LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây khôi đốm (sanchezia nobilis hook f)

TỒNG QUAN

Tổng quan về chi Sanchezia

Theo “Hệ thống phân loại về ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)” [5, 29] của tác giả A.Takhtajan, chi Sanchezia có vị trí phân loại như sau:

Giới Thực vật: Plantae Ngành Ngọc lan: Magnolipphyta Lớp Cỏ tháp bút: Equisetopsida C Agardh Phân lớp Mộc lan: Magnoliidae Novák ex Takht

Họ Ô rô: Acanthaceae Chi: Sanchezia

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Sanchezia 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây bụi hay cây cỏ xanh nửa mùa

Rễ cây không có lông

Thân cây trơn màu xanh lá cây tươi sáng với màu tím

Lá dài, lớn đến 26cm, màu xanh đậm có vân trắng kem hoặc vàng, hình mác

Hoa mọc đơn độc hoặc hợp lại thành chùm, hình ống có màu vàng, cam, đỏ, tím mọc ở ngọn, lá bắc có màu đỏ dài khoảng 5cm, đài 5 thùy, tràng 5, dính nhau thành hình ống, nhị 4, 2 nhị lép 2 nhị thò ra, bao phấn 2 ô

Qủa nang, 6-8 hạt, hạt hình cầu [9,17]

Môi trường sống tự nhiên: Trên cạn (rừng mưa nguyên sinh, rừng nhiệt đới thứ sinh) [35]

Khí hậu ưu tiên: nhiệt đới

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Phân bố: Trung tâm của sự đa dạng về loài có nguồn gốc ở Peru và Ecuador [34] Phân bố chủ yếu ở phía Tây Nam Mỹ, một số ít loài phân bố vùng phía Bắc và Đông Bắc Bắc Mỹ, Trung Mỹ và vùng biển Caribean và một số đảo ở Thái Bình Dương [11, 30]

Chi Sanchezia được mô tả lần đầu bởi Ruiz và Pavon với 2 loài thuộc chi vào đầu thế kỉ 18 Đến 1964, Leonard và Smith đưa ra kết luận là có 59 loài và công bố khóa phân loại cho các loài này Năm 2015, Tripp và Koenemann đã thống kê lại và lập danh mục 55 loài thuộc chi Các nhà khoa học đã xác định được tên của 75 loài thuộc chi trong đó 54 tên khoa học được chấp nhận, 9 tên được xác định là tên đồng nghĩa và 12 tên còn lại là chưa được xác định dựa trên dự án The Plant list gồm các loài như: Sanchezia lambra, Sanchezia speciosa, Sanchezia nobilis, Sanchezia oblonga, Sanchezia ovata, Sanchezia parviflora, Sanchezia peruviana, Sanchezia putumayensis,…[30]

Tại Việt Nam, chi này có 1 loài có tên khoa học là Sanchezia speciosa hay Sanchezia nobilis, được gọi là cây Xăng sê, Ngũ sắc hay Khối đốm Phân bố chủ yếu ở miền núi Tây Giang - Quảng Nam, Hòa Vang- tỉnh Đà Nẵng, miền núi Chiêm Hóa, Na Hang- Tuyên Quang), tỉnh Nam Định [5, 7].

Tổng quan về loài Khôi đốm

Tên khoa học: Sanchezia nobilis Hook F.hay

Sanchezia speciosa Leonard Tên Việt Nam: Khôi đốm, Xăng sê, Ngũ sắc [5]

1.2.1 Đặc điểm về loài Khôi đốm

Cây bụi lớn, xanh nửa mùa, mọc lên cao khoảng 3m với thân màu xanh lá cây và gân chính của lá màu trắng không lông [9]

