LUẬN văn THẠC sĩ nghiên cứu thành phần hóa học cây lan kim tuyến ( anoectochilus setaceus blume) thu hái tại thanh hóa

TỔNG QUAN

Vài nét về chi Anoectochilus

Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan

(Orchidaceae) và phân họ cùng tên (Orchidoideae) Cái tên "Lan kim tuyến" hay "Lan kim hoàn” bắt nguồn từ những đường gân rất đẹp trên phiến lá của các loài lan này

Phần lớn chúng là các thực vật sinh sống trên nền đất có kích thước nhỏ, tuy nhiên một vài loài sinh sống trên các bờ đá, với bộ lá màu xanh lục hoặc mang các màu sắc khác (tùy theo loài), có bề mặt mịn như nhung và mang một mạng lưới gân lá phức tạp Cụm hoa ở ngọn trung tâm mang một vài hoa mọc chúc xuống đất và bao phủ bởi lông với một cánh môi rất lớn và nổi bật Tràng hoa cùng với đài hoa ở mặt lưng tạo thành một cấu trúc giống như chiếc mũ trùm đầu Mỗi hoa có hai nhụy và hai nhị [25]

Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm hơn 40 loài, phổ biến khắp các vùng nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii

Trong số các loài thực vật này, A formosanus và A koshunensis chỉ phân bố ở Đài Loan (Trung Quốc) và Okinawa (Nhật Bản)

Anoectochilus roxburghii, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri

Lanka, Ấn Độ và Nepal [17]

1.3 Công dụng và tác dụng

Một số loài thuộc chi này được sử dụng trong các loại thuốc dân gian Trung Quốc, chẳng hạn như A formosanus Hayata, A koshunensis Hayata, và A roxburghii

Theo y học cổ truyền Đài Loan, A formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực Người Trung Quốc cho rằng uống trà làm từ A formosanus Hayata chữa các chứng bệnh gan và phổi [23,30] Đại học ông nghệ Y dược và ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử dụng A formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thể và kháng virus c m A Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Dịch chiết A formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm và bảo vệ gan

Chiết xuất của cây A formosanus khô có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol, β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid [28] Gần đây, một hợp chất 3(R)- 3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên là thương mại kinsenoside được chiết xuất từ A formosanus và A koshunensis chống tăng huyết áp hiệu quả [29]

Anoectochilus roxburghii, còn được gọi là "Vua thảo dược" để điều trị sốt, bệnh về phổi, viêm màng phổi, bệnh về gan, tăng huyết áp và trẻ em suy dinh dưỡng ở Trung Quốc (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982)

Tuy nhiên, thông tin khoa học về hoạt tính sinh học, chức năng sinh lý và hiệu quả lâm sàng cụ thể của cây lan thảo dược này còn hạn chế Không có báo cáo nghiên cứu về các thành phần hóa học của A roxburghii và có rất ít hồ sơ dược lý (Li et al

1995) bởi vì các nguồn tự nhiên của A roxburghii phần lớn đã cạn kiệt.

Tổng quan về cây Lan kim tuyến

 Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume

 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl 1840

 Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch tùng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Lan kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xòe sát đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu, đỏ với mạng gân màu vàng, lục hay hồng) Cuống lá dài 2 - 3 cm Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, chóp nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng

Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm, môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [2]

Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) [19]

2.3 Sinh học và sinh thái

Mùa hoa của cây là tháng 2 đến tháng 4 Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh trưởng rất chậm Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm

Chúng sinh sống trên sườn n i đá granit, riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm, vài ba cây trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [2]

2.4 Phân bố và tình trạng

 Thế giới: Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, ampuchia, Malaixia, Inđônêxia

 Lào Cai: núi Phan Xi Păng, xã Liêm Phú

 Kon Tum: núi Ngọc Linh, Vườn Quốc gia hư Mom Ray

 Đắk Lắk: Vườn Quốc gia hư Yang Sin

 Lâm Đồng: Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà

 Phú Thọ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn

 Sơn La: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Tà Sùa

 Hà Nội: Vườn Quốc gia Ba Vì

 Thanh Hóa: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Liên, Pù Luông

 Tình trạng Loài có khu phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm và đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày càng hiếm Chúng đã bị khai thác liên tục trong nhiều năm, hiện đã trở nên giảm sút rõ rệt và có nguy cơ bị tuyệt chủng Do đó, Lan kim tuyến đã được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3]

