(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá xạ đen (ehretia asperula zoll mor)​

TỔNG QUAN

Giới thiệu về lá Xạ đen

1.1.1 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố

Hình 1.1 Ehretia asperula Zoll & Mor

Xạ đen (Ehretia asperula Zoll & Mor) là một loài thực vật thuộc họ Vòi voi, có thể là cây thân gỗ, bụi hoặc cây thảo Cây có hình trụ, lá đơn mọc so le, không có lá kèm, và được bao phủ bởi lông cứng hoặc mềm Hoa của cây thường đều, với đài hợp nhiều hoặc ít, tồn tại trên quả và phát triển theo thời gian Nhụy của hoa gồm 2 lá noãn với bầu trên có 2 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, nhưng thường được phân chia thành 4 ô bởi vách ngăn giả Khi quả chín, các thùy của bầu tách ra thành 4 quả hạch nhỏ, mỗi quả chứa một hạt Tại Việt Nam, Xạ đen còn được gọi là Dót, là cây gỗ nhỏ cao khoảng 1m, với lá bầu dục thon dài từ 4-10cm và rộng 2-5cm Chùm sim của cây nằm ở đầu cành, hoa ống ngắn và quả tròn có kích thước 4-5mm, với 4 hột Loài này chủ yếu phân bố ở Indonesia và một số tỉnh như Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình.

Họ Vòi voi là một họ thực vật lớn, phân bố rộng rãi trên toàn cầu, chủ yếu tập trung ở các vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là khu vực Địa Trung Hải.

Trung Hải, Tây và Trung Á, cũng như khu vực Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, là nơi sinh sống của nhiều loài thực vật Cụ thể, loài Ehretia asperula Zoll & Mor chủ yếu phân bố ở Indonesia và tại Việt Nam, cây này chủ yếu được tìm thấy ở các tỉnh như Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội và Hòa Bình.

 Sơ lược về chi Ehretia

Cây bụi hoặc gỗ có lá nguyên hoặc có răng cưa ở mép, với cụm hoa ngù hoặc chùy Đài hoa chia làm 5 phần, trong khi tràng hoa thường có hình ống hoặc hình chuông, hiếm khi là hình phễu Hoa mẫu 5 có chỉ nhị thò ra, với bao phấn hình trứng hoặc thon dài Bầu nhụy hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn, và vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu nhụy hình tròn hoặc thon dài Quả hạch có màu vàng, cam, hoặc đỏ nhạt, hình cầu và nhẵn, khi chín vỏ quả chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hoặc chia làm 4 thùy mỗi thùy có 1 hạt, với hạt cứng.

1.1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen

Xạ đen là cây thuốc quý với nhiều hoạt tính sinh học, được biết đến trong việc điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, và giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng Cây còn có tác dụng thông kinh lợi niệu, hỗ trợ điều trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan và bệnh lậu Xạ đen giúp ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã được thực hiện để khám phá thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Xạ đen, nhằm khai thác tiềm năng y học của nó.

Năm 2012, nhóm nghiên cứu gồm Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến và Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Họ đã thử nghiệm bốn loại dịch chiết của cây xạ đen, bao gồm dịch chiết n-Hexane, dịch chiết EtOAc, dịch chiết MeOH và dịch chiết nước, trên các vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtilis và Sarcina sp, cũng như vi khuẩn Gram âm Escherichia coli ATCC.

25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) Kết quả hoạt tính sinh học được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3]

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn

B subtilis Sarcina sp E coli P aeruginosa n-Hexane - - - -

Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008, đề tài nghiên cứu tập trung vào thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Xạ đen.

Nghiên cứu đã phân lập một số hợp chất từ cây xạ đen và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng trên một số dòng tế bào ung thư Trong luận án, bốn hợp chất có khung friedelan được xác định bao gồm: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedo-olednon-3,21-dion (3) và canophyllol (4) Ngoài ra, còn có năm hợp chất có khung lupan được phát hiện.

Các hợp chất 20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3-on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9), cùng với clionasterol (10) và axit glucosyringic (11) đã được thử nghiệm hoạt tính trên hai dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư phổi (Lu-1) Kết quả cho thấy các hợp chất (1, 2, 3 và 9) không thể hiện hoạt tính đối với hai loại tế bào ung thư này.

Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu [2, 10]

Năm 2000 Huangvà cộng sựđã phân lập và xác định cấu trúc của celahin D: 1β,2β,6α,15β-tetracetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-β-dihydroagarofuran (12), 1β- acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-4α,6α-dihydroxy-2β(α-methylbutanoyloxy)-β- dihydroagarofuran (13), 1β-acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-6α-hydroxy-2β

(a-methylbutanoyloxy)-β-dihydroagarofuran (13), emarginatine-E (15), lupenone (16), friEdelinol (17) có trong cây xạ đen bằng phổ 1 H-NMR,

Nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật 13C-NMR, COSY, HMBC, HMQC để phân tích và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất Kết quả cho thấy emarginatine-E (15) có khả năng gây độc tế bào đối với tế bào ung thư hầu họng với giá trị ED50 là 1,7 µg/ml và tế bào ung thư ruột kết với ED50 là 4,1 µg/ml Trong khi đó, các hợp chất 12, 14, 16 đều có giá trị ED50 vượt quá 10 µg/ml.

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [14]

Năm 2007, nhóm nghiên cứu từ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh và Lê Thị Hồng Nhung, đã phân lập và xác định cấu trúc của một phenolic glycoside và ba hợp chất triterpenes trong cây xạ đen Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp phân tích như phổ 1H-NMR, 13C-NMR và một số phổ hai chiều cùng với phổ phân giải cao Trong số các hợp chất phân lập, glucosyringic acid là một trong những thành phần chính được xác định.

(18), lup-20(29)-ene-3β,11β-diol (19), lup-20(29)-ene-3-one (20) và lup-

Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [8,10]

Vào năm 1995 một số nhà khoa học của Trung quốc tên là Yao-Haur

Kuo, Chieh-Fu Chen và Li-Ming Yang Kuo đã phân lập thành công hai hợp chất từ cây xạ đen, bao gồm celahinine A và một hợp chất alkaloid mới mang tên sesquiterpene pyridine alkaloid emarginatine A.

(23) Hợp chất mới này có tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với tế bào Hepa-

2 (hepatoma), Hela, Colo 205 và các tế bào ung thư biểu mô KB (in-vitro), có

ED50 (KB)=4,0 àg/ml Cụng thức húa học của chỳng được cỏc tỏc giả xỏc định bằng các phương pháp phổ 1 H, 13 C-NMR, COSY, NOESY và HMBC

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu [16]

Vào năm 1997, Kuo YH và Kuo LM đã phân lập bốn hợp chất triterpene từ xạ đen, bao gồm celasdin A, celasdin B, celasdin C và maytenfolone A Trong số này, celasdin A và celasdin C là hai hợp chất mới, trong khi celasdin B đã được biết đến Đặc biệt, hợp chất maytenfolone A có tác dụng gây độc tế bào.

Maytenfolone A đã được nghiên cứu qua phương pháp X-ray, cho thấy hiệu quả sinh học đáng chú ý trong việc gây độc tế bào đối với tế bào gan (HEPA-2B ED50 = 2,3 àg/ml) và ung thư vú họng (ED50 = 3,8 àg/ml).

Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [12]

Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, nổi bật với tác dụng điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc, và giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng Đặc biệt, cây xạ đen được biết đến với khả năng chữa trị ung thư, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư Ngoài ra, cây còn có tác dụng thông kinh lợi niệu, giúp điều trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan và bệnh lậu Cây xạ đen giúp tiêu hạch, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.

Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí

1.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) a Nguyên tắc

Quá trình phân tách chất cần phân tích dựa vào hệ số phân tích khác nhau giữa pha động và pha tĩnh Chất này sẽ được hấp phụ hoặc phân bố trên pha tĩnh khi di chuyển qua lớp hấp phụ, trong khi các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển theo hướng pha động với tốc độ khác nhau Nhờ vào hệ số phân bố khác nhau giữa các chất trong pha động và pha tĩnh, chúng ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích, và các thành phần này sẽ được lưu trữ trên pha tĩnh sau khi phân tách.

