình làm ổn định ty thể tế bào HCC Những phát nghiên cứu liên quan đến tham gia HK II trong điều hòa ổn định ti thể tế bào ung thƣ gan Đặc biệt, nghiên cứu cho thấy tình trạng thiếu oxy làm tăng ổn định ty thể theo HK II, HK II ức chế hoạt hóa tín hiệu apoptosis qua ty thể Hơn hệ thống HK II ức chế biểu tính hiệu kháng u gây apoptosis Theo nghiên cứu này, họ thấy thiếu hụt oxy gián tiếp tăng HK II gây ổn định ty thể 3-BrPA gây thay đổi cấu trúc PTPC đƣa đến hoạt hóa tín hiệu apoptosis ty thể Các chế hoạt hóa phụ -60- thuộc tín hiệu apoptosis ty thể phức hệ nhiều chế dẫn đến giải phóng Cytochrome C Ví dụ, họ protein proapoptosis Bcl2, chẳng hạn nhƣ tBid, Bax/Bak Bim điều hòa apoptosis tƣơng tác với VDAC màng ty thể [38] Nó mở lỗ thay đổi tính thấm ty thể làm thủng màng giải phóng protein phía màng nhƣ Cytochrome C, AIF Smac/DIABLO Mặc dù cấu trúc lỗ bán thấm ty thể không hoàn toàn giải thích trọn vẹn, PTPC phức hợp nhiều loại protein gồm VDAC, ANT, CypD HK II Trong nghiên cứu này, ngƣời ta nhận thấy HK II ức chế 3-BrPA phân hủy HK II từ PTPC nguyên nhân PTPC mở giải phóng Cytochrome C bào tƣơng Do đó, quan sát chung cho thấy HK II gây chế tế bào lại môi trƣờng thiếu oxy, nhƣ tăng tính thấm HCC HK II ức chế biểu tính hiệu kháng u hoạt hóa tín hiệu apoptosis ty thể phát triển khối u Nghiên cứu cho thấy biểu mức HK II mô u so với mô bình thƣờng Vì vậy, để ngăn phát triển khối u cần giảm lƣợng HK II [57] Chúng ta biết, tế bào gan có tốc độ phân chia phát triển nhanh, đặc biệt chúng chuyển sang trạng thái ung thƣ Điều đòi hỏi protein tham gia điều hòa kiểm soát việc ch p, phiên mã dịch mã tế bào phải tăng cƣờng hoạt động Trong nghiên cứu này, nhận dạng đƣợc protein tham gia vào trình phiên mã dịch mã NAD-dependent deacetylase sirtuin-6, Rho guanine nucleotide exchange factor, Neural retinaspecific leucine zipper protein, Zinc finger protein 806 ty thể protein Myelin transcription factor 1-like protein, Translin-associated factor X-interacting protein microsome Tất protein có biểu tăng mô ung thƣ Yếu tố Rho protein gồm có tiểu đơn vị có lực cao với ARN đơn, có hoạt tính helicaza ATP-aza để tháo xoắn sợi lai ADN-ARN Khi bám vào ARN, yếu tố Rho phân giải ATP Năng lƣợng đƣợc giải phóng giúp chuyển -61- dọc sợi ARN sinh tới bong bóng phiên mã, sau yếu tố Rho tách đôi ADNARN giải phóng ARN NAD-dependent deacetylase có khả tác động tới 'Lys-9' 'Lys-56' histone H3 Sự acetyl hóa histone H3 dị nhiễm sắc giai đoạn S chu kỳ tế bào Deacetylates 'Lys-9' histone H3 đích NF-Kappa-B điều hòa giảm biểu tập hợp gen đích NF-Kappa-B Sự deacetyl hóa nucleosome ngăn cản RELA liên kết với ADN đích Điều cần thiết cho liên kết ADN với telomere giai đoạn-S để trì telomere bình thƣờng giúp cho ổn định di truyền Họ protein Zinc finger protein tham gia vào việc điều hòa phiên mã Zinc finger protein gắn với ADN vị trí liên kết với yếu tố phiên mã, protein điều hòa, protein biểu tăng ngăn cản hoạt động phiên mã tế bào ung thƣ [51] Trong trình miễn dịch chống ung thƣ, dƣờng nhƣ vai trò đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thƣờng xuyên chiếm ƣu Quá trình có tham gia phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), ngƣời gọi HLA Trong phân tích proteomics microsome này, nhận dạng đƣợc protein MHC class I (MHC I) Protein biểu giảm mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng Protein MHC đƣợc tích lũy lƣới nội chất làm nhiệm vụ nhƣ nơi trung chuyển phân tử Trong tế bào mang virus hay tế bào ung thƣ, kháng nguyên nội sinh nằm tế bào chất, đƣợc vi thể proteasome chế