LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu thành phần hóa học của cây sân vũ diệp (panax bipinnatifidius seem) thu hái ở sa pa, lào cai

TỔNG QUAN

Tổng quan về chi Panax L

Vị trí của chi Panax L Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [7]:

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)

Chi Panax L có khoảng 12 loài cây lâu năm và phát triển rất chậm, như sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Nhật Bản (Panax japonicus),…[33] Phân bố một số loài được tổng kết trong bảng sau:

Bảng 1 Phân bố của các loài thuộc chi Panax L

STT Loài Phân bố, vị trí

Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt Nam

2 Panax ginseng C.A.Mey Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc

C.A.Mey Nhật Bản, Hàn Quốc

Miền nam Trung Quốc và một số nơi ở Việt Nam

5 Panax pseudoginseng Wall Nê-pan

K.Sharma & Pandit Vùng Sikkim - Ấn Độ

Feng Trung Quốc, Việt Nam

Grushv Trung Quốc, Việt Nam

11 Panax wangianus S.C.Sun Miền trung, nam Trung Quốc

Feng Vân Nam - Trung Quốc Ở Việt Nam, thuộc chi Panax L có các loài như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.); Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng); Tam thất (Panax noto-ginseng Burk.) [10]

1.1.2 Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)

Nhận biết tại thực địa: Lá thường kép, lớn, mọc so le, có bẹ; cụm hoa chùm–tán; bầu dưới; quả mọng [6,10]

Cây gỗ, bụi hay cây cỏ nhiều năm Lá đơn hay kép, mọc so le, ít khi mọc đối hay mọc vòng Lá kèm nhỏ Hoa thường nhỏ, mọc thành cụm hoa tán đơn Các tán đơn này lại tập hợp trong một cụm hoa kép kiểu chùm tán Hoa đều, lưỡng tính, đôi khi đơn tính, mẫu 5 Đài 5, phần dưới dính lại, phần trên có 4-5 răng nhỏ Tràng 5, rời tiền khai hoa vặn hay lợp Nhị 5, dính với đĩa của bầu Bộ nhụy có 5 noãn dính liền thành bầu dưới, ít khi là nửa dưới, vòi nhụy rời, số ô bằng số lá noãn, mỗi ô chứa một noãn Quả mọng Hạt có phôi nhỏ, nội nhũ nhiều Đa dạng và sử dụng: Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, có cả ở vùng ôn đớn

Việt Nam có 22 chi, khoảng 120 loài, mọc hoang và được trồng làm cảnh, làm thuốc (Đinh lăng, Chân chim)

Là họ có tầm quang trọng trong nền Y học cổ truyền cũng như trong nghành Dược hiện đại Có 12 loài thường được dùng làm thuốc với các tên là Cuồng, Đinh lăng, Ngũ gia, Sâm, Tam thất, Thông thảo

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Panax L

Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ Lá kép chân vịt, mọc vòng 3-5 lá, mép lá chét có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5 Bầu 2-3 có khi đến 5 ô Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [6]

1.1.4 Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem)

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) vốn là một trong những dược liệu quý được sử dụng từ lâu đời Ở Việt Nam, hiện có năm loài cây thuốc thuộc chi Panax, ba trong số đó là những loài bản địa mọc tự nhiên, gồm Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng) So với hai đối tượng sâm Việt Nam (P vietnamensis) và tam thất hoang (P stipuleanatus) đã được nghiên cứu nhiều một cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học thì Sâm vũ diệp chưa có nhiều kết quả nghiên cứu về Sâm vũ diệp a Phân bố

Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal Ở nước ta, sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu) Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng 23 độ vĩ Bắc)

Khả năng bồi bổ sức khỏe và chữa bệnh độc đáo của loài dược liệu này đã khiến trong một thời gian dài chúng bị khai thác mạnh mẽ và thiếu quy hoạch Hiện nay, số lượng và vùng phần bố loài dược liệu trên ở Việt Nam đã suy giảm nghiêm trọng