Để nhận biết các chất cần phân tích, có thể sử dụng ánh sáng thường nếu chất phân tích có màu, hoặc áp dụng phương pháp soi huỳnh quang ở bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, có thể phun thuốc thử để hiện màu, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích Việc lựa chọn phương pháp phù hợp là cần thiết để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần tách.

Hệ số lưu trữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích Hệ số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi.

- a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

- b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

- Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

 Hệ số lưu giữ tương đối Rr

- dx là đường đi của chất phân tích (cm)

- dc là đường đi của chất chuẩn (cm)

Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất

- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với kích thước bản mỏng dùng triển khai và có nắp đậy kín

- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm

- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện

- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích

- Máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày

- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng

- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel c Cách tiến hành

Bình khai triển thường được làm bằng thủy tinh, có hình dạng hộp hoặc trụ, và có nắp đậy kín với kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của bản mỏng Để thực hiện quá trình sắc kí, cần cho vào bình một hệ dung môi thích hợp để bão hòa dung môi.

Để thực hiện sắc ký mỏng hiệu quả, cần chấm một lượng chất phân tích vừa phải lên bản mỏng, tránh việc chấm quá nhiều gây chồng lấp vết sắc ký hoặc chấm quá ít làm giảm độ nhạy phát hiện Lượng mẫu lý tưởng là từ 0,1 - 50 mg dưới dạng dung dịch trong ether, chloroform, nước hoặc dung môi phù hợp khác Thể tích dung dịch chấm nên từ 0,001 ml đến 0,005 ml cho điểm chấm và từ 0,1 - 0,2 ml cho vạch chấm Đối với dung dịch loãng, có thể chấm nhiều lần tại một vị trí và sấy khô sau mỗi lần Đường xuất phát cần cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm - 2 cm, và vạch xuất phát cách bề mặt dung môi 0,8 - 1 cm Các vết chấm nên có đường kính 2 - 6 mm, cách nhau 15 mm và cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Trong phân tích bán định lượng, sử dụng mao quản định mức chính xác, còn khi không cần định lượng có thể dùng micropipet hoặc ống mao quản thông thường.

Để triển khai sắc ký, đặt bản mỏng gần như thẳng đứng trong bình triển khai, đảm bảo các vết chấm nằm trên bề mặt dung môi Sau đó, đậy kín bình và giữ ở nhiệt độ ổn định Khi dung môi đã chạy đến vạch tiền tuyến đã xác định, lấy bản mỏng ra, đánh dấu mức dung môi, và làm bay hơi dung môi thừa trên bản mỏng trước khi hiện vết chất.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trong điều kiện chuẩn hóa để đảm bảo độ tin cậy cao hơn cho kết quả Hiện nay, việc sắc ký thường được hỗ trợ bởi hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, mang lại hiệu quả tối ưu trong phân tích.

1.2.2 Phương pháp sắc ký cột a Nguyên tắc

Sắc ký là phương pháp tách các thành phần trong một hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha tĩnh và pha động.

Sắc ký cột là một phương pháp sắc ký trong đó pha tĩnh được nhồi vào cột hình trụ hở hai đầu hoặc được tráng trong lòng mao quản hẹp Dung môi rửa cột đóng vai trò là pha động, chảy qua chất hấp phụ để tách biệt các thành phần trong mẫu.

Tùy thuộc vào khả năng hấp phụ và hòa tan của từng chất trong hỗn hợp, thứ tự thu hồi các chất sẽ khác nhau khi sử dụng dung môi rửa cột.

Chất hấp phụ phổ biến trong sắc ký cột bao gồm Al2O3 và silica gel, trong khi dung môi có thể là một loại hoặc hỗn hợp từ hai đến ba loại với tỷ lệ thích hợp Dung môi rửa cột thường có độ phân cực tăng dần Cột sắc ký được làm từ thủy tinh, có khóa ở đầu dưới và mở ở đầu trên để thêm dung môi, với nhiều kích thước khác nhau Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng; cột có đường kính nhỏ và chiều dài lớn thường cho kết quả tách biệt tốt hơn.

