LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu thành phần hóa học trong rễ cây phong quỳ sapa (anemone chapaensis gagnep )

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CHI Anemone

- Vị trí phân loại Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên

(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

- Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống nhiều năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi Lá mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có một bao chung gồm 3 lá chét Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5-10 phiến; tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành đầu [3]

- Phân bố Phân bố chủ yếu ở miền bắc Ấn Độ, Nepal, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Bắc Mỹ… [13,30]; chi Anemone có khoảng 120-150 loài [4,27,11], trong đó đã phát hiện ở Trung Quốc khoảng 50 loài

Chi Anemone hay Phong quỳ ở Việt Nam, xuất hiện nhiều ở các tỉnh vùng núi phía Bắc như: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang và vùng núi cao miền trung [1], [2], [3]

Việt Nam có 05 loài là A japonica, A rivularis, A chapaensis, A polilanei, A sumatrana, trong đó có 02 loài được nghiên cứu nhiều là A japonica và A rivularis

Thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Anemone là saponin và flavonoid trong rễ và lá của các loài như Anemone tomentosa, Anemone rivularis, Anemone altaica, Anemone amurensis, Anemone anhuiensis, Anemone begoniifolia, Anemone coronaria, Anemone flaccida var hofengensis, Anemone hupehensis, Anemone raddeana, Anemone taipaiensis [8,14,15,17,18,20-23,31-34] Ngoài ra trong các loài Anemone còn chứa diterpenoid glycosid, coumarin, một số acid béo

Sơ lược các hợp chất được tách ra từ chi Anemone

Saponin chính trên chi Anemone

Hình 1.2: Một số saponin tách ra từ Anemone amurensis (Korsh.) Kom

Anemone anhuiensis Y K YANG, N WANG et W C YE (Ranunculacese) [32,33]

Hình 1.3: Một số saponin tách ra từ Anemone anhuiensis Y K YANG, N WANG

Hình 1.4: Một số saponin tách ra từ Anemone begoniifolia H.Lév & Vaniot

Hình 1.5 : Một số saponin tách ra từ Anemone coronaria L

Anemone hupehensis LEM var japonica (THUNB.) BOWLES et STEARN [17,29,34]

Hình 1.6: Một số saponin tách ra từ Anemone hupehensis LEM var japonica

Hình 1.7: Một số saponin tách ra từ Anemone raddeana Regel

Anemone rivularis var flore-minore Maxim [8]

Hình 1.8: Một số saponin tách ra từ Anemone rivularis var flore-minore Maxim

Hình 1.9: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

Hình 1.10: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

1.1.3 Tác dụng sinh học và công dụng 1.1.3.1 Công dụng trong dân gian

Cây phong quỳ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh về tim (phối hợp với các thuốc khác), điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [2]

Các saponin nhóm triterpenoid là thành phần chính trong rễ của chi này có tiềm năng cao trong kháng u, kháng khuẩn, chống oxi hóa, chống viêm… [9], [28], [35]

Trong y học dân gian Trung Quốc, hơn 10 loài đã được nhắc đến và sử dụng

Ví dụ: trong dược điển Trung Quốc, thân rễ của A raddeana được dùng để điều trị bệnh thấp khớp và đau thần kinh [26]; A rivularis được sử dụng để điều trị bệnh viêm gan, viêm cơ, đau khớp, phù nề… [30]; rễ của A tomentosa được người dân Trung Quốc dùng điều trị bệnh lỵ, sốt rét, suy dinh dưỡng trẻ em.Ở một số nước Châu Á thì

A japonica dùng chữa bệnh về tim (phối hợp với thuốc khác), A rivullaris để điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [3].

TỔNG QUAN VỀ CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis Gagnep.)

Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Phong quỳ Sa Pa

A chapaensis Gagnep., và mộtnghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật (vi phẫu, soi bột), và một nghiên cứu về thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Vào năm 1929, Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep được nhà thực vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên [11] Cây Phong quỳ Sa Pa được mô tảlà cây thảo, thân 2-4cm mang lá chụm ở đất Lá có cuống dài 10-15cm, mềm, có lông rải rác; phiến hình tim có 3 thùy, không lông, bìa có răng tròn Trục mang hoa cao hơn 20cm; lá hoa 6-7, dài 2-3,5cm; lá đài 5, đầu tù hay lõm, cao 2-4cm; tiểu nhụy nhiều; tâm bì không lông, không vòi nhụy Quả bế không cọng, không lông, dẹp dẹp, dài 4- 5mm [13], [36], [11]

Hình 1.11: Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep [37]

Hình 1.12: Ảnh chụp rễ Phong Quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

Hình 1.13 Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep

(Hình ảnh từ internet: http://vietnamplants.blogspot.com/)

Anemone chapaensis là loài đặc hữu của miền Bắc Việt Nam mới chỉ gặp ở Sa

Pa, tỉnh Lào Cai., Cây mọc rải rác trong rừng vùng núi đá, nơi ẩm, ven khe suối, ở độ cao 1200-1500m Ưa bóng, mát Tái sinh bằng thân rễ [13], [1], [11]

1.2.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Hiện tại đã có một số nghiên cứu về đặc điểm thực vật , thành phần hoá học và tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.).

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực vật được tiến hành trên phần rễ cây Phong quỳ Sa Pa khi cây có đủ hoa, quả được thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và mẫu tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai được giám định bởi TS.Đỗ Thị Xuyến; được lưu giữ tại phòng Bách thảo thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Mẫu dược liệu được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.

NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: cồn 96%, n-hexan, ethyl acetat, n- butanol, nước cất

- Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ

- Bản mỏng silica gel F254 và RP-18 F254S tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck)

- Bột silica gel pha thường cỡ hạt 40-200 àm, pha đảo RP-18 cỡ hạt 30-50 àm (Merck)

- Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shellab, đèn tử ngoại

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít, máy cất quay

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR, pipet chính xác…

- Máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

- Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dược liệu - Bộ Y tế; Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất

Rễ cây Phong quỳ được rửa sạch sau khi thu hái, sau đó được thái nhỏ và phơi khô trong bóng râm Mẫu tiếp tục được đem chiết nóng ở 70 o C bằng dung môi cồn 96%, chiết 3 lần sau đó gộp dịch lại và tiến hành cất thu hồi dung môi và thu được cao toàn phần Ethanol

Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân bố qua ba phân đoạn n- hexan, ethyl acetat, n-Butanol Mỗi phân đoạn chiết 3 lần, sau đó dịch chiết ở mỗi phân đoạn được đem đi cô thu hồi dung môi và thu được cao trên các phân đoạn

Phân đoạn n-Hexan Phân đoạn nước 1

Phân đoạn BuOH Phân đoạn nước 3 chiết nóng 3 lần với cồn 96% thu hồi dung môi

Phân tán trong H2O chiết phân đoạn với n-Hex thu hồi dung môi

Chiết phân đoạn với BuOH thu hồi dung môi thu hồi dung môi

Chiết phân đoạn với EtOAc

Hình 2.1: Sơ đồ quá trình chiết xuất Rễ Phong quỳ Sapa

Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng và tiến hành xử lý và phân lập Quá trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương pháp sắc kí cột với các chất hấp phụ là hạt silica gel pha thường, pha đảo Sắc ký lớp mỏng được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu [6]:

 Sắc ký cột: o Cột thủy tinh: đường kính thay đổi từ 1-10cm, chiều dài từ 30-100 cm o Pha tĩnh: thường dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm (dùng cho cột to đường kính khoảng 10 cm) hoặc 40-63 μm (dùng cho cột có đường kính 5 cm trở xuống); silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm o Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột: Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột o Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

 Sắc ký lớp mỏng (TLC): o Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 GF254 và pha đảo RP-18 (Merck) o Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch acid sulfuric 10% sau đó sấy nóng bản mỏng ở 110 0 C trong khoảng

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng SKLM ) được xác định căn cứ vào tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ: phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC ) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

Rễ Phong quỳ thu hái tại Sa Pa được sấy ở 60 o C đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu

Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130 o C Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả, đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 12,7%

Rễ Phong quỳ làm nhỏ được chiết nóng với cồn 96% ở 70 o C (chiết 3 lần, mỗi lần 8 tiếng) Dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm đến cắn để thu được cắn toàn phần, ký hiệu là PQR Với 2500g rễ Phong Quỳ thu được 245g cắn toàn phần

Hòa cắn toàn phần PQR với một lượng vừa đủ nước nóng 60 o C Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, ethyl acetat và n-butanol Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để được kí hiệu lần lượt là PQRH, PQRE và PQRB

Bảng 3.1 Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết Ethanol rễ Phong quỳ Sa Pa

% so với nguyên liệu khô

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây Phong quỳ Sapa

3.2.1 Phân lập một số hợp chất trong rễ cây Phong quỳ Sa Pa

Phân lập các chất có trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột Cột sắc ký được làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột Nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột pha thuận là silica gel Ổn định cột trong 12-24h

Cắn Buthanol (PQRB – 100g) được phân lập trên cột pha thuận silica gel, rửa giải với hệ dung môi EtOAc:MeOH:H2O theo gradient nồng độ từ tỷ lệ EtOAc:MeOH: H2O :1: 0,3 đến MeOH 100% Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng và dồn các ống có sự tương đồng cao, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 2 phân đoạn có tiềm năng: PĐ13 và PĐ25

Phân đoạn PĐ13 (1,3 g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa giải gradient với hệ dung môi metanol-nước với tỷ lệ metanol tăng dần từ 70% đến 85%

Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành phần thu được 2 phân đoạn nhỏ có tiềm năng : PĐ13.1, PĐ13.2 Phân đoạn PĐ13.2 có hợp chất kết tinh màu vàng, loại dung môi thu được chất PQRB2 (60mg)

Phân đoạn PĐ25 (1,5g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa giải gradient với hệ dung môi metanol-nước đẳng dòng với tỷ lệ metanol 70%

Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành phần thu được 2 phân đoạn nhỏ PĐ25.1 và PĐ25.2 Phân đoạn PĐ25.1 có hợp chất kết tinh màu vàng nhạt, loại dung môi thu được PQRB3 (75mg)

Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây Phong quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

3.2.2 Nhận dạng các chất phân lập

Hợp chất PQRB 2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, khối lượng phân tử được xác định là 866,5 dựa vào pic ion (+) tại m/z 889,4 [M-Na]+ trên phổ khối ESI-MS, tương ứng với công thức phân tử C46H74O15 với độ bất bão hòa là 10.Nhiệt độ nóng chảy : 280-283 o C

Phổ 1 H-NMR của hợp chất thể hiện 7 tín hiệu methyl mũi đơn tại δH 1,07 (s, H-23); 0,88 (s, H-24); 0,96 (s, H-25); 0,82 (s, H-26); 1,18 (s, H27); 0,92 (s, H-29);

0,96ppm (s, H-30), kết hợp với hai tín hiệu carbon không no tại δC 123,48 (C-12) và 145,02 (C-13) và một tín hiệu carboxylic tạiδC 181,78 (C-28)trên phổ 13 C-NMR Điều này gợi ý rằng hợp chất PQRB 2 mang khung triterpenoid loại oleanan [31]

Hình 3.2: 7 tín hiệu methyl mũi đơn

Hình 3.3 : Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT

Hình 3.4 : Phổ 13 C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic

Căn cứ vào dữ liệu phổ trên ta thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu cacbon của phần aglycon ( khung triterpenoid loại oleanan )

Kết hợp cùng các tài liệu tham khảo ta dựng được khung oleanan

Hình 3.5 : Cấu trúc khung oleanan

Thêm vào đó, phổ 1 H-NMR còn thấy sự xuất hiện của 3 tín hiệu proton anomer tại δH 4,40 (1H, d, J= 7Hz); 5,35 (1H, brs); 4,99 (1H, d, J= 5Hz), điều này chỉ ra rằng phân tử PQRB 2 còn gắn thêm 3 phân tử đường vào cấu trúc