Dược liệu từ sâm vũ diệp là thân rễ Chưa có các nghiên cứu cụ thể tác dụng của Sâm vũ diệp, nhưng các nghiên cứu về dược lý học của sâm Việt Nam (P vietnamensis) có tác dụng: ngăn chặn ung thư gây bởi các tác nhân hoá học; tác dụng bảo vệ gan in vitro ở chuột; tác dụng giảm thời gian ngủ do thuốc pentobarbital và giảm tổn thương dạ dày ở chuột nhắt chịu stress tâm lý, cũng như có khả năng chống stress [3],…Vì vậy chúng ta có quyền kì vọng sâm vũ diệp sẽ mang lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe tương tự c Thành phần hóa học

Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc thi Panax L Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31] Sự phân loại dược trên cấu trúc hóa học và chia làm các nhóm chính bao gồm: các saponin dẫn chất của 20(S)- protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol, saponin khung dammaran khác, saponin dẫn chất ocotillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic

Bảng 2 Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic thuộc chi Panax L

Các loài sâm khác nhau có thành phần saponin khác nhau, ví dụ như Sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.) hay sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer) có nhiều thành phần khung dammaran

Thành phần hóa học của lá và rễ cây sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều saponin khung dammaran và oleanan Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponins khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd,

Re và Rb3 [28] Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.), trong đó có 3 chất mới bifinoside A-C (1-3), là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [27]

Hình 1 Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ của cây sâm vũ diệp [27]

Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây sâm vũ diệp Liên quan đến tác dụng sinh học, một số hợp chất được xác định là thành phần của sâm vũ diệp có tác dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh,…có thể phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dược học trong việc sử dụng sâm vũ diệp trong y học truyền thống [19]

Nhận xét chung: Một số nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng cây sâm vũ diệp chứa nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao Cho tới nay chưa có kết quả công bố một cách hệ thống thành phần các phân đoạn khác như phần dịch chiết hữu cơ ít phân cực hay phân đoạn polysaccharide tan trong nước Đặc biệt chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý của đối tượng này Do đó việc nghiên cứu một cách có hệ thống hóa thực vật và tác dụng sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dung sâm vũ diệp hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn.

Tổng quan các phương pháp nghiên cứu

- Tiến hành: Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách Dược liệu và Thực tập dược liệu, nhà xuất bản y học [1,2] a Phương pháp định tính flavonoid

- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda hay Willstater) Đây là phản ứng khử hay được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid Cho vào ống nghiệm 2-3 ml dịch chiết ethanol, thêm một ít bột Magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt) Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon [8,9] Phản ứng này dựa trên khả năng chống oxi hóa của flavonoid Màu sắc đôi có thể bị thay đổi tùy theo loại, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon thì âm tính [2,24]

Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu [8,9] Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu Đa số các phân tử flavonoid đều có nhóm OH phenol, do đó nó có khả năng tạo phức màu với Fe 3+ [2,24].

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 5% Sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu vàng Thêm 1 ml HCl, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ tăng lên [24]. b Phương pháp định tính Saponin

Dựa trên tính chất tạo bọt đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin Do phân tử saponin có tính chất hoạt động bề mặt, đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa thân dầu vừa thân nước của phân tử saponin Phần aglycon có tính thân dầu còn phần đường có tính thân nước nên saponin có đặc tính làm giảm sức căng bề mặt và tạo bọt

Khả năng tạo bọt thay đổi theo cấu trúc của saponin: phần genin, số mạch đường, chiều dài mạch đường nhờ đặc tính này mà saponin tạo bọt nhiều khi lắc với nước [2]

Dược liệu được chiết bằng cồn 70%, dịch chiết được bốc hơi trong dung môi và hòa tan lại trong một ít nước Lấy dung dịch này cho vào ống nghiệm Thêm nước cất, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều

Dọc ống nghiệm trong 1 phút (0 lần lắc) Quan sát lớp bọt trong 15 phút, nếu ống nghiệm còn bọt trên bề mặt chứng tỏ có saponin [24] c Phương pháp định tính tanin

Phản ứng Braemer’s: đây là phản ứng kết tủa với kim loại, tanin cho tủa với các muối kim loại nặng như chì, thủy ngân, kẽm, sắt, đồng Với muối sắt, các tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với độ đậm khác nhau Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu [2]

Cách tiến hành: Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, hòa tan

Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% d Phương pháp định tính Steroid

Phản ứng Libermann-Burchardt hay dùng để phân biệt 2 loại saponin triterpenoid và saponin steroid Lấy vài miligram sapogenin (phần aglycon của saponin) hòa nóng vào 1ml anhydride acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ – xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía [1,2]

Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch thử, thêm 1ml chloroform, thêm 2-3 ml anhydride acetic và 1-2 giọt acid sunfuric đặc e Phương pháp định tính volatile oil

Cách tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử, thêm 0,1 ml dung dịch NaOH 5% và một lượng nhỏ dung dịch HCl 5% Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược liệu có chứa tinh dầu [24] f Phương pháp định tính Glycosid tim

Phản ứng Keller-Kiliani: Đây là phản ứng dùng để định tính nhóm chất Glycosid tim, phản ứng dựa trên tính chất của phần đường Mặt ngăn cách có màu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần sẽ thấy lớp trên có màu xanh từ dưới khuếch tán lên Cần chú ý thuốc thử Keller-Kiliani và xanthydrol cũng dương tính với các digitanol glycosid (glycosid có trong Digitalis không phải glycosid tim nhưng có phần đường 2,6-desoxy) [2,24]

Tiến hành: cân 100 mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10ml etanol, hòa tan Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm Sau đó thêm 50 mg methanol trong 2 ml cloroform

Thêm vài giọt H2SO4 đặc, xuất hiện màu xanh đen [9] g Phương pháp định tính đường khử

Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose, maltose…) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid có màu đỏ gạch, qua đó ta định tính được đường khử Định tính đường khử ta sử dụng thuốc thử Fehling 1 (chứa CuSO4) và 2 ( là hỗn dịch của NaOH với muối tartrate của Na và K có công thức NaOOC-CHOH-CHOH- COOK (trong đó -OOC-CHOH-CHOH-COO- là gốc tartrate) h Phản ứng Terpenoid

Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm, hòa tan thêm 1ml chloroform, 2-3 ml của acetic anhydride, 1-2 giọt axit sulfuric đậm đặc [24]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sa pa, Lào Cai vào tháng 3-2016 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia:

TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (PB-001/2016) được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

Hình 3 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa pa, Lào Cai 2.2 Phương tiện nghiên cứu

- Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa- Thụy Sĩ)

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic - Hàn Quốc)

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)

- Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân

- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), đo phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS)

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:

+ Ethanol (EtOH) + Methanol (MeOH) + n-Hexan

+ Dicloromethan (CH2Cl2) + Cloroform (CHCl3) + Ethylacetat (EtOAc) + n-butanol (BuOH)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Metanol, acetonitril) của Merck, Đức

- Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản) + Pha đảo YMC ODS-A (50àm, YMC Co Ltd, Nhật Bản)

- Các dung môi, hóa chất dùng trong định tính (ethanol 25%, ethanol 80% , nước cất, chì acetat 30%, chì acetat 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling

A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussinat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, anhydrid acetic, dung dịch gelatin 1%, cloroform, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%, H2SO4 10%/ EtOH 96%) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân tích định tính

Các phép thử định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách Dược liệu và Thực tập dược liệu, nhà xuất bản Y học [1,2]

Phân tích định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng

2.3.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%- nước

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng lỏng

Quy trình: Thân rễ sâm vũ diệp được chiết hồi lưu 3 lần với ethanol 70 % ở nhiệt độ 70 °C Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, sử dụng máy cô quay chân không dưới áp suất giảm tại 50 °C thu được cao khô Cao khô này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau (ê-te, etyl acetate và butanol), thu được các phân đoạn tương ứng

2.3.3 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hóa học Để phân lập các hợp chất, sử dụng các một số phương pháp sắc ký gồm: sắc ký lớp mỏng (SKLM, dùng để khảo sát), sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM): được thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254

(Merk) và Silicagel RP-18 F254S (Merk) Phát hiện bằng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% Được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

- Sắc ký cột (SKC): được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo

2.3.4 Phương pháp định cấu trúc hóa học các hợp chất

Sử dụng các phương pháp vật lý (đặc điểm cảm quan, điểm chảy, độ quay cực) và phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so sánh với dự liệu công bố trong các tài liệu tham khảo

2.3.5 Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Series Infinity của Agilent Technologies, Hoa Kỳ với đầu dò DAD và bộ phận bơm mẫu tự động Như phần tổng quan về HPLC, việc phân tích định tính, dấu vân tay của một thành phần trong một mẫu hỗn hợp nhiều thành phần như cao chiết dược liệu, phân đoạn dịch chiết,… dựa trên thông số thời gian lưu của một chất sẽ cố định, đặc trưng cho thành phần đó trong điều điều kiện sắc ký xác định.