biến thành peptide kháng nguyên Các peptide đƣợc TAP vận chuyển vào khoang lƣới nội chất để liên kết với rãnh MHC I Sau đó, phức hệ MHC Ipeptide kháng nguyên đƣợc đóng gói cách bọc màng đƣợc vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện cho tế bào TCD8+, kích thích tế bào T sản sinh Lymphokin để tiêu diệt tế bào mang kháng nguyên nội sinh Khi tế bào bị nhiễm virus nội sinh, lƣợng MHC I đƣợc tổng hợp dƣ thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ -62- trình diện kháng nguyên nội sinh Trong nghiên cứu chúng tôi, protein MHC I giảm, điều gợi ý rằng, trình tiến triển thành ung thƣ tế bào gan làm ảnh hƣởng tới đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thƣ không bị tiêu diệt thiếu hụt nhận diện kháng nguyên nội sinh [2] Beta-actin protein tham gia cấu trúc tế bào, có tính bảo thủ cao, liên quan đến dạng vận động tế bào khác biểu tất tế bào nhân chuẩn Sự polymer hóa actin hình cầu (G-actin) dẫn tới hình thành cấu trúc sợi (F-actin) cấu trúc xoắn kép Mỗi actin gắn với phân tử khác Thiếu hụt actin gây rối loạn vận động liên quan đến thần kinh từ dẫn đến rối loạn trƣơng thể k o dài co trơn nguyên nhân tƣ nhƣ vận động bất bình thƣờng Trong nghiên cứu chúng tôi, beta-actin biểu tăng rõ rệt gel mô ung thƣ, kết việc tế bào gan ung thƣ tăng sinh nhanh chóng kéo theo thành phần tham gia cấu tạo tế bào tăng [47] Trong nghiên cứu này, nhận thấy có biểu Major vault protein mô ung thƣ Major vault protein protein màng đƣợc mã hóa gene MVP Vaults cấu trúc gồm nhiều tiểu đơn vị, có vai trò tham gia kênh vận chuyển chất nhân tế bào chất Protein gián tiếp tham gia kháng lại thuốc thông trình vận chuyển Nó đƣợc phân bố rộng rãi mô bình thƣờng, biểu mức tế bào ung thƣ đa kháng thuốc Sự biểu mức protein thị đầy tiềm việc khám điều trị bệnh [45] Trong nghiên cứu này, thấy biểu đa dạng protein khác biệt không đặc trƣng riêng bệnh Những thị riêng cho bệnh đƣợc hình thành chuỗi tác động tổng hợp với bệnh khác, điều góp phần bổ sung cho ý kiến thị ung thƣ không đặc hiệu với riêng loại ung thƣ mà phản ánh mối liên quan chặt chẽ tiến triển bệnh ung thƣ với trình viêm bệnh lý khác thể -63- KẾT LUẬN Qua trình phân tích proteomics mô gan từ bệnh nhân ung thƣ gan, rút số kết luận sau: Bằng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ MALDI-TOF MS, xác định đƣợc biểu khác biệt protein ty thể microsome tách từ mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng: - Phân tích protein ty thể xác định đƣợc 43 spot protein biểu khác biệt gel nhận dạng đƣợc 18 protein, có 13 protein đƣợc định danh protein giả thiết - Phân tích protein microsome xác định đƣợc 27 spot protein biểu khác biệt gel nhận dạng đƣợc 23 protein, có 16 protein đƣợc định danh protein giả thiết Các protein đƣợc nhận dạng ty thể bao gồm protein cấu trúc tế bào, protein tham gia vào trình miễn dịch bảo vệ thể, trình trao đổi chất, phiên mã, dịch mã Đặc biệt có protein: HSP 70, HSP 60, ATP synthase biểu tăng, protein p53, MHC I có biểu giảm rõ rệt mô ung thƣ Các protein đƣợc nhận dạng gel microsome bao gồm protein tham gia vào trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch protein cấu trúc tế bào Đặc biệt protein: HSP 70, MVP, Zinc finger Betaactin có biểu tăng mô ung thƣ Trên sở phân tích chủng loại phát sinh mức phân tử chƣơng trình phylip cho thấy Hsp70 ngƣời thuộc nhóm với Hsp70 số động vật khác nhƣ Xenopus laevis, Bos taurus, Oryctolagus cuniculus, Megalobrana amblycephala, Mus musculus, Rattus norvegicus, P53 ngƣời gần gũi với P53 khỉ vàng (Macaca mulatta) -64- KIẾN NGHỊ Từ thực tế nghiên cứu trên, đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục thu thập mẫu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan nguyên nhân khác giai đoạn ung thƣ khác nhằm phân tích biến đổi thành phần protein liên quan đến bệnh Thu thập mẫu huyết tƣơng bệnh nhân viêm gan B C tiến triển thành ung thƣ gan bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử nhiễm HBV HCV nhằm tìm hiểu mối liên hệ viêm gan B, C ung thƣ gan Kết hợp phân tích proteomics huyết tƣơng mô gan để tìm mối liên hệ hai hệ protein này, nhằm tìm thị ung thƣ gan đặc hiệu dễ dàng nhận biết, phục vụ cho chẩn đoán sớm ung thƣ gan -65- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học hệ gene, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Hà Văn Mạo, Hoàng Kỷ, Phạm Hoàng Phiệt (2006), Ung thư gan nguyên phát, Nhà xuất y học Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam (2004), “Ngiên cứu hệ proteomic huyết ngƣời kết nối sắc ký lỏng Nano đa chiều hệ khối phổ liên tục”, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2004, [16] NCCB định hƣớng Y-Dƣợc học, Học viện Quân Y, Hà Nội, tr 470474 Tài liệu tiếng Anh Aderson, M.P, A.N.L.(2006), "A List of Candidate Cancer Biomarker for Targeted Proteomics", Bio Ins, 1, PP 1–48 Amy J Clippinger and Michael J Bouchard (2008), “Hepatitis B Virus HBx Protein Localizes to Mitochondria in Primary Rat Hepatocytes and Modulates Mitochondrial Membrane Potential”, J Virology, 82 (14), PP 6798-6811 Andries K V., Guillemont J, Winkler H, Van Gestel (2005), “A diaryquinolime drug active on the ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis”, Science, 307 (7), PP 223-227 -66- Brachmann R K , Vidal M & Boeke J D (1996): “Dominant-negative p53 mutations selected in yeast hit cancer hot spots”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, PP 4091-5000 Bakos A.D, Hutson S.P, (2008), “BRCA mutation-negative women from hereditary breast and overian cancer families: a qualitative study of the BRCA-negative experience”, NIH, 11(3), PP 205-207 10 Deng-Fu Yao, Z.Z.D.A.M.Y (2007), “Specific molecular marker in hepatocellular carcinoma”, Science, 6(3), PP 241-247 11 Shahid a Khan (2009), “Diagnosis of hepatocellular carcinoma” World J Gastroenterol, 15(11), PP 1301-1314 12 Nguyen Minh Đuc, Nguyen Thi Ngoc Ha, Trinh Hong Thai, (2009), “Proteomic analysis of bone marrow cells from leukemia patients”, Proceedings of the National Conference on Proteomics, April 01-02 , 2009 in Do Son, p.65-78 13 Farazi P.A., Depinho R.A, (2006), “Hepatocelular carcinoma phathogenses: from genes to evironment”, Nat Rev Cancer, 6, PP 674-687 14 Govekar R.B And Zingde S.M, (2007), "Cancer Proteomics: How Far are We from Clinics" Int J Hum Genet, 7(1), PP 91-97 15 Harris C C (1996), “Structure and function of the p53 tumor suppressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies” JNCI, 88, PP 1442-1455 16 He M., Zhai R., Wei X., Wang Q., Jiang M R Z., Huang Y., and Zhang Z, (2008), “Detection and identification of NAP-2 as a biomarker in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma by proteomic approach”, Pro Sci, 6, PP 1-11 -67- 17 Huong T T T., Thai T H (2006), “Plasma proteomic analysis of acute myeloid leukemia”, Program & Abstracts Joint Third AOHUPO and Fourth Structural Biology and Functional Genomics Conference, PP 250 18 Jain K., M.D., Fracs, Ffpm, (2002, "Role of Proteomics in Diagnosis of Cancer", Tech Cancer Res & Treatt, 1(4), PP.281-286 19 Jesus M Matos, Frank A Witzmann,(2009), “A Pilot Study of Proteomic