Hình 3.6: Phổ 1 H-NMR : 3 protons anomer hợp chất PQRB 2

Vị trí gắn đường được xác định bởi tương quan HMBC của H-1(xyl) (δH 4,40) và C-3 (δC 90.14)

Tương tự như vậy, phần đường còn lại được xác định gắn với nhau thông qua các tương quan HMBC của H-1(rha I) (δH 5,35) / C-2(xyl) (δC 78,4) và H-1(rib) (δH

4,99) / C-3(rha I)(δC 80,7) Hơn nữa, dữ liệu phổ của PQRB 2 được xác nhận trùng khớp với dữ liệu đã công bố của huzhangoside A [24,25], do đó công thức cấu tạo của PQRB 2 được xác định là 3β-[(O-β-ᴅ-ribopyranosyl-(1→3)-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β - ᴅ -xylopyranosyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid], với tên thường gọi là Huzhangoside A

Hình 3.7 : Các tương tác trên Phổ HMBC hợp chất PQRB 2

Căn cứ toàn bộ các thông tin trên cùng với dữ liệu phổ HSQC , kết hợp với các tài liệu đã công bố ta thu được cấu trúc hợp chất PQRB 2

Hình 3.8 : Cấu trúc hóa học của hợp chất PQRB 2 (Huzhangoside A)

Hợp chất PQRB 3 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, khối lượng phân tử được xác định là 1336.7, dựa vào pic ion dương trên phổ ESI-MS tại m/z 1359,7 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C64H104O29 , độ bất bão hòa là 13 Nhiệt độ nóng chảy : 269 – 272 o C

Tương tự như PQRB 2, phổ 1 H-NMR của hợp chất PQRB 3 cũng thể hiện 7 tín hiệu methyl mũi đơn tại δH 1.06 (s, H-23), 0.88 (s, H-24), 0.97 (s, H-25), 1.29 (s, H-26), 1.18 (s, H-27), 0.94 (s, H-29), 0.97 (s, H-30) Kết hợp với hai tín hiệu carbon không no tại δC 123.8 (C-12) và 144.8 (C-13) và một tín hiệu carboxylic tại δC 178.1 (C-28) trên phổ 13 C-NMR Điều này gợi ý rằng hợp chất PQRB 3 cũng mang khung triterpenoid loại oleanan [31]

Hình 3.9 : Phổ tín hiệu 7 proton metyl (7 mũi đơn )

Hình 3.10 : Phổ DEPT : Tín hiệu CH3

Hình 3.11 : Phổ 13 C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic

Căn cứ vào dữ liệu phổ trên ta thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu cacbon của phần aglycon ( khung triterpenoid loại oleanan )

Kết hợp cùng các tài liệu tham khảo ta dựng được khung oleanan

Hình 3.12 : Cấu trúc khung oleanan

Tuy nhiên, khác với PQRB 2, phổ 1 H-NMR của PQRB 3 xuất hiện 6 tín hiệu proton anomer tại δH 4.41 (1H, d, J= 7Hz), 5.38 (1H, brs), 4.42 (1H, d, J=8Hz), δH

5.36 (1H, d, J= 8Hz), 5.00 (1H, d, J=4.5Hz), 4.86 (1H, brs), điều này chỉ ra rằng phân tử PQRB 3 gắn thêm 6 phân tử đường nữa

Hình 3.13 : Phổ 1 H-NMR : 6 protons anomer hợp chất PQRB 3

Vị trí gắn đường vào gốc aglycon được xác định bởi tương quan HMBC của H-1(xyl) (δH 4,40) với C-3 (δC 90.14) và H-1(glc I) (δH 5,36) với C-28 (δC 178,1)

Với phần đường gắn vào C-3 qua liên kết ether, các đường được xác định gắn với nhau thông qua các tương quan HMBC của H-1(rha I) (δH 5,378) /C-2(xyl) (δC