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

- Cho bông gòn vào đáy cột

- Kẹp cột thẳng đứng trên giá

- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột:

Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex

Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như

 Đưa chất phân tích vào cột[6]:

- Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng

- Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:

 Cho thẳng hỗn hợp dung dịch lên cột

Trộn dung dịch phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, sau đó quay khô dung môi và trải đều hỗn hợp lên bề mặt cột Cuối cùng, tiến hành rửa cột để giải li chất.

Có hai cách rửa cột là rửa áp suất thường và áp suất nén[6]:

- Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy xuống nhờ trọng lực

- Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột

Việc giải ly cột có thể được thực hiện bằng áp suất thường hoặc áp suất nén, tùy thuộc vào loại chất hấp phụ và yêu cầu tốc độ chảy của cột Phương pháp rửa cột được lựa chọn dựa trên kích thước hạt silicagel làm pha tĩnh và áp lực sử dụng để giải ly dung môi ra khỏi cột.

Mức độ giữ lại của một hợp chất bởi chất hấp phụ phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly và của chính hợp chất đó.

Để giải li các chất, người ta thường sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần Việc chuyển đổi giữa các dung môi cần thực hiện từ từ, thông qua việc pha trộn với tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần Nếu tăng tính phân cực quá nhanh và đột ngột, điều này có thể dẫn đến việc gãy cột, do sự hấp phụ của các chất.

Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc

Phổ khối lượng là một công cụ quan trọng trong việc xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ, dựa trên nguyên tắc phân mảnh ion của phân tử khi bị bắn phá bởi chùm ion bên ngoài Phương pháp này cung cấp các pic ion mảnh, từ đó giúp xác định cơ chế phân mảnh và tái dựng cấu trúc hóa học Hiện nay, có nhiều loại phổ khối lượng với các phương pháp khác nhau được áp dụng.

EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) relies on the fragmentation of ions caused by a beam of ions bombarding at varying energy levels, with 70 eV being the most common energy used.

Phổ ESI (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) hay còn gọi là phổ phun mù điện tử, được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS Kết quả thu được chủ yếu là các pic ion phân tử cùng với các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.

Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phương pháp phổ bắn phá nguyên tử nhanh với năng lượng thấp, giúp dễ dàng thu được pic ion phân tử.

Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy) cho phép xác định chính xác pic ion phân tử hoặc ion mảnh Kết quả từ phổ khối lượng này, kết hợp với phân tích nguyên tố, giúp khẳng định chính xác công thức cộng của các hợp chất hữu cơ.

Hiện nay, việc kết hợp các phương pháp sắc ký với khối phổ đang trở nên phổ biến và mang lại hiệu quả cao trong việc nhận dạng các hợp chất thông qua thư viện phổ Cụ thể, phương pháp GC-MS (sắc ký khí- khối phổ) được sử dụng cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu, trong khi LC-MS (sắc ký lỏng- khối phổ) thích hợp cho các hợp chất khác Những phương pháp kết hợp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích thành phần của hỗn hợp chất, đặc biệt là trong ngành dược để phân tích thuốc.

1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối, và nhiễu xạ đơn tinh thể tia X là những công cụ mạnh mẽ và phổ biến nhất hiện nay trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) thể hiện tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử, nhưng tần số này bị ảnh hưởng bởi từ trường bên ngoài B0 Để loại bỏ ảnh hưởng của B0, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với chất chuẩn, thường là trimethyl silan (TMS), cho tần số cộng hưởng của TMS Kết quả thu được rất nhỏ (phần triệu), nên giá trị này được biểu thị bằng ppm, thường được gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của proton thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm, trong khi của cacbon-13 dao động từ 0 - 240 ppm.

Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này:

Cách thứ nhất để xác định tần số cộng hưởng là thực hiện theo từng tần số trong toàn bộ dải tần số cộng hưởng, phương pháp này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét.

Cách thứ hai để ghi nhận tần số cộng hưởng là sử dụng biến đổi Fourier nhằm tách riêng từng tần số của các hạt nhân Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (FT-NMR) và hiện đang là phương pháp chủ yếu được áp dụng.

Tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy, với từ trường cao hơn dẫn đến dải tần số kích thích hạt nhân rộng hơn Điều này không chỉ làm tăng độ nhạy và chính xác của phép đo mà còn cải thiện độ phân giải.

Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton

Có nhiều kỹ thuật khác nhau để xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân, mỗi kỹ thuật phục vụ cho việc phân tích các đặc tính cộng hưởng từ cụ thể của hạt nhân Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và độ phức tạp của cấu trúc, người ta có thể thực hiện đo nhiều loại phổ khác nhau Đặc biệt, có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân như 1H hoặc 13C thông qua các phương pháp phổ một chiều.

( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ 2 chiều (COSY, HETCOR, Long-range HETCOR, NOESY )

Trong phổ 1 H-NMR, độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, phụ thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử và đặc trưng riêng của từng phần Các proton cộng hưởng ở các trường khác nhau, dẫn đến việc chúng được biểu diễn bằng các độ dịch chuyển hóa học khác nhau Chẳng hạn, proton liên kết với cacbon thơm thường chuyển dịch trong vùng 6 - 8 ppm, trong khi proton trong alkan thường nằm trong vùng 0 - 2 ppm Phổ proton của một nhóm proton có cùng môi trường hóa học có thể thể hiện dưới dạng một đỉnh, với diện tích của mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng proton tương ứng Hằng số ghép (J) cũng là một thông số quan trọng, cho biết tương tác của proton với các proton lân cận Từ những đặc trưng này, có thể xác định cấu trúc của hợp chất.

Phổ 13C-NMR cung cấp thông tin quan trọng về môi trường hóa học của nguyên tử cacbon, với thang đo từ 0-230 ppm Mỗi nguyên tử cacbon cộng hưởng ở các trường khác nhau, tạo ra tín hiệu phổ đặc trưng Cacbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố có tín hiệu trong khoảng 0-60 ppm, trong khi cacbon liên kết đơn với oxy (như alcol và ether) có tín hiệu trong khoảng 45-85 ppm Cacbon lai hóa sp2 có tín hiệu chuyển dịch trong khoảng 100 ppm.

Nồng độ 150 ppm có thể tăng lên 240 ppm nếu có liên kết đôi với oxy Kỹ thuật đo phổ hiện tại cho thấy phổ NMR của cacbon xuất hiện dưới dạng các vạch đơn, mỗi vạch tương ứng với một nguyên tử cacbon, ngoại trừ những trường hợp có nhiều cacbon chung môi trường hóa học.

Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Trong nghiên cứu in vitro trên các dòng tế bào ung thư, hai phương pháp phổ biến để thử nghiệm so màu là phương pháp MTT và phương pháp SRB.

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) đã trở nên phổ biến, được mô tả lần đầu bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 Phương pháp này sử dụng muối tetrazolium để thực hiện phép thử so màu, nhằm đánh giá sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý hoạt động dựa trên việc vòng tetrazolium gắn vào ti thể của tế bào sống, và dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT chuyển thành màu tím formazan Kết quả thu được từ máy quang phổ cho độ chính xác cao, cho phép đo độ độc của chất nghiên cứu cũng như khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.

Phép thử SRB, được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự vào năm 1990, nhằm đánh giá độc tính của các chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong sàng lọc thuốc quy mô lớn Nguyên tắc của phép thử này dựa trên khả năng nhuộm màu của SRB trên protein, trong khi các mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm sẽ không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.

Phương pháp SRB tận dụng khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid trong protein Trong môi trường axit nhẹ, SRB kết hợp với các dư lượng amino acid trên protein của tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) Sau đó, sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và định lượng mật độ quang của dịch chiết từ tế bào.

Nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất phân lập từ lá Xạ đen sẽ cung cấp thông tin khoa học quý giá về cây Xạ đen, đồng thời tạo ra hướng đi mới trong việc đánh giá tác dụng sinh học của cây này Điều này góp phần hiện đại hóa và khoa học hóa nền Y học cổ truyền.

