TỔNG QUAN
Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai
Cầu gai, hay còn gọi là nhím biển, nhum biển, và chôm chôm biển, thuộc lớp cầu gai (Echinoidea) trong ngành động vật da gai (Echinodermata) Chúng được chia thành hai phân lớp: cầu gai đều xuất hiện vào kỉ Silua và cầu gai không đều xuất hiện vào kỉ Jura Hiện nay, có khoảng 800 loài cầu gai đang sống và khoảng 2.500 loài đã tuyệt chủng.
Cầu gai, hay còn gọi là nhím biển, là một loại hải sản đặc trưng với hàng trăm que nhọn như lông nhím xung quanh Chúng sống gần các rạn san hô và rạn đá ven biển, thường có vẻ ngoài bất động Tuy nhiên, dấu hiệu cho thấy chúng là động vật chính là các cây gai có khả năng di chuyển linh hoạt nhờ cơ chế nối kiểu bóng và ổ Có hai loại gai: gai thường giúp vận chuyển và gai kìm có chức năng tự vệ Khi bị chạm nhẹ, Cầu Gai sẽ phản ứng bằng cách hướng các gai về phía tác động Mặc dù không có mắt, chân hay cơ quan di chuyển, chúng vẫn có thể di chuyển dễ dàng nhờ vào các ống dính kết nối với xương sống.
Cầu gai sống ở nhiều độ sâu khác nhau từ đới gian triều tới biển sâu Hiện biết khoảng hơn 70 loài thuộc các chi Salmacis; Temnopleurus; Diadema; Clypeaster [3]
Cá có mặt ở hầu hết các vùng biển trên thế giới, sinh sống trong rạn san hô và có thể tìm thấy từ vùng triều cho đến độ sâu khoảng 70 mét Chúng thường cư trú trên thềm biển, đáy đá và vùi mình trong cát biển.
Ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa là những khu vực quan trọng trong nước, nơi đã phát hiện 13 loài thuộc 9 họ ở vùng biển Côn Đảo Tại Vịnh Nha Trang, có 7 loài được phát hiện, trong khi vùng biển Vịnh Phong Vân – Bến Gỏi, Vĩnh Thái Lan, Phú Yên, Khánh Hòa và Phan Thiết thường xuất hiện nhiều loài có giá trị kinh tế cao.
- Thế giới: Loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vùng biển Bắc Đại Tây Dương từ eo biển Anh Quốc sang New Jersey (Hoa Kỳ)
1.1.3 Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm [7]
Vùng biển Ðịa Trung Hải nổi tiếng với cầu gai ăn được Paracentrotus lividus, một món ăn đặc sản được phục vụ tại các nhà hàng ven biển nơi chúng được đánh bắt Loài cầu gai này có thể xuất hiện tận vùng biển phía Nam Ái Nhĩ Lan và có đường kính lên đến 8 cm Ngoài ra, vỏ ngoài của chúng thường được chế tác thành quà lưu niệm hấp dẫn.
Vùng Bắc Đại Tây Dương, trải dài từ eo biển Anh quốc đến New Jersey, là nơi thường gặp loài Strongylocentrus droebachiensis, mặc dù chúng không được ưa chuộng rộng rãi Loài động vật da gai này phổ biến nhất tại vùng biển Maine, nhưng thị trường tiêu thụ của chúng lại hạn chế, chủ yếu chỉ tập trung ở một vài chợ hải sản như Fulton Fish Market ở New York Việc chuyên chở cũng là một yếu tố cản trở sự phát triển của thị trường này.