Lá đơn giản, đối diện, lưỡi hình elip, có phiến thon, to, màu lục, đỏ hoặc vàng, gân trắng, đầu nhọn, bìa nguyên hay có răng tà, cuống ngắn, lá đơn mọc đối hình chữ thập, dài 10-25 cm, rộng 3-7 cm, nhẵn, mép lá hơi lượn sóng, mặt trên có màu xanh đậm, mặt dưới màu xanh nhạt; hệ gân lông chim, có 9-12 đôi gân bê

Hoa liên tục quanh năm, được bọc trong các cụm trên một cành dựng đứng, đôi khi ở dưới đáy Phát hoa ở chót nhánh, mọc thành cụm hoa ,bông

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gồm 3 bông nhỏ trở lên, cuống ngắn; lá bắc màu lục hay đỏ, vành hình ống tròn, láng vàng như sáp, đỉnh tù, nhẵn, ôm lấy 1 cụm hoa, cao 4-5cm, tai đều, tiểu nhị thò dài, thụ 2, nép 2, nang 8 hột Hoa lưỡng tính, mùi hoa nhạt đặc trưng [9, 14, 27] Đài nhiều, hình vảy, dài 1,5-1,8cm, rộng 3-5 mm, tròn ở đỉnh [26]

Tràng của cánh hoa hợp nhất, hình ống tròn, màu vàng có sáp, dài 4,5 - 5,5 cm, rộng 7-8 cm ở phía trên với 5 thành thùy tròn, thu hẹp dần xuống dưới đến 3 mm, nhẵn, các thùy dài 3-4 mm, tròn, có khía; chỉ nhị dài, nhị 4 trong đó có 2 nhị phát triển dài 4-4,5 cm, có lông và 2 nhị tiêu giảm [9, 27]

Quả nang có nơ hình trụ, có 8 hạt [9]

1.2.2 Đặc điểm vi học cây Khôi đốm 1.2.2.1 Thân

Thân non vi phẫu hình tròn Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: ngoài cùng là lớp biểu bì cấu tạo bởi một hàng tế bào, có lông che chở đơn bào; tiếp theo là mô dày gồm 6-8 hàng tế bào xếp thành hình tròn khép kín; mô mềm gồm 5-7 lớp tế bào, bên trong có chứa tinh thể calcioxalat hình kim và các hạt tinh bột đơn; libe gần như hình tròn khép kín, libe ở ngoài, gỗ ở trong, thỉnh thoảng bị gián đoạn bởi một số tế bào mô mềm; mô mềm ruột cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào, các tế bào thành mỏng, to, hình đa giác xếp lộn với nhau [1,12]

Thân già vi phẫu hình vuông Cấu tạo tương tự thân non, ngoại trừ có thêm lớp bần bên ngoài cùng

Hình 1.1 Đặc điểm vi phẫu thân [6]

Chú thích: 1- Biểu bì; 2- Mô dày; 3- Mô mềm; 4- Sợi 5- Libe; 6- Gỗ; 7- Tinh thể calci oxalat hình kim ; 8- Mô mềm ruột

Vi phẫu gân lá lồi lên ở 2 mặt trên và dưới Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác xếp đều đặn nhau Mô dày trên và mô dày dưới cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành dày lên ở các góc Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, gần tròn bên trong có chứa các tinh thể canxi oxalat và các hạt tinh bột, rải rác có các bó mạch phụ Libe gỗ xếp thành hình vòng cung gồm libe ở phía ngoài và gỗ ở phía trong Một số tế bào biểu bì thành lông che chở, lông tiết

Vi phẫu phiến lá: Gồm biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi 1 hàng tế bào đa giác sắp xếp đều đặn nhau Mô giậu ngay dưới biểu bì trên cấu tạo bởi

2 hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp đều đặn nhau Mô khuyết cấu tạo bởi các tế bào hình gần tròn xếp lộn xộn

Vi phẫu cuống lá hình chén, có các đặc điểm tương tự gân lá, tuy nhiên có thêm lớp mô dày sát lớp biểu bì [1, 12]

Hình 1.2 Đặc điểm vi phẫu lá [6]