THỰC NGHIỆM

Mẫu thực vật

- Mẫu được thu tại Xóm Bái Rồng, Thường Tín, Kim Bôi, Hòa Bình

- Thời gian thu mẫu: tháng 6/2016

- Đã thu mẫu và gửi PGS.TS Nguyễn Xuân Phương, Viện sinh thái và

Tài nguyên sinh vật đã xác định tên loài của cây Xạ đen tại Hòa Bình Kết quả giám định cho thấy cây Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll & Mor.

Hình 2.1 Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:

- Máy cất quay chân không

- Bình triển khai sắc ký

- Cột sắc ký thuỷ tinh các kích cỡ

- Bàn cắt, dao cắt bản mỏng

- Bình nuôi cấy tế bào

- Phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur

2.2.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc

Phổ 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) được đo trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy LC-MS Agilent 1260 series Single Quadrupole để đo phổ khối lượng được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCNVN

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản nhôm tráng sẵn Silicagel 60

F254 (pha thường) và RP-18 F254 (pha đảo) độ dày 0,2 mm (Merck-Đức)

Sắc ký cột: Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silicagel pha đảo YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd)

Dung môi chiết và chạy sắc ký: dung môi được sử dụng là:

The DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) or MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) is enriched with L-glutamine, sodium pyruvate, NaHCO3, PSF (Penicillin-Streptomycin sulfate-Fungizone), non-essential amino acids (NAA), and 10% bovine calf serum (BCS) for optimal cell culture conditions.

 Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic

 Các loại chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO

Phát hiện vệt chất: đèn tử ngoại bước sóng 254 và 368 nm, thuốc thử

H2SO4 10% hơ nóng từ từ đến khi vết chất hiện màu

2.2.4 Dòng tế bào (cell lines)

- Dòng tế bào Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

- Dòng tế bào LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư phổi)

- Dòng tế bào MCF-7 (Human bredst adenocarcinoma – Ung thư vú)

- Dòng tế bào HeLa (HeLa cervical cancer cells – ung thư cổ tử cung HeLa)

Chiết phân đoạn

Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích kiệt bằng methanol để chiết các hợp chất ra khỏi lá xạ đen, qua trình cụ thể được thực hiện như sau:

Lá xạ đen được phơi khô và nghiền thành bột (5,8kg), sau đó ngâm trong dung dịch methanol trong 3 ngày Sau khi lọc cặn, dịch chiết được cất để thu cao tổng MeOH, quá trình này lặp lại 3 lần để tối ưu hóa lượng chất chiết xuất Tiếp theo, cao tổng MeOH được chiết phân đoạn bằng n-Hexane và ethyl acetate Đầu tiên, hòa tan cao MeOH với 2 lít nước chia đều vào 2 bình chiết, sau đó thêm 1 lít n-Hexane vào mỗi bình, lắc đều trong 15-20 phút cho đến khi tách thành 2 lớp Cuối cùng, chiết lấy phần n-Hexane và cất để thu cao n-Hexane, quy trình này cũng được thực hiện 3 lần liên tiếp.

Sau khi chiết n-Hexane, hỗn hợp nước được bổ sung 2 lít EtOAc và lắc đều trong 15-20 phút, quá trình chiết với EtOAc tạo nhũ tốt hơn n-Hexane, dẫn đến thời gian tách lớp lâu hơn Sau khi tách lớp, dịch EtOAc được chiết và dung môi được cất, thu được cao EtOAc Quá trình chiết này được thực hiện liên tiếp 3 lần, tổng lượng cao thu được là 34,47g Dưới đây là sơ đồ chiết phân đoạn lá xạ đen.

Hình 2.3 Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen

Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen

Cao ethyl acetate được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel pha thường với hệ giải li D/M, cho ra 6 phân đoạn được ký hiệu từ Ed 1.1 đến Ed 1.6 Sau đó, các phân đoạn này được khảo sát bằng sắc ký bản mỏng và tiếp tục phân lập qua sắc ký cột.