Hình 1.1 Cầu gai S droebachiensis (nguồn www.wallawalla.edu)
Xa hơn về phía Nam Ðại Tây Dương, có nhiều loại cầu gai nhỏ hơn, ít ăn được trừ loài Cidaris tribuloides trong vùng West Indies
Tại vùng Đông Nam Á, đặc biệt là ở Phan Thiết (Bình Thuận), cầu gai (Nhum) là một loại hải sản đặc sản nổi tiếng Loài Diadema setosum, mặc dù phổ biến, nhưng chỉ được tiêu thụ ở một số địa phương như đảo Kor Samuy, do có nhiều gai dài và nhọn, dễ gãy và chứa độc Cầu gai đen ở Việt Nam có vỏ đường kính khoảng 10 cm, gai dài đến 20 cm Ngoài ra, loài Diadema palmeri với vỏ đỏ và gai dài 10 cm, cùng với Diadema savignyi có vỏ màu lam-đen và gai dài 13 cm, cũng góp phần làm phong phú thêm nguồn hải sản tại đây Các địa danh như sông Nhum, cầu Nhum, bến Nhum đều liên quan đến cầu gai, khẳng định vị trí quan trọng của loại hải sản này trong ẩm thực địa phương.
Hình 1.2 Cầu gai D setosum (nguồn en.wikipedia.org)
1.1.4 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai
Các nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng thành phần hóa học chính của loài da gai bao gồm steroit, saponin và cerebrosit Trong năm lớp sinh vật thuộc ngành da gai, hai lớp sao biển (Asteroitea) và hải sâm (Holothuroidea) đã được nghiên cứu một cách chi tiết Nhiều công trình khoa học đã công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp sinh vật này, đặc biệt là asterosaponin và cerebrosit từ sao biển, cùng với các hợp chất saponin dạng khung holostan từ hải sâm.
Hiện nay, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển thuộc lớp cầu gai vẫn còn hạn chế Kể từ những năm 1980, các hợp chất sắc tố dạng quinoit đã được phát hiện từ hai loài cầu gai Diadema setosum và D savignije.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã phân lập và xác định cấu trúc hai hợp chất steroid là 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol và cholesterol, cùng với glycerol 1-palmitat và glycerol 1,3-đioleat-2-stearat từ cặn chiết metanol của loài cầu gai D setosum tại Hạ Long, Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol có hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên ba dòng tế bào ung thư người, với giá trị IC50 lần lượt là 2,0, 3,93 và 2,4 µg/ml.
Vào năm 2008, nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã công bố một dẫn xuất gangliosit mới mang tên 1-O-[9-O-metyl-(N-axetyl-α-D-neuraminozyl)-(2→6)-β-D-glucopiranozyl]-ceramit (DSG-A, 2), cùng với bốn gangliosit đã được biết đến trước đó Những hợp chất này cho thấy hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi (neuritogenic activity) trên dòng tế bào thần kinh nội tiết từ tủy tuyến thượng thận của chuột PC.
Nghiên cứu về dòng tế bào pheochromocytoma 12 cho thấy sự hiện diện của nhân tố phát triển dây thần kinh (NGF) có ảnh hưởng tích cực đến hoạt tính sinh học Đặc biệt, hợp chất 2 với nhóm metoxi ở đơn vị đường NeuAc cho thấy hoạt tính mạnh mẽ nhất, chỉ ra rằng việc O-metyl hóa nhánh axit sialic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hoạt tính tạo tế bào thần kinh hình sợi của các hợp chất gangliosit được phân lập từ các loài da gai.
Gần đây, các hợp chất sắc tố napthoquinon đã được phát hiện trong các loài cầu gai như Tripneustes gratilla, Diadema setosum và Paracentrous lividus thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA.
(photodiode array detector) ghép nối khối phổ ESI (electrospray ionization) Kết quả phân tích cho thấy, loài D setosum có sự xuất hiện của các sắc tố spinochrom E
(3), một sản phẩm oxi hóa của echinochrom A, echinochrom A và 6-etyl-2,7- đihiđroxi-3-metoxinaphthazanrin ; loài T gratilla có sự xuất hiện của 3, spinochrom
D (4), 2,3-đihiđro-2,3,7-trihiđroxi-2,3-epoxi-6-etylnapthazarin, echinochrom A, anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7-trihiđroxinaphtazarin) (5), etyliđen-6,6’-bis-(2,3,7- trihiđroxi-naphtazarin); loài P lividus có sự xuất hiện của 3 và echinochrom A [11] spinochrom E (3) spinochrom D (4) anhiđroetyliđen-6,6’-bis-(2,3,7- trihiđroxinaphtazarin) (5)
Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam
Steroit là nhóm hợp chất thiên nhiên phổ biến và thú vị trong hóa học, có mặt rộng rãi trong cơ thể động vật Chúng có nhiều tính chất quan trọng, được ứng dụng trong điều trị bệnh, điều hòa hệ thống nội tiết và chữa viêm khớp Hiện nay, steroit còn được sử dụng trong việc chế tạo thuốc tránh thai, cùng với nhiều ứng dụng trong chăn nuôi và nông nghiệp ngày càng được công nhận Do tác dụng sinh lý của chúng, steroit không chỉ là mối quan tâm khoa học quan trọng mà còn có ý nghĩa lớn trong dược học.