79,5) và H-1(rib) (δH 5,00) / C-3(rha I) (δC 80,8) Trong khi đó, các liên kết của phần đường gắn vào C-28 qua liên kết ester được xác định bởi các tương quan HMBC của H-1(glc II) (δH 4,42) /C-6(glc I) (δC 69,5) và H-1(rha II) (δH 4,40) / C-4(glc II) (δC

Hình 3.14 : Phổ HMBC hợp chất PQRB 3

Hơn nữa, dữ liệu phổ của PQRB 3 được xác nhận trùng khớp với dữ liệu đã công bố của huzhangoside C [25,16], do đó công thức cấu tạo của PQRB 3 được xác định là 3β-[(O- β -ᴅ-ribopyranosyl-(1→3)-O-α- L -rhamnopyranosyl-(1→2)- β - ᴅ - xylopyranosyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid-O- α -L-rhamnopyranosyl (1→4)-O- β - ᴅ -glucopyranosyl-(1→6)- β - ᴅ -glucopyranosyl ester, với tên thường gọi là Huzhangoside C

Căn cứ toàn bộ các thông tin trên cùng với dữ liệu phổ HSQC , kết hợp với các tài liệu đã công bố ta thu được cấu trúc hợp chất PQRB 3

Hình 3.15 : Cấu trúc hóa học của hợp chất PQRB 3 ( Huzhangoside C )

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của 2 hợp chất PQRB 2 và PQRB 3

Mẫu PQRB 2 đo trong 600 uL MeOD + 50 uL CDCl3 Mẫu PQRB 3 đo trong 600 àL MeOD

BÀN LUẬN

Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần rễ Phong quỳ Sa Pa

Rễ Phong quỳ sau khi đã làm nhỏ được chiết nóng với cồn 96% ở 70 o C (chiết

4 lần, mỗi lần 8 tiếng) Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian , đồng thời có thể đảm bảo chiết xuất triệt để hơn so với phương pháp chiết lạnh Khối lượng cao toàn phần sau quá trình này đạt 245g (~10% so với nguyên liệu khô ) Đối với quá trình chiết phân đoạn bằng phương pháp lỏng-lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexan, Ethyl Acetate, Buthanol Khối lượng cắn n- butanol là cao nhất (4.1%), điều này cho thấy các hợp chất phân cực (saponin) chiếm tỷ lệ lớn trong cây.

Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Quá trình phân lập sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau trong đó chủ yếu là sắc kí cột; đây là một phương pháp phổ biến và được ứng dụng nhiều tại Việt Nam do giá thành rẻ, nguyên vật liệu dễ kiếm và dễ tiến hành

Sau quá trình phân lập thu được 02 hợp chất từ phân đoạn Buthanol của mẫu nghiên cứu Dựa theo đặc điểm lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC) và qua đối chiếu với các tài liệu đã công bố, 2 hợp chất này được xác định lần lượt là

Huzhangoside A và Huzhangoside C; hai hợp chất này lần đầu tiên được tách ra từ rễ loài Anemone chapaensis Gagnep., góp phần bổ sung thêm kiến thức về loài này

Huzhangoside A: Hợp chất Huzhangoside A là một saponin loại oleanan đã từng được phân lập từ loài Anemone hupehensis LEM var japonica (THUNB.)

BOWLES et STEARN[17,29,34] và loài Anemone rivularis Buch.-Ham ex DC [8]

Năm 2009, Akihito YOKOSUKA và cộng sự đã thực hiện quá trình nuôi cấy tế bào và nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của huzhangoside A trên các dòng tế bào : HL-60, A549, HSC-2 và HSC-4 Kết quả này đã chứng minh tiềm năng gây độc tế bào của huzhangoside A có thể được khai thác trong điều trị ung thư[34]

Huzhangoside C : Hợp chất Huzhangoside C là một saponin loại oleanan đã từng được tách ra trên loài Anemone rivularis Buch.-Ham ex DC[8] Nhưng cho đến nay chưa có bất cứ nghiên cứu nào về tác dụng sinh học của hợp chất này, điều này mở ra hướng nghiên cứu dược lý mới từ hợp chất này, đặc biệt khi hàm lượng của nó