Ehretia asperula Zoll & Mor Ehretia asperula Zoll & Mor

Hòa tan với 2 lít nước Chiết với n-Hexane tỉ lệ 1:1 Cất loại dung môi

Cặn n-hexane Dịch chiết nước

Chiết với ethyl acetate tỉ lệ 1:1

Cặn ethyl acetate (34.47g) Cất loại dung môi

2.4.1 Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5

Tiến hành sắc ký cột phân đoạn Ed 1.2 sử dụng silicagel pha thường với hệ dung môi D/M tỉ lệ 5/1, thu được 3 phân đoạn nhỏ Ed 2.1, Ed 2.2 và Ed 2.3 Đối với phân đoạn Ed 2.3, sử dụng cột YMC và hệ dung môi M/W tỉ lệ 1/2, thu được 37,5mg chất sạch Ed 2.3 Từ phân đoạn Ed 2.1 (488mg), tiếp tục chạy sắc ký cột silicagel pha thường với hệ dung môi H/D/M tỉ lệ 5/15/1 để thu được phân đoạn Ed.

Sau khi tiến hành chạy sắc ký cột silicagel pha thường với hệ dung môi D/A tỉ lệ 5/1, đã thu được 17mg Ed 5.1 Tuy nhiên, quan sát trên sắc ký bản mỏng pha đảo cho thấy Ed 5.1 vẫn còn nhiều vết chất, do đó đã tiếp tục chạy sắc ký cột silicagel pha đảo (YMC) với hệ dung môi MeOH/H2O tỉ lệ 1/1,5, từ đó thu được 7mg chất sạch Ed 5.5.

Quá trình phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 được tiến hành qua sơ đồ sau

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5

Silicagel pha thường Dichlorometane/Methanol

Ed 1.1 Ed 1.3 Ed 1.4 Ed 1.5 Ed 1.6

2.4.2 Phân lập hợp chất Ed 17.3

Tiến hành chạy gradien phân đoạn Ed 1.3 với dung môi dichlorometane/acetone tỉ lệ 5/1 đã thu được phân đoạn Ed 7.3 Sau đó, sử dụng sắc ký cột silicagel pha thường với dung môi dichlorometane/methanol tỉ lệ 2/1 để tách phân đoạn nhỏ Ed 16.4 từ Ed 7.3 Tiếp tục thực hiện sắc ký cột silicagel pha thường với tỉ lệ dung môi D/M khác.

3/1 thu được phân đoạn nhỏ Ed 17.2 Tiếp tục chạy sắc ký cột YMC với hệ dung môi Methanol/nước tỉ lệ 1/3 thu được 51mg chất sạch Ed 17.3

Dưới đây là sơ đồ phân lợp hợp chất Ed 17.3:

Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 dichlorometane /methanol

Silicagel pha thường dichlorometane /methanol

2.4.3 Phân lập hợp chất Ed 11.4

Từ phân đoạn Ed 8.3 tách ra từ Ed 7.2 bằng hệ dung môi dichlorometane/methanol tỉ lệ 7/1, tiếp tục thực hiện sắc ký cột silicagel pha thường với dung môi dichlorometane/methanol tỉ lệ 10/1, thu được phân đoạn Ed 8.9 (300mg) Sau đó, tiến hành chạy cột silicagel pha đảo (YMC) cho phân đoạn Ed 8.9 với dung môi methanol/nước tỉ lệ 1/1, thu được phân đoạn nhỏ Ed 9.2 (220mg) Tuy nhiên, trên bản mỏng vẫn thấy vết chất chưa sạch, nên tiếp tục sử dụng sắc ký cột sephadex cho phân đoạn Ed 9.2 với dung môi methanol/nước tỉ lệ 1/1, thu được hợp chất Ed 11.4 có khối lượng 100mg.

Dưới đây là sơ đồ phân lập hợp chất Ed 14.1:

Hình 2.6 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4

Ed 9.2 (220mg) Silicagel pha đảo

Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm

1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 7,53 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-3); 7,05 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5); 6,96 (1H, dd, J = 8,0 1,5 Hz, H-9) ; 6,79 (1H, d, J 8,0 Hz, H-8); 6,22 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2);

1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 7,53 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-3); 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5); 6,94 (1H, dd, J = 8,0 2,0 Hz, H-9), 6,78 (1H, d, J 8,0 Hz, H-8); 6,25 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2); 3,75 (3H, s, OCH3);