Chú thích: 1- Biểu bì trên; 2- Mô dày trên; 3- Gỗ; 4- Libe; 5- Mô mềm; 6- Mô dày dưới; 7- Biểu bì dưới; 8- Mô giậu; 9- Mô khuyết

1.2.3 Đặc điểm vi học bột dƣợc liệu 1.2.3.1 Bột thân

Bột có màu xanh lá hơi vàng, vị đắng Soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau: Mảnh bần màu nâu Mảnh biểu bì mang lông che chở Mảnh mạch xoắn và mạch điểm Tinh thể calci oxalat hình kim Sợi Tinh bột Lông che chở [1,12]

Hình 1.3 Đặc điểm vi phẫu bột thân [6]

Chú thích: 1- Mảnh mô mềm; 2- Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột;

3- Mô dày 4- Mạch xoắn; 5,6- Mạch điểm; 7- Tinh thể calci oxalat hình kim;

8- Sợi; 9- Hạt tinh bột; 10- Lông che chở

Bột lá có màu xanh nhạt, vị hơi đắng, soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm: Mảnh biểu bì, mảnh biểu bì mang lông tiết, mảnh biểu bì mang lỗ khí, lông che chở Mảnh mô mềm Mảnh mô khuyết Mảnh mô

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU giậu Mảnh mô dày Mảnh mạch xoắn Mảnh mạch điểm Sợi.Tinh thể calci oxalat hình kim Lông che chở, lông tiết Tinh bột [1,12]

Hình 1.4 Đặc điểm vi phẫu bột lá [6]

Chú thích: 1- Lỗ khí; 2-Mảnh mô mềm; 3- Mảnh mô dày; 4- Mảnh mạch xoắn; 5,6-Mảnh mạch điểm; 7-Tinh thể calci oxalat hình kim;

Cây được trồng ở Hà Nội, Huế [7] Cây phát triển mạnh ở nơi có khí hậu mát mẻ và trong lành Chính vì vậy cây Khôi đốm được phân bố ở các huyện miền núi cao như Tây Giang, tỉnh Quảng Nam, huyện Hòa Vang thành phố Đà Nẵng, và ở một số huyện miền núi Chiêm Hóa tỉnh Tuyên Quang [5]

1.2.5 Thành phần hóa học của lá Khôi đốm

Một số nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy cây Khôi đốm chứa hàm lượng flavonoid và các hợp chất glycosid cao Năm 2016, theo nghiên cứu về chiết xuất từ lá Khôi đốm của tiến sĩ Vũ Đức Lợi và cộng sự khác đã cô lập được 4 hợp chất [19] :

Năm 2015, Md Abu Shuaib Rafshanjani và cộng sự khác đã nghiên cứu và chỉ ra rằng: trong dịch chiết của lá cây Khôi đốm có sự hiện diện của các alkaloid, glycoside, flavonoid, triterpenoid, carbohydrat, steroid, hợp chất phenolic, saponin và tannin Phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ lá cây là

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU dương tính đối với tất cả các chất hoá học được thử nghiệm trong khi phân đoạn n-hexan là âm tính đối với flavonoid và các hợp chất phenolic [23]

Từ các bộ phận khác nhau của cây, đã có 14 hợp chất được phân lập:

Các bộ phận trên mặt đất của cây Khôi đốm Năm 2013, Ahmed E.Abd Ellah và những thành viên khác đã phân lập được 5 chất trong đó có 1 hợp chất matsutake alcohol và 4 hợp chất alcohol glycosid [14]

 3-O-β-arabinopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranosyl-(1-6)-β- glucopyranosyl-1-octen-3-ol (5)

Nghiên cứu rễ và vỏ cây cho thấy sự hiện diện của alkaloid, glycosid, steroid, terpenoid và tannin [24]

Từ dịch chiết methanol của lá và rễ cây Khôi đốm, Ahmed E đã phân lập được 6 hợp chất khác nhau:

 9-O-β-xylopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- glucopyranosyltrans-cinnamyl alcohol (7)

 Một hợp chất neolignan glucosid: 4-O-β -glucopyranosyl dehydrodiconiferyl alcohol (9)

 Hai hợp chất benzyl alcohol glycosid: 7-O- β -glucopyranosyl benzyl alcohol (10) và 7-O- β -apiofuranosyl-(1→6)-O- β -glucopyranosyl benzyl alcohol (11)

Từ dịch chiết methanol lấy từ hoa của cây Khôi đốm, nhóm nghiên cứu cũng phân lập được 3 hợp chất flavonoid: apigenin-7-O-β–glucopyranoside

1.2.6 Tác dụng dƣợc lý 1.2.6.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thƣ

Năm 2013 ,Paydar M và các nhà nghiên cứu khác đã sử dụng phương pháp MTT để kiểm tra tính độc của tế bào: tế bào ung thư vú ở người, ung thư da SK-MEL-5 và tế bào màng trong tĩnh mạch ở người như tế bào nội mô mạch rốn HUVEC Dịch chiết methanol từ lá cây cho thấy hoạt tính gây độc tế bào cao nhất trên MCF-7, trung bình với SK-MEL-5, và thấp nhất trên HUVEC [22]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu

Mẫu lá cây Khôi đốm sau khi đã rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40 o C trong vòng 3 giờ Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol

Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan và ethyl acetat (3 lần) Các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng

Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng, tiến hành xử lý và phân lập Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm

(Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau

Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s, độ dày 0,25 mm (Merck) Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ

Sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck) Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên bếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR,

13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố a Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3] b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ ( 1 H, 13 C ) được đặt trong một từ trường ngoài (B 0 ), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay

Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0 Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-

Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao

Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton [3]

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1 H hay

13C) như trong các phổ một chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY)

Phổ proton ( 1 H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba… tới đỉnh thành phần Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ( 13 C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp 3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm Carbon lai hóa sp 2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử

Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [3]

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất

Lá Khôi đốm được rửa sạch, phơi khô, làm nhỏ Cân 2,5 kg lá cây Khôi đốm đã làm nhỏ và ngâm chiết bằng 8L dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, rút lấy dịch chiết lần một Bổ sung thêm dung môi ngập dược liệu 2-3cm (8L/lần) và tiếp tục chiết thêm hai lần, thu được dịch chiết lần hai và lần ba

Gộp dịch chiết 3 lần, lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc đem cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm thu được khoảng 150 g cao chiết tổng ethanol

Hòa tan 100g cao đặc trong nước nóng, tỷ lệ thể tích cao đặc : nước cất nóng (1 :1) thu được dịch chiết nước Dịch chiết nước đem lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi trong 30 phút, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng Các phân đoạn dịch chiết được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy ở nhiệt độ 60 0 C đến cắn thu được các cắn tương ứng n-hexan (9,2 g), ethyl acetat (28,8 g) và dịch nước còn lại (26,6 g)

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Khôi đốm

Tiến hành phân tích cắn EtOAc (25,0 g) trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan- EtOAc (5:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3- MeOH (10:1→ 1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500mL) thu được 6 phân đoạn ký hiệu là E1~E6

Phân tán trong nước cất Lắc với n-hexan

Dịch chiết nước Thu hồi n-hexan

Thu hồi ethyl acetat Dịch chiết nước

Từ phân đoạn E1 (8,1g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động EtOAc - MeOH (5:1, v/v, 2,5L) thu được 6 phân đoạn nhỏ hơn là E1.1~ E1.6

Phân đoạn E1.1 (0,9 g) tiếp tục tiến hành sắc ký cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa n-hexan:etylacetat 4/1, thu được chất X1 (21 mg)

Từ phân đoạn E1.2 (1,1 g) tiến hành sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ethyl acetat (8/1, v/v) thu được hợp chất X2 (15mg)