Từ các phân đoạn ethyl acetate và phân đoạn n-butanol của dịch chiết ethanol của toàn bộ cây Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl (Orchidaceae) đã phân lập được nhiều hợp chất Trên cơ sở phương pháp quang phổ, cấu trúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ là cirsilineol (1), quercetin (2), quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside

(3), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (4), isorhamnetin (5), isorhamnetin-7-O-β-D- glucopyranoside (6), isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside (7), kaempferol-3-O-β–

D-glucopyranoside (8), kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside (9), isorhamnetin-3-O- β-D-rutinoside (10) [10,12,16,17]

Ferulic acid (11) [16], p-coumaric acid (12) [10], sorghumol (13), friedelin (14)

[18], sitosterol (15), stigmasterol (16), campesterol (17), daucosterol (18), succinic acid

Năm 2008, He và cộng sự đã phân lập được hai loại sorghumol acyl este mới đó là Sorghumol 3-O-Z-p-coumarate và sorghumol 3-O-E-p-coumarate, một alkaloid mới là anoectochine (20) và một chất đã được biết đến từ trước sorghumol [15] Cụ thể các hoạt chất được xác định có công thức cấu tạo hóa học như sau

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến

Các nghiên cứu gần đây cho thấy: Lan kim tuyến có thể chữa các bệnh như: trị lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, gi p tăng cường sức khỏe và làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, đau bụng, đau ngực, tiểu đường, viêm thận, sốt cao, liệt dương, rối loạn gan [8,17,22]

Những người dân tộc miền n i thường dùng Lan kim tuyến sắc uống, giúp chữa trị đau bụng, đau ruột, sốt cao hoặc đắp bên ngoài chỗ vết thương bị rắn cắn, các chỗ sưng

Lan kim tuyến là cây dược liệu dân gian quý, toàn thân cây thuốc có công dụng tăng cường sức khỏe, bổ máu, giải nhiệt, chủ trị bệnh phổi, di tinh, yếu gan, yếu tỳ, xuất tinh sớm

Cây Lan kim tuyến dùng cả cây tươi hoặc khô sắc uống Liều dùng trong ngày khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô Dùng ngoài: cả cây tươi giã nát đắp chỗ vết thương sưng đau [4,5]

2.7 Tác dụng sinh học của một số hợp chất trong cây Lan kim tuyến

Y học hiện đại đã phân tích và xác định được Anoectochilus chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kì quan trọng bao gồm: flavonoid (quercetin, isorhamnetin), steroid (24 ~ isopropenyl cholesterol, sterol, ergosrol, stigmasterol, campesterol, sitosterol β-), trierpenoids (friedelin, acid succinic, acid coumaric, acid ferulic, daocosterol, acid palmitic, acid aleanolic, acid bearberry), đường (Polysaccharides 13,32%, Oligosacharides 11,24% và đường đơn 9,73%), alkaloid, glycoside tim mạch, este, taurine, acid amin, nguyên tố vi lượng và các loại khoáng chất khác [8,17,20,24]

Quercetin là một flavonoid có tác dụng làm tăng tuổi thọ và cải thiện sức khỏe tim mạch, làm giảm cholesterol xấu và làm tăng cholesterol tốt Nó cũng làm giảm mảng bám trong động mạch và loại bỏ các cholesterol xấu Quercetin gi p tránh bị đột quỵ và đau tim [22]

Quercetin cũng là hợp chất rất tốt đối với bệnh nhân tiểu đường, bệnh cao huyết áp Không một lavonoid nào có thể tốt hơn so với quercetin trong khả năng chống

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU viêm và chống oxy hóa, chống lão hóa, làm bền thành mạch tránh tai biến mạch máu [8,13]