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong Sâm vũ diệp 3.1.1 Kết quả phân tích định tính các nhóm chất

Sử dụng phân tích định tính với các thuốc thử đặc hiệu theo các tài liệu [1,2], cho kết quả trình bày ở Bảng 4

Bảng 4 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong rễ thân Sâm vũ diệp bằng phản ứng hóa học

TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét

2 Saponon Phản ứng tạo bọt ++ Có

3 Tanin Phản ứng Braemer’s - Không

4 Steroid Phản ứng Libermann-Burchardt + Có

5 Volatile oil Phản ứng với kiềm + Có

6 Glycosid tim Phản ứng Keller-Kiliani - Không

7 Đường khử Phản ứng với TT Fehling + Có

10 Anthraquinon Phản ứng với amoniac - Không

Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ

Nhận xét: sơ bộ kết luận trong thân rễ Sâm vũ diệp có chứa các nhóm chất:

Saponin, steroid, terpenoid, dầu béo và đường khử; không thấy sự có mặt của các nhóm chất: flavonoid, tanin, glycosid tim, alkaloid, anthraquinon

3.1.2 Phân tích định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng

- Sử dụng sắc kí lớp mỏng pha thường và pha đảo silicagel 60 F254 Merk đã hoạt hóa

- Dịch chấm: Dịch chiết cao tổng EtOH, và dịch chiết phân đoạn butanol

- Hệ dung môi: với pha thường CHCl3-MeOH-H2O (70:30:0,4) và CHCl3-MeOH-

H2O (60:30:0,5); với pha đảo MeOH-H2O (1:1) và MeOH-H2O (2:1)

- Thuốc thử phát hiện: H2SO4 10%

Hình 4 Sắc ký đồ pha đảo của cao tổng (T), phân đoạn butanol (Bu) với hệ

Hình 5 Sắc ký đồ pha thường của cao tổng (T), phân đoạn Butanol (EA) với hệ

CHCl 3 -MeOH-H 2 O (70:30:0,4) và CHCl 3 -MeOH-H 2 O (60:30:0,5) Nhận xét: Khi phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH rồi hơ nóng bản mỏng thấy có xuất hiện các vết chất có màu hồng đặc trưng cho thành phần saponin

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn etyl acetat 3.2.1 Chiết xuất và tinh chế các hợp chất

Mẫu thân rễ SVD (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80%, chiết 3 lần (mỗi lần 1500 mL) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol

Lấy 95,0 g cao chiết hòa tan trong nước cất (500 mL) và chiết phân bố bằng Ê-te, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL) Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Ê-te (5,82 g), EtOAc (2,70 g) và BuOH (21,7 g)

Tiến hành phân tích phân đoạn EtOAc(2,70 g) trên cột sắc ký silica gel (Φ40 mm ×

300 mm) với hệ dung môi rửa giải hexane-EtOAc (6:1, v/v, 1800 mL) thu được 5 phân đoạn ký hiệu là E1~E5

Phân đoạn E1 (320 mg) được tiếp tục phân lập sắc ký cột mở pha đảo C18 (Φ20 mm × 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (4:1, v/v, 400 mL) thu được hợp chất số

1 (bột màu trắng, 23 mg) Từ phân đoạn E3 (360 mg), kết hợp chạy sắc ký cột pha đảo C18 (Φ20 mm × 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (5:1, v/v, 400 mL) và sắc ký cột thuận pha silica gel (Φ20 mm × 330 mm) với hệ pha động CH2Cl2-EtOAc (20:1, v/v, 300 mL) thu được hợp chất số 2 (bột màu trắng, 31 mg) Cuối cùng, tinh chế phân đoạn E5 (290 mg) bằng sắc ký cột thuận pha silica gel (Φ20 mm × 300 mm) với hệ pha động CHCl3-MeOH (9:1, v/v, 400 mL) và kết tuả thu được hợp chất số 3 (bột màu trắng ngà, 26 mg)