Phân đoạn E1.3 (1,2 g) được chạy sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan:CH2Cl2 (2:1, v/v) thu được hợp chất X3 (16 mg)

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

Silica gel pha thuận n hexan: EtOAc CHCl 3 : MeOH hexan- EtOAc n-hexan- EtOAc (5:1→1:1),

3.2 Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 3.2.1 Hợp chất X1

Tính chất: kết tinh hình phiến, không màu [α]D 25

Nhiệt độ nóng chảy Mp #8-239 o C

Rf = 0,51 (TLC silica gel, n-hexan/ EtOAc, 7:3, v/v)

ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 277 [M+H] + ứng với công thức phân tử (C 16 H 20 O 4 ), M= 276

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất X1

Phổ 1 H-NMR (CDCl3,500MHz), 13 C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X1 được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR và DEPT của hợp chất X1 và chất tham khảo

OH-9 3,41 (d, 7,4) 3,41 ( d, 7,4) Ghi chú: δ H , δ C Phổ 1 H-NMR (CDCl3,500MHz), 13 C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất tham khảo [15] Đơn vị : δ H và δ C là ppm; J là hằng số tương tác spin- spin giữa các proton và có đơn vị là Hz

Biện luận công thức cấu tạo:

Chất X1 kết tinh hình phiến, không màu, nhiệt độ nóng chảy: 238-239 o C, Rf=0,5 (n-hexan/ethyl acetat: 7/3, v/v); Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z=277 [M+H] + , tương ứng với khối lượng phân tử là 276

Các dữ liệu phổ khối và phổ 13 C-NMR cho biết chất X1 có công thức phân tử là C16H20O4 (DBE=7) Phân tích các dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT của X1 cho thấy chất X1 có khung tương đồng với chất Chloranthalacton B bao gồm một nhóm α, β-ethylen-γ-lacton ở ở δC 156,3; 128,0 và 171,0 ppm Một vòng cyclopropan gồm 1 nhóm methylen cho tín hiệu ở δ H 0,67 (1H, dt, J = 3,9;

5,3 Hz), 0,82 (1H, dt, J = 5,3, 8,7 Hz); δC 15,7 (C-2) và 2 nhóm methin ở δ H 2,11 (1H, br, dt, J = 3,9; 8,7 Hz ); δ C 22,8 (C-1) và δ H 1,96 (1H, m); δ C 23,6 (C-3) Tín hiệu của nhóm >C=CH2 cũng được quan sát thấy trên phổ 1 H- NMR, 13 C-NMR ở δC152,2; 106,0 và δH 4,70 (1H, br, t); 5,01 (1H, m, OH)

Tuy nhiên có 2 điểm khác biệt đó là thay vì nhóm oxiran trong Chloranthalacton B thì trong X1 xuất hiện một nhóm -CH-OH và 1 nhóm methoxy thể hiện trên phổ 13 C-NMR và 1 H- NMR ở δC 79,6 (C-9), δH 3,83

(1H, d, J =7,4 Hz, H-9), 3,41 (1H, d, J = 7,4 Hz, OH) δC 50,3 (OCH 3 ) và δ H 3,22 (3H, s, OCH 3 )

Phân tích các dữ liệu trên phổ 1 H- NMR, 13 C-NMR và các phổ 2D-NMR của chất X1 kết hợp so sánh các dữ liệu phổ trong tài liệu [15], khẳng định chất X1 chính là 9-hydroxyheterogorgiolid

Tinh thể màu vàng, tan trong cloroform

Nhiệt độ nóng chảy tnc = 178-180 o C Phổ khối lượng HR-ESI-MS (+) m/z: 252,08 [M+H] + , ứng với CTPT

Hình 3.4 Cấu trúc của hợp chất X2

Phổ 1 H-NMR (CDCl3,500MHz), 13 C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X2 được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR và DEPT của hợp chất X2 và chất tham khảo Q