Quercetin cũng có thể được sử dụng để ngăn ngừa các bệnh ung thư ũng giống như tất cả các chất flavonoid khác, nó sẽ loại bỏ tất cả các gốc tự do trong cơ thể, trung hòa chúng giúp tránh được bệnh ung thư Vì vậy, việc xác định (định tính và định lượng) được Quercetin trong cao Lan kim tuyến là rất quan trọng vì nó góp phần khẳng định vai trò chữa bệnh của cao Lan kim tuyến [32]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Quercetin, C 15 H 10 O 7

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất

Toàn bộ cây Lan kim tuyến được thu hái từ vùng núi thuộc huyện Nông Cống tỉnh Thanh Hóa Mẫu được cho vào trong túi bảo quản có chứa hạt hút ẩm silicagel, tại phòng thí nghiệm được bảo quản ở -20 o trước khi mang tách chiết

Dược liệu được phơi, sấy khô, cắt và tán nhỏ tới độ mịn khoảng 3-4 mm để tăng khả năng khuếch tán của dung môi

Nấm men là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae

Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae: (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2 2H 2 O, NaCl, cao nấm men, glucoza, nước, đệm PBS

Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, ACN.

Phương tiện nghiên cứu

Thiết bị, máy móc, dụng cụ : que cấy, đèn cồn, đĩa petri, màng lọc, giấy lọc, giấy bao gói, bông không thấm nước, bông y tế

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, pipet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh các kích thước

Thiết bị đo phổ hấp thụ NanoDrop-1000 (USA)

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu

Phương pháp nghiên cứu

Công nghệ lên men là công nghệ mới được sử dụng trong nghiên cứu này để thu nhận cao có các hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến Trong công nghệ lên men ứng dụng trong đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng chủng nấm

Saccharomyces cerevisiae để thu nhận cao thay cho công nghệ tách chiết truyền thống

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU bằng nước hoặc bằng cồn nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đa dạng các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất

Nấm men là các loài nấm đơn bào Kích thước đường kính mỗi tế bào men chỉ vào khoảng 1/100 mm Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu bia Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein Ngoài ra nấm men còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì Tuy nhiên, cũng có nhiều loại nấm men có hại gây bệnh cho người và gia s c, làm hư hại lương thực, thực phẩm

Nấm men dùng trong sản xuất bia thường là các chủng thuộc giống Saccharomyces Chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin, peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào

Nấm men được sử dụng là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae Đặc điềm hình thái: Sacchromyces cerevisiae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao, lơ lửng trên bề mặt là chủ yếu, nhiệt độ lên men từ 10 – 25 o C

Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae

Môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cụ thể như sau:

 Nước: 1000 g Sau thời gian nuôi cấy ở 25-30 o C trong ba tuần thì ly tâm 300 vòng/ph t để thu

Sinh khối tế bào thu được rửa 2 lần với đệm PBS, pH=7,5 trước khi sử dụng

Quy trình chiết xuất cao

Chiết với methanol, định tính và định lượng bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV và phân tích HPLC

Ly tâm 10 000 vòng/phút, thời gian 10 phút

Loại bỏ cặn ly tâm Thu dịch ly tâm và cô thành cao

Lọc lấy dịch lên men và đun đến lên 70 o C Đậy kín nắp bình lên men, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5-7 ngày

Thỉnh thoảng lắc nhẹ và xả bớt khí

Bổ sung nấm men, đường vào hỗn hợp

Nguyên liệu Lan kim tuyến tươi

Cắt, nghiền nhỏ nguyên liệu

Bổ sung nước cất vào nguyên liệu theo tỉ lệ: 5 phần nước: 1 phần nguyên liệu

Sử dụng phổ hấp thụ UV (sử dụng thiết bị đo phổ hấp thụ là NanoDrop-1000 (USA)) để định tính các hoạt chất Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin trong mẫu cao Lan kim tuyến

Quercetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 268 nm và 412 nm

Isorhamnetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 265 nm và 375 nm

Acid erulic có đỉnh hấp thụ cực đại ở 320 nm

Kết quả định tính các hợp chất trong Lan kim tuyến theo phương pháp phổ hấp thụ UV đã được công bố được trình bày tại các hình sau: [7,11,21,26,27]

Quercetin (Hình 2.1), Isorhamnetin (hình 2.2) và Acid ferulic (hình 2.3)