Profiles of Human Hepatocellular Carcinoma in the United States”, J Surg Res, 155(2), PP 237–243 20 Jennifer S Carew and Peng Huang (2002), “Mitochondrial defects in cancer”, Mole Cancer, 9, PP 1476-4598 21 Kim W., L.S.O., Kim J S., Ryu Y H., Byeon J., Kim H, Kim Y., Heo J S., Park Y M., and Jung G, (2003), “Comparison of Proteome between Hepatitis B Virus- and Hepatitis C Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinl Cancer Res, 9, PP 5493–5500 22 K Nakamura, X.Z., M Fujimoto, T Tanaka, J Kimura-Akada, H.Furumoto, Y Kuramitsu, B Jordan, (2008), “1D-SDS-PAGE and Nano-LC- MS/MS for Membrane Proteomics of Mouse Liver Microsomes (MPI sample) and its Application to Human Proteomics of ER from Jurkat Cells”, J Pro & Bio, S2, PP.114-115 23 Kondo T.(2008), “Tissue proteomics for cancer biomarker development Laser micro dissection and 2D-DIGE”, PP 5493-5500 24 Lane S., William, (2007), “Comparative Cytochrome P450 Proteomics in the Livers of Immunodeficient Mice Using Mole Cell Bio, 6, PP 953-962 -68- 18 O Stable Isotope Labeling”, 25 Le Naour F., B.F., Misek D E., BresChot C., Hanash S M., and Beretta L, (2002), “A Distinct Repertoire of Autoantibodies in Hepatocellular Carcinoma Identified by Proteomic Analysis”, Mole & Cell Prot, 1, PP.197–203 26 Liebler D.C (2002), “Introduction to Proteomics”, Humana Press Inc, New Jersey 27 Lupberger J., H.E (2007), “Hepatitis B virus-induced oncogenesis”, World J Gast, PP 74-81 28 Mai.T.N, Thai T H (2009), “Proteomic analysis of liver tissue from some animals in the region exposed to dioxin at Ma Da area, Dong Nai province”, VNU Jounal of Science, Nat,Sci & Tech, 24, PP 13-19 29 Maria Pleguezuelo, Laura M Lopez-Sanchez, Antonio Rodriguez-Ariza, Jose L Montero, Javier Briceno, Rubenciria, and Jordi Muntane (2010), “Proteomic analysis for developing new biomarkers of hepatocellular carcinoma”, World J Hepatol, (3), PP 127-135 30 Mary A C and Laura J F, (2005), “GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma”, J Hepat, 43 (6), PP 1007-1012 31 Mazzanti R., L Gramantieri, and L Bolondi (2008), “Hepatocellular carcinoma: Epidemiology and clinical aspects”, Molec Asp Med, 29(1– 2), PP 130–143 32 M Hollstein, B Shomer, M Greenblatt, T Soussi, E Hovig, R Montesano & C C Harris (1996), “Somatic point mutations in the p53 gene of human tumors and cell lines: updated compilation” Nucl Aci Res, 24, PP 141-156 -69- 33 M Hsiao, J Low, E Dorn, D Ku, P Pattengale, J Yeargin (1994) “Gain of function mutations of the p53 gene induce lymphohematopoietic metastatic potential and tissue invasiveness” Am J Pathol (145), PP 402-414 34 M S Greenblatt, W P Bennett, M C Hollstein & C C Harris (1994), “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis”, Cancer Res , 54, PP 4855-4878 35 Mohammad Hossein Somi Md Assistant Professor (2005), “Hepatocellular carcinoma”, Hepat Hepat,5(3),PP 65-67 36 Nikolova M S., D.O.M.G., Medical Faculty, Medical University Sofia, (2007), “Molecular pathogenesis of Hepatocellular carcinoma ”, Bal J Med Genetics, 10 (1), PP 15-22 37 Paradis V., B.P (2007), “In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma In the new area of noninvasive markers of hepatocellular carcinoma”, J Hepat, 46, PP.11-49 38 Pastorino JG, Shulga N, Hoek JB (2002), “Mitochondrial binding of hexokinase II inhibits Bax-induced cytochrome c release and apoptosis”, J Biol Chem, 277, PP 7610–7618 39 Polanski M., A.N.L (2006), “A List of Candidate Cancer Biomarkers for Targeted Proteomics”, Bio Ins, 1, PP.1-48 40 Qin L.X., T.Z.Y (2002), "The Prognotics molecular markers in hepatocellular carcinoma", World J Gast, 8(3), PP 385-392 41 Sun W., X.B., Sun Y, Du X., Lu M., Hao C., Lu Z., Mi W., Wu S., Wei H., Gao X., Zhu Y., Jiang Y., Qian X., and He F, (2007), “Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma by Two-dimensional Difference Gel Electrophoresis”, Mole & Cell Pro, 6, PP.1798–1808 -70- 42 Thai T H., Huong T T T (2005), “Plasma proteomic analysis of acute myeloid Leukemia patients”, VNU, Journal of science, Nat.,Sci., & Tech, 4, PP 54-60 43 William Cs Cho (2007), "Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery", Mole Cancer, 10, PP 6-25 44 Wong C H., C.S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K.W (2006), “The Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clin Lab Sci, 43(41), PP.69-101 45 Rowan S., Ludwig.R L , Haupt.Y , Bates.S , Lux.X , Oren.M, 1996 “Specific loss of apoptotic but not cell cycle arrest function in human tumour derived p53 mutant”, EMBO J, 15, PP 827-838 Tài liệu tham khảo từ website 46 http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/en/proteomics.htm (13/11/2010) 47 http://.cancer.org/docroot/CRI/CRI_2_1x.asp?dt=25Cancer.org2 (11/10/2010) 48 http://en.wikipedia.org/wiki/Hexokinase (02/12/2010) 49 http://en.wikipedia.org/wiki/Major_vault_protein (14/11/2010) 50 http://en.wikipedia.org/wiki/Heat_shock_protein#Cancer_vaccine_adjuvant (23/11/2010) 51 http://www.uniprot.org/uniprot/?query (08/10/2010) 52 http://www.medicinenet.com/script/main/art?articlekey=104954 (14/09/2010) 53 http://www.siteman.wustl.edu/PDQ.aspx?id=662&xml=CDR256491.xml (27/11/2010) -71- 54 http://www.antigenics.com/products/tech/hsp/ (24/10/2010) 55 http://www.bioscience.org/2005/v10/af/1736/figures.htm (15/12/2010) 56 http://www.bioscience.org/1997/v2/d/soehnge/d538-551.htm (29/10/2010) 57 http://www.hopkinsmedicine.org/liver_tumor_center/conditions/cancerous_li ver_tumors/hepatocellular_carcinoma.html (12/12/2010) 58 http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n4/full/nrm2384.html (12/12/2010) 59 http://mct.aacrjournals.org/content/6/9/2554.abstract (26/09/2010) -72- [...]... quan [14] Vì nguyên nhân chính của ung thƣ gan là viêm gan B, C nên rất nhiều nghiên cứu đã tập trung vào đối tƣợng là bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan Để -17- tìm hiểu khác biệt trong biểu hiện protein trong mô ung thƣ gan có tiền sử viêm gan B nhằm giải thích cơ chế biến đổi của tế bào gan ung thƣ, các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành phân tích hệ protein các tế bào gan ung thƣ bằng... proteomics để bƣớc đầu phân tích hệ protein mô gan ung thƣ, so sánh với mô gan bình thƣờng trên cùng một bệnh nhân nhằm tìm ra những protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này -28- CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí khối u của bệnh nhân ung thƣ tế bào gan Mẫu đối chứng là mô gan lành cách 5cm trên lá gan đó tại vị... cứu phân tích proteomics so sánh đáp ứng của CYP trong mô gan chuột xử lý vơi 1,4-bis-2- (3,5dichloropyridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán đáp ứng của thuốc Trong nghiên cứu này, họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics P450 của gan chuột dƣới tác động của TCPOBOP Phƣơng pháp nghiên cứu gồm thu microsome bằng ly tâm, phân tách các protein microsome bằng phƣơng pháp điện di, phân. .. 