Nhóm chất steroid được phát hiện trong hầu hết các mẫu nghiên cứu thuộc ba nhóm hải miên, san hô mềm và da gai tại Việt Nam Cholesterol là hợp chất có hàm lượng cao và xuất hiện phổ biến trong các loài sinh vật biển thu thập được Hợp chất này đã được phân lập từ loài san hô mềm Cladiella sp., sao biển Archaster tyicus, và hải miên Xestospongia testudinaria cùng Gellius varius.
Các dẫn xuất của cholesterol như 7α-hiđroxi-cholesterol, 7β-hiđroxi-cholesterol và 7α-metoxi-cholesterol đã được phân lập từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Nghiên cứu hóa học của hải miên Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm steroit, bao gồm ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol, cũng như các hợp chất tương tự được tìm thấy ở hải miên Varius, X testudinaria và cầu gai Diadema setosum.
Nghiên cứu hóa học của loài hải miên Haliclona clathrata đã phát hiện hợp chất mới 24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol cùng với các hợp chất (24R)-24-etylcholest-4-en-3,6-đion và (24R)-24-etylcholest-3,6-đion Ngoài ra, từ loài hải miên G varius, các hợp chất cholesterol cholest-7-en-3β,5α,6β-triol và 6β-metoxicholest-7-en-3β,5α-điol cũng đã được phân lập Hơn nữa, saringosterol và cholest-7-en-3-on đã được xác định từ loài hải miên X testudinaria, trong đó saringosterol được ghi nhận có hoạt tính kháng vi khuẩn lao.
Mycobacterium tuberculosis có giá trị nồng độ tối thiểu (MIC) là 0,25 µg/ml, đây là giá trị MIC nhỏ nhất trong các hợp chất thiên nhiên được nghiên cứu tính đến năm 2001, tương đương với MIC của thuốc chữa lao rifampin Hợp chất này không chỉ có độ độc thấp mà còn sở hữu tính đặc hiệu cao.
Gần đây, từ loài hải miên Ianthella sp., các nhà nghiên cứu đã phân lập ba hợp chất steroid mới có cấu trúc vòng propan trong mạch nhánh, bao gồm petrosterol-3,6-đion, 5α,6α-epoxipetroterol và iantheketal A, cùng với petrosterol và aragusterol B.
Từ loài san hô mềm Cladiella sp, các nhà nghiên cứu đã phân lập thành công hợp chất mới 9,11-secosteroitglycozit mang tên cladiasterol, cùng với 3β,6α,11-trihydroxi-24-metyl-9,11-secocholest-7-en-9-on Đây là hợp chất đầu tiên được tìm thấy từ thiên nhiên Ngoài ra, hợp chất 9,11-secosteroit còn bao gồm sarcomilasterol, sarcoaldesterol B và ergosta-1β,3β,5α,6β-tetraol, tất cả đều được chiết xuất từ loài san hô mềm này.
24-nor-5α-cholestan-3β,23,24-triol saringosterol petrosterol-3,6-đion 5α,6α-epoxipetroterol
Sarcophyton mililatensis; Các hợp chất 3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11- secocholestan-5-en-9-on, (24S)-ergostan-3β,5α,6β,25-tetraol được phân lập từ san hô mềm Lobophytum compactum
Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phân lập một số steroid mới từ san hô mềm Lobophytum laevigatum, bao gồm lobophytosterol và (22S,24S)-24-metyl-22,25-epoxifurost-5-en-3β,20β-điol, (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol, cùng với pregnenolon Các nghiên cứu cho thấy lobophytosterol có hoạt tính mạnh mẽ đối với ba dòng tế bào ung thư: phổi, ruột và máu.
3β,11-đihiđroxi-24-metyl-9,11- -secocholestan-5-en-9-on (24S)-ergostan-
Nghiên cứu về thành phần steroid của các loài da gai đã phát hiện nhiều hợp chất đáng chú ý Cụ thể, từ loài hải sâm H scabra, các nhà khoa học đã tìm thấy hợp chất 2α,3β,12α,21,24R,25-hexahydroxylanost-8-en Ngoài ra, từ loài sao biển A typicus, các hợp chất steroid như 27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol, 27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol, ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol và lobophytosterol (24S)-ergost-5-en-3β,7α-diol cũng đã được phân lập.
27-norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β, 14α,15α,24R-octol ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α, 15α,22E,24R,25R,26-nonol
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Tên Việt Nam: Cầu gai Sa-vít
- Tên khoa học: Diadema savignyi
- Địa điểm thu mẫu: Nha Trang
- Người giám định loài: ThS Nguyễn Thị
Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang
Màu sắc của con trưởng thành thường là màu đen, bao gồm cả chóp nón hậu môn Dưới ánh sáng ban ngày, các đốm mắt tạo thành một vòng xanh quanh hệ thống đỉnh Trên mặt lưng, có những đốm trắng xuất hiện trong mỗi đường xen tia, mặc dù không rõ ràng Các con non gai tay có băng ngang, ngay cả khi đường kính ngang của vỏ đạt đến 30 mm, điều này khác biệt với màu đen của các gai ở D setosum.
Mỗi xương ở vùng chân ống có 3 đôi lỗ, với vùng lỗ gần miệng trụi gai và rộng, chứa 2 hàng nấm gai nguyên thủy Vùng trung gian có 2 hàng nấm gai nguyên thủy, thường có 4-5 nấm gai trong mỗi hàng ngang Vỏ trụi gai còn hiển thị các đường sọc xanh giữa các mảnh gián tiếp.
Kích thước: đường kính ngang thường gặp của vỏ ở con trưởng thành từ 40-65 mm (có khi đạt tới 100 mm), chiều cao từ 20-40 mm
D savignyi và D setosum rất giống nhau, nhưng có thể phân biệt chúng qua màu sắc hậu môn Cụ thể, D setosum có một vòng màu cam quanh hậu môn, trong khi hậu môn của D savignyi hoàn toàn đen.
Sinh học -Sinh thái học
Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi
Diadema savignyi sống ở các vùng nước nông Sống trong rạn san hô, từ vùng triều đến độ sâu khoảng 70 mét
Trong nước: ven biển Miền Trung và Quần đảo Hoàng Sa
Thế giới: loài phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương.
Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Marck 1,05715) và RP18 F254S (Merck) có thể được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 368nm Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ trên bếp điện cho đến khi xuất hiện màu.
2.2.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60G F254 (Merck, mã 105875) Quá trình phát hiện chất được thực hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm, hoặc bằng cách cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch.
Để phát hiện vết chất, sử dụng dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng, sau đó ghép lại bản mỏng như ban đầu để xác định vùng có chất Tiếp theo, cạo lớp silica gel chứa chất và giải hấp phụ bằng dung môi phù hợp.
Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là silica gel, bao gồm cả pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh), trong khi silica gel pha đảo ODS hoặc YMC có kích thước hạt từ 30-50 μm, được cung cấp bởi Fujisilisa Chemical Ltd.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được ghi nhận bao gồm 1 H-NMR (600 MHz), 13 C-NMR (150 MHz), HMQC và HMBC, tất cả đều được thực hiện trên máy Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer tại Viện Nghiên cứu khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những phương pháp hiện đại và hiệu quả nhất để phân tích cấu trúc hợp chất Bằng cách kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có khả năng xác định cấu trúc phân tử, bao gồm cả cấu trúc lập thể.