Hình 6 Sơ đồ chiết xuất Sâm vũ diệp

Hình 7 Sơ đồ phân lập sắc ký 3 hợp chất từ phân đoạn EtOAc

3.2.2 Tính chất vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập

Dữ liệu phổ của 3 hợp chất tinh khiết phân lập từ phân đoạn EtOAc:

Chất số 1 (β-sitosterol): Chất bột màu trắng; t o nc = 136 o C; = - 35 (c 0,5, CDCl3);

ESI-MS: m/z 415,2 [M + H] + ; 13 C NMR (100 Hz, CDCl3): δ 37.4 (C-1), 31,9 (C-2),

Chất số 2 (Oleanolic acid): Chất bột màu trắng; t o nc = 306 o C;

]D α [ = 77 o (c 0,9, CDCl3); ESI-MS: m/z 455,1 [M - H] - , 457,3 [M + H] + ; 13 C NMR (100 Hz, CDCl3): δ

Chất số 3 (Daucosterol): Chất bột màu trắng; t o nc = 285 o C; = - 41 (c 0,5, CDCl3); ESI-MS: m/z 577 [M + H] + ; 13 C NMR (100 Hz, CD3OD-CDCl3): δ 37,4 (C-1), 28,4 (C-2), 79,3 (C-3), 42,5 (C-4), 140,4 (C-5), 122,3 (C-6), 32,0 (C-7), 31,9 (C-8), 50,3 (C-9), 36,8 (C-10), 21,1 (C-11), 38,8 (C-12), 42,5 (C-13), 56,9 (C-14), 24,4 (C-

15), 28,4 (C-16), 56,2 (C-17), 11,9 (C-18), 19,4 (C-19), 36,3 (C-20), 18,9 (C-21), 34,1 (C-22), 26,2 (C-23), 46,0 (C-24), 29,3 (C-25), 19,9 (C-26), 19,1 (C-27), 23,2 (C-28), 12,0 (C-29), 101,2 (Glc-1), 75,9 (Glc-2), 77,3 (Glc-3), 70,2 (Glc-4), 77,7 (Glc-5), 61,9 (Glc-6)

3.2.3 Biện giải cấu trúc 3 chất phân lập

Cấu trúc hóa học của 3 hợp chất (1-3) được xác định trên cơ sở phân tích phổ và so sánh với chất tham khảo (Hình 8)

Hình 8 Cấu trúc hóa học của 3 hợp chất phân lập được từ Sâm Vũ Diệp (1-3)

Chất 1 thu được dưới dạng bột mịn, màu trắng, t o nc 6 o C, trên SKLM khai triển với hệ dung môi n-hexan - ethyl acetat (4:1), vết có màu hồng đến tím sau khi phun

H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng trên bếp gia nhiệt Chấm đối chiếu 1 với β- sitosterol trên TLC, dung môi khai triển là CH2Cl2-MeOH (10:1), 2 chất cho kết quả Rf tương đồng, từ đó dự đoán 1 là stigmast-5-en-3-ol hay còn gọi là β-sitosterol Hơn nữa

] D α[ kết quả đo phổ 1 H và 13 C NMR và sự tương đồng hoàn toàn với số liệu công bố trong tài liệu tham khảo [25] giúp khẳng định cấu trúc của hợp chất 1

Tương tự với chất 1, chất 3 thu được dưới dạng bột màu trắng, t o nc = 285 o C Kiểm tra bằng SKLM với chất đối chiếu là daucosterol, dung môi khai triển là CH2Cl2 - MeOH (9:1), 3 và daucosterol cho kết quả Rf và màu sắc tương đồng Dựa vào đó, chất

3 được dự đoán là β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranosid Phổ 1 H và 13 C NMR của 3 được phân tích chi tiết và so sánh với tài liệu tham khảo [25] giúp khẳng định cấu trúc của 3 là daucosterol Hai hợp chất 1 và 3 là thành phần sterol phổ biến có nhiều cây thuốc tuy nhiên theo tài liệu chúng tôi tra cứu được thì chúng chưa được công bố dưới dạng phân lập tinh khiết từ sâm vũ diệp

Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng Trên phổ ESI-MS của 2 xuất hiện peak ion tại 455,1 [M-H] - và 457,3 [M+H] + phù hợp với công thức phân tử C30H48O3 Phổ 1 H NMR và 13 C NMR của 2 mang đặc điểm đặc trưng của hợp chất triterpene khung oleanane với các tín hiệu của 7 nhóm methyl bậc một proton olefin tại δ 5,26 (1H, br s, H-12) và 1 tín hiệu proton oxymetin (-CH-OH) [δ 3,36 (1H, m, H-3)] [22] Phổ 13 C NMR của 2 xuất hiện 30 tín hiệu cacbon của khung triterpene oleanane, trong đó có 2 olefin cacbon tại δ 122,8 (C-12) và 144,3 (C-13) đặc trưng của nối đôi C-12/C-13 cùng với 1 oxymetin cacbon δ 79,0 (C-3) Từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh số liệu phổ 1 H và 13 C NMR của oleanolic acid được công bố trong tài liệu thấy hoàn toàn phù hợp [22,7] Theo đó hợp chất 2 được xác định là oleanolic acid, đây là lần đầu tiên được phân lập từ sâm vũ diệp

3.3 Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Trong ba chất phân lập được là β-sitosterol (1), oleanolic acid (2), daucosterol

(3) thì oleanolic acid là sapogenin của các saponin khung olean có ý nghĩa trong đánh giá hàm lượng tổng saponin có trong sâm vũ diệp Vì vậy việc định tính và định lượng oleanolic acid bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao-HPLC có ý nghĩa quan trọng trong xây dựng dấu vân tay sắc ký cho dược liệu sâm vũ diệp

Thông qua các tài liệu tham khảo [26,30,31], chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để định tính và định lượng Oleanolic acid như sau:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

- Pha động: CH3OH- CH3COOH 0,15%/H2O (85:15, v/v)

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector UV-DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm

- Tốc độ dòng: 1 ml/min

- Thể thớch bơm mẫu: 20 àl

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng

Pha mẫu chuẩn: cân 2,2 mg oleanolic acid pha vào 1 ml, siêu âm 10 phút rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm, pha loóng thành dung dịch chuẩn cú nồng độ 1000 ppm

Pha mẫu thử: cần 200 mg cao tổng ethanol SVD pha vào 1 ml methanol, siêu âm

10 phỳt rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm

Kết quả: dung dịch thử (cao tổng ethanol) cho pic có thời gian lưu (tR,485 phút) tương tự như thời gian lưu của pic leanolic acid (tR,690 phút)

Hình 9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Oleanolic acid

Hình 10 Sắc ký đồ dung dịch mẫu cao tổng ethanol của SVD

3.4.1 Về phân tích định tính các nhóm chất Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong thân rễ SVD bằng phản ứng hóa học: Kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong mẫu thân rễ SVD chúng tôi thu hái có chứa saponin, terpenoid, steroid, dầu béo và đường khử Kết quả nghiên cứu này cơ bản phù hợp với kết quả đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang của PGS.TS Trần Công Luận và cộng sự [4], tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi không tìm thấy sự có mặt của nhóm chất tanin Định tính bằng sắc kí lớp mỏng: Khi phun thuốc thử H2SO4 10% /EtOH rồi hơ nóng bản mỏng thấy có xuất hiện các vết chất có màu hồng đặc trưng cho thành phần saponin

3.4.2 Về xử lý và chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết

Chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 80% 3 lần (mỗi lần trong 3 giờ), sau đó tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi ê-te, etyl acetate và butanol Kết quả chiết các phân đoạn và phân lập từ thân rễ SVD cho thấy: Hàm lượng (% kl cao/kl dược liệu) cao tổng từ thân rễ SVD sử dụng dung môi EtOH 80% ở 80o C là 19%

Trong đó, hàm lượng (% kl cao/kl dược liệu) cao phân đoạn e-te là 1,17%, phân đoạn EtOAc là 0,54%, phân đoạn BuOH là 4.34%

Trong phân đoạn EtOAc, chúng tôi sử dụng cột nhồi silica gel (Φ40 mm × 300 mm) với hệ dung môi rửa giải hexane-EtOAc (6:1, v/v, 1800 mL) thu dược 5 phân đoạn, tiếp tục tiến hành phân lập sắc ký, thu được ba hợp chất tinh khiết

3.4.3 Về xác định hợp chất phân lập