1.3.3 Proteomics trong nghiên cứu ung thƣ gan Tác hại của ung thƣ gan đối với sức khỏe con ngƣời và xã hội là vô cùng lớn Việc phân tích proteomics ung thƣ gan hứa hẹn sẽ cung cấp cho chúng ta sự hiểu biết đầy đủ hơn về các tác nhân gây ung thƣ gan, quá trình tiến triển bệnh và hơn nữa là đƣa ra các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị mới cho bệnh nhân HCC Việc phân tích proteomics không chỉ dừng lại ở... tiêu khoa học của dự án, bao gồm: tạo đƣợc bức tranh tổng thể của proteomics gan; xác định sự phân bố và bức tranh tổng thể của các protein ở mức độ dƣới tế bào; lập bản đồ liên kết của các protein gan; làm sáng tỏ các biến đổi tổng thể của proteome gan; liên kết giữa các dự án proteome gan và dự án proteome huyết tƣơng để phát hiện các chỉ thị sinh học của các bệnh về gan [43] 1.3.3 Proteomics trong... trong môi trƣờng ảnh hƣởng không tốt đến hệ protein sinh vât Ung thƣ gan là một căn bệnh hiểm nghèo phổ biến ở nƣớc ta Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu proteomics ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ gan, tuy nhiên, ở Việt Nam hiện rất ít nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp phân tích proteomics mô gan ở bệnh nhân ung thƣ gan Do vậy, trong đề tài này chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp proteomics... [29] Ung thƣ biểu mô tế bào gan (HCC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây khối u ác tính gây tử vong cao Tỷ lệ mắc HCC ở Hoa Kỳ đang gia tăng Matos và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu proteomics ung thƣ gan của ngƣời Mỹ Khối u và mô từ ba bệnh nhân HCC ngƣời Mỹ bị viêm gan và không liên quan đến viêm gan đã đƣợc phân tích để tìm sự khác biệt phổ biến trong biểu hiện protein Protein đã đƣợc phân. .. đƣợc sử dụng đều có độ sạch phân tích, một số hóa chất dùng cho phân tích gel điện di hai chiều, khối phổ đạt độ sạch phân tích khối phổ -29- 2.1.3 Thiết bị Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad – Mỹ) Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf Hệ thống phân tích hình ảnh với phần mềm chuyên dụng phân tích bản gel điện di hai chiều Phoretix (Shimadzu Nhật Bản) Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA-CRFPLUS(KRATOS... các kháng nguyên ung thƣ Tuy nhiên, do có hiện tƣợng phản ứng -12- chéo trong phản ứng miễn dịch, do đó kết quả của phƣơng pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu [18] Proteomics trong nghiên cứu chỉ thị ung thư Proteomics ung thƣ là từ đƣợc dùng để chỉ các ứng dụng của kỹ thuật proteomic trong nghiên cứu ung thƣ Nhƣ chúng ta đều biết ung thƣ là một bệnh kì lạ bởi các đột biến diễn ra ở tế bào ung thƣ Những... hiện của hệ protein của các mô trong HCC liên quan mật thiết với các yếu tố gây bệnh và cơ chế ung thƣ gan có thể diễn ra khác nhau do các yếu tố HBV và HCV [21] -19- Cũng trên đối tƣợng các bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan B, tháng 4 năm 2008, Min He và cộng sự [16] đã công bố kết quả nghiên cứu phát hiện và xác định NAP-2 nhƣ là một chỉ thị sinh học của ung thƣ gan liên quan đến viêm gan ... phát sớm ung thƣ gan quan trọng việc điều trị loại ung thƣ Thực luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: Phân tích proteomic mô gan người bị ung thư gan nguyên phát với mục đích:  Phân tích. .. bào tách từ mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan -2-  Phân tích so sánh biểu protein ty thể, microsome phần lại mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan nhằm tìm... dụng phƣơng pháp phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan Do vậy, đề tài sử dụng phƣơng pháp proteomics để bƣớc đầu phân tích hệ protein mô gan ung thƣ, so sánh với mô gan bình thƣờng