Nguyên lý cơ bản của các phương pháp phổ NMR, bao gồm phổ proton và cacbon, là sự cộng hưởng của các hạt nhân 1H và 13C dưới tác động của từ trường bên ngoài Sự cộng hưởng này được thể hiện qua độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Bên cạnh đó, đặc trưng của hạt nhân còn được xác định thông qua tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau, gọi là spin coupling.
Trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được đo trong thang ppm từ 0-14 ppm Độ dịch chuyển này phụ thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử và các đặc trưng của tương tác spin, từ đó giúp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.
Phổ 13 C-NMR cung cấp tín hiệu cho các nguyên tử cacbon, với mỗi nguyên tử cộng hưởng ở một trường khác nhau, tạo ra các tín hiệu phổ riêng biệt Thang đo phổ 13 C-NMR được tính bằng ppm, với dải rộng từ 0 đến 230 ppm.
Phổ 2D-NMR là một kỹ thuật phổ hai chiều, giúp xác định tương tác của các hạt nhân từ trong phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chính thường được sử dụng trong các luận văn bao gồm.
Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) cho phép xác định các tương tác trực tiếp giữa H và C thông qua các tín hiệu trên phổ Trục phổ đầu tiên là 1H-NMR, trong khi trục thứ hai là 13C-NMR Các tương tác HMQC được thể hiện trên đỉnh của các ô vuông trong phổ, cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc phân tử.
Phổ 1 H- 1 H COSY (Homocosy), ( 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation
Phổ H-NMR thể hiện các tương tác giữa các proton gắn liền với các nguyên tử cacbon gần nhau, cho phép xác định cấu trúc phân tử và mối quan hệ giữa các nhóm chức Thông qua phổ này, các phân tử có thể được liên kết và phân tích một cách hiệu quả.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất sẽ được xác định bằng phương pháp MTT (3-[4,5-đimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom) Nghiên cứu sẽ sử dụng ba dòng tế bào ung thư người, trong đó có HL-60, một loại tế bào bạch cầu cấp tính.
- ung thư máu), PC-3 (human prostate cancer - ung thư tuyến tiền liệt), SNU-C5 (human colon cancer - ung thư ruột kết) được nuôi cấy trong môi trường RPMI
Để nuôi cấy tế bào, 1640 được bổ sung 10% huyết thanh phổi bò (fetal bovine serum) cùng với penicillin/streptomycin với nồng độ 100 U/mL và 100 mg/mL Quá trình này diễn ra ở nhiệt độ 37 °C trong môi trường 5% CO2 được làm ẩm, giúp các tế bào phát triển theo cấp số nhân và sẵn sàng cho các thí nghiệm.
Phương pháp MTT được thực hiện bằng cách xử lý các dòng tế bào ung thư người, bao gồm HL-60 (3 × 10^5 tế bào/mL), PC-3 (5 × 10^5 tế bào/mL) và SNU-C5 (1 × 10^5 tế bào/mL), trong thời gian 3 ngày với các hợp chất ở nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50.
Trong nghiên cứu này, các mẫu được xử lý với nồng độ 100 μM hoặc các cặn chiết ở các nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 μg/mL Sau khi ủ, 0,1 mg (50 μL của dung dịch 2 mg/mL) MTT được thêm vào mỗi giếng và tiếp tục ủ ở 37°C trong 4 giờ Các phiến được ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút và môi trường được loại bỏ cẩn thận Để hòa tan các tinh thể formazan, 150 μL đimetylsunfoxit được thêm vào mỗi giếng, sau đó được đọc ở bước sóng 540 nm trên thiết bị đọc vi phiến Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần và giá trị trung bình được tính toán Kết quả cho thấy phần trăm ức chế dựa trên sự giảm cường độ hấp phụ khi so sánh với đối chứng âm Đường cong phụ thuộc nồng độ được xây dựng và nồng độ ức chế 50 phần trăm (IC50) được xác định cho từng mẫu thử và dòng tế bào Các giá trị IC50 < 100 μM với chất sạch và IC50 < 100 μg/ml với các cặn chiết được coi là có hoạt tính.