13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 168,6 (C-1); 148,4 (C-7); 145,8 (C-6); 145,7 (C-3); 126,6 (C-4); 121,8 (C-9); 115,3 (C-8); 114,0 (C-5); 113,7 (C-2); 50,8 (OCH )

= 2,0 Hz, H-5); 6,91 (1H, dd, J = 8,0 2,0 Hz, H-9); 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- 8); 6,70 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5’); 6,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8’); 6,57 (1H, dd, J = 8,0 2,0 Hz; H-9’); 6,26 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2); 5,19 (1H, dd, J 10,0 3,5 Hz, H-2’); 3,06 (1H, dd, J = 14,5 5,5 Hz, H-3’a); 3,00 (1H, dd, J 14,5 5,5 Hz, H-3’b);

Hz, H-5); 6,91 (H, dd, 8,5 2,0 Hz, H-9); 6,75 (1H, d, 8,5 Hz, H-8); 6,71 (1H, d, 2,0 Hz, H-5’); 6,64 (1H, d, 8,0 Hz, H-8’); 6,61 (1H, dd, 8,0 2,0 Hz, H-9’); 6,27 (1H, d, 15,5 Hz, H-2); 5,11 (1H, dd, 7,5 5,0 Hz, H-2’), 3,72 (3H, s, OCH3); 3.06 (1H, dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’a), 3,00 (1H, dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’b)

Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)

Nuôi tế bào ung thư in vitro theo phương pháp của Skehan và cộng sự, cùng với việc xác định hoạt tính gây độc của các dòng tế bào ung thư bằng phương pháp SRB của Likhitayawuid và cộng sự, hiện đang được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.

Phản ứng của thuốc nhuộm SRB liên quan đến khả năng bám vào protein của tế bào được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) SRB, một chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với hai nhóm sulfonic, liên kết với các amino acid trong môi trường axit nhẹ và sẽ tách ra trong pH kiềm Lượng chất màu tách ra từ tế bào nhuộm tương ứng với số lượng tế bào có mặt.

Phép xác định gồm hai bước như sau:

Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính

Chuẩn bị tế bào: Hep-G2, LU-1, Dòng HeLa, MCF7

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Edgle hoặc DMEM

Tế bào được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn với CO2 5%, độ ẩm 98% và nhiệt độ 37°C, đồng thời đảm bảo vô trùng tuyệt đối Trước khi tiến hành thí nghiệm, tế bào cần được hoạt hóa trong khoảng thời gian từ 18 đến 24 giờ.

Sử dụng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa bằng đệm PBS Tiến hành pha loãng tế bào trong môi trường sạch, đếm số lượng tế bào và tạo huyền dịch với nồng độ thí nghiệm khoảng 3-5×10^4 tế bào/mL, tùy thuộc vào loại tế bào thử nghiệm.

Mẫu thử: Chất chiết từ thực vật hay sinh vật nói chung

Tạo mẫu gốc (110 mg mL 1 ) trong dung môi DMSO Dimethyl sulphoxide (DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ hơn 1%

Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:

Dãy đối chứng âm: DMSO 10%

Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine) pha tới nồng độ 0,01mM trong DMSO

Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào

Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37 o C trong 3 ngày

Sau khi ủ tế bào trong 3 ngày, chúng được cố định bằng dung dịch TCA lạnh Tiếp theo, tế bào được rửa sạch, để khô và nhuộm bằng SRB 0,4% trong axit axetic 1%, sau đó rửa lại bằng axit axetic 1% để loại bỏ màu thừa Sau khi khô, tế bào được hòa lại trong dung dịch đệm Trisbazơ 10M và lắc ngang Cuối cùng, kết quả được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 515-540mm.

Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS là chỉ số thể hiện khả năng sống sót của tế bào tại nồng độ ban đầu của mẫu thử Nếu giá trị CS ≤ 50%, mẫu đó được xem là có hoạt tính.

Giá trị CS (%) được tính theo công thức:

Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ được tính theo công thức:

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i

: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50

Bước 2: Tìm giá trị IC50

Sử dụng giá trị CS% từ 10 nồng độ khác nhau, chúng ta áp dụng chương trình Table Curve để xác định giá trị IC50 dựa trên thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử.

Trong đó: y: nồng độ chất thử