Biện luận công thức cấu tạo:

Hợp chất X2 dạng tinh thể màu vàng, tan trong cloroform, nhiệt độ nóng chảy 178-180 0 C và cho phản ứng với thuốc thử Dragendorff Trên phổ HR-ESI- MS của X2 xuất hiện peak ion giả phân tử tại m/z 252,08 [M+H] +

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ứng với khối lượng phân tử là 251 và kết hợp với phổ 1 3 C-NMR cho phép khẳng định công thức phân tử của X 2 là C 15 H 10 N 2 O 2

Phổ 1 H-NMR của X2 cho tín hiệu doublet đặc trưng của proton H-4 tại δ 7,98 và H-5 tại δ 6,93 với hằng số tương tác J = 9,5 Hz; một cặp proton vicinal H-1 tại δ 7,80 và H-2 tại δ 8,74 với J = 5,0 Hz Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của một nhân thơm ABX với ba proton tại δ 8,16 (1H, d,

Hz, H-11) Sự hiện diện của nhóm methoxy được chỉ ra tại δ 56,0 (C-17) và δ 3,98 (3H, s, H-17) Nhóm này gắn với C-9 dựa vào tương tác H-17/C-9 trong phổ HMBC Kết hợp các dữ liệu phổ của X2 và đồng thời so sánh với tư liệu [16, 28], khẳng định X 2 là 9-methoxycanthin-6-on, một alkaloid

Chất bột màu trắng, vô định hình [α]D 25

= -80,5(c=0,1, MeOH) Phổ ESI-MS: m/z 263,2 [M+H] + Công thức phân tử: C16H22O3 M= 262

Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất X3 Phổ 1 H-NMR (CDCl3,500MHz), 13 C-NMR (CDCl3,125MHz) của chất X3

Phổ 13 C-NMR (CDCl 3 , 125 MHz) δ(ppm): 169,7(C-2); 117,2(C-3);

Phổ 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ(ppm): 5,81(1H, s, H-3); 1,68(1H, m, H-4a); 1,16 (1H, m, H-5α)/1,68 (1H, m, H=5β); 1,97(1H, m, H-6); 5,36(1H, d, J=5.0Hz, H-8); 2,77(1H, m, H-8a); 1,52 (1H, dd, J.5, 13.5Hz, H-9α)/2,34 (1H, dd, J=3.5, 13.5Hz, H-9β); 1,37(1H, s, H-10); 1,24(1H, s, H-11); 1,62(1H, s, H-12); 3,17(1H, s, OMe)

Hợp chất X3 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng Phổ khối lượng ESI-MS của X3 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 263,2 [M+H] + , phù hợp với công thức phân tử C16H22O3, (M = 262)

Phổ 1 H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 2 proton olefin tại δH 5,36 (d,

J=5,0 Hz) và 5,81 (s); 1 methoxy tại δH 3,17 (s); và 3 methyl tại δH 1,24 (s), 1,37 (s) và 1,62 (s) 1 nhóm carbonyl tại δC 169,5; 4 carbon bậc 4 tại δC 38,7, 107,5, 134,2 và 173,0; 4 methin tại δC 30,1, 47,7, 117,2 và 123,5; 3 methylen tại δC 18,4, 30,9 và 40,2; và 4 methyl tại δC 23,1; 25,2; 25,7 và 50,3

Từ dữ liệu phổ 1D-NMR của X3 dẫn đến gợi ý về cấu trúc của X3 tương tự hợp chất O-methyl furodysinin lacton [13] Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với carbon

Phổ HMBC, thấy xuất hiện tương tác giữa H-10 (δH 1,37)/H-11 (δH 1,24) với C-3a (δC 173,0)/C-4 (δC 38,7)/C-4a (δC 47,7), H-3 (δH 5,81) và C-2 (δC

Định dạng
Số trang	42
Dung lượng	1,53 MB