Hình 2.1 Phổ hấp thụ của Quercetin

Hình 2.2 Phổ hấp thụ của Isorhamnetin

Hình 2.3 Phổ hấp thụ của Acid Ferulic

2.3.3 Phương pháp định lượng Định lượng các hợp chất Quercetin, Isorhamnetin và Axit ferulic trong cao Lan kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với thiết bị HPLC Shimadzu ác pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol) Một số kỹ thuật HPLC sử dụng dung môi không nước Thành phần nước trong pha động có thể có axit (axit formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các thành phần mẫu Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong quá trình phân tích sắc ký Rửa giải đẳng dòng đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái lực của chúng với pha động Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho píc trên sắc ký đồ Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc trưng và được xem là đặc điểm nhận biệt của chất đem phân tích Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

KẾT QUẢ

Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic

Phổ hấp thụ UV của mẫu cao Lan kim tuyến mà đề tài đã thực hiện được trình bày tại hình 3.1

Trong đó: Trục tung: absorbance: độ hấp thụ

Trục hoành: wavelength: bước sóng

Kết quả trên hình 3.1, cho thấy trong cao lên men Lan kim tuyến có các đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho Quercetin, Isorhamnetin và Axit Ferulic

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến

Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic

 Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5àm Seri cột: H16-248657

 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm

 Tốc độ dòng: 1,5mL/phút

 Pha động: ACN : 0.5% phosphoric acid = 72:28 (%)

3.2.1.2 Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Quercetin 6 àg/mL + Isorhamnetin 1 àg/mL theo điều kiện trờn

Kết quả được trình bày trong bảng 3.1:

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn

Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin

TB 989937 156299 10.409 20.124 0.711 0.697 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu < 1 Độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng < 2

=> chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao

Cách pha đường chuẩn Quercetin:

Pha dóy dung dịch chuẩn Quercetin cú nồng độ 1,5 – 15 àg/mL

Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Hoà tan chính xác 25 mg chất chuẩn Quercetin vào bình định mức 50mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Quercetin khoảng 500 àg/mL => thu được dd (1)

Hỳt 1,2mL dd (1) hũa tan trong 20 mL MeOH (~ 30 àg/mL)(WS Quercetin)

Cách pha đường chuẩn Isorhamnetin:

Pha dóy dung dịch chuẩn Isorhamnetin cú nồng độ 0,2 – 2 àg/mL

Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Hoà tan chính xác 5 mg chất chuẩn Isorhamnetin vào bình định mức 10mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Isorhamnetin khoảng 1000 àg/mL => thu được dd (2)

Hỳt 1mL dd (2) hũa tan trong bỡnh 25mL MeOH (40 àg/mL) => thu được dd (3) Hỳt 1mL dd (3) hũa tan trong bỡnh 10mL MeOH (4 àg/mL) (WS Isorhamnetin)

Bảng 3.2 Số liệu pha đường chuẩn

Nồng độ Quercetin (àg/mL) 1.5 3 6 12 15

Thể tớch WS Quercetin (àL) 50 100 200 400 500

Nồng độ Isorhamnetin (àg/mL) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 Thể tớch WS Isorhamnetin (àL) 50 125 250 375 500

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

Hình 3.2 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

3.2.1.4 Kết quả định lượng Quercetin, Isorhamnetin

Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 àm, tiờm sắc ký

Tiến hành trên 3 mẫu độc lập

Công thức tính kết quả

Nồng độ Quercetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Quercetin của dung dịch tiêm sắc ký

% Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Quercetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử

Bảng 3.5 Kết quả định lượng Quercetin

Area Nồng độ mẫu tiêm SK

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Quercetin

Nồng độ Isorhamnetin trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Isorhamnetin của dung dịch tiêm sắc ký

% Isorhamnetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Isorhamnetin (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử % Isorhamnetin = C x 100

Bảng 3.6 Kết quả định lượng Isorhamnetin

Area Nồng độ mẫu tiêm

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Isorhamnetin

3.2.2 Định lượng Acid ferulic trong dịch chiết bằng HPLC 3.2.2.1 Điều kiện sắc ký

 Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5àm Seri cột: H16-248657

 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm

 Tốc độ dòng: 1,5mL/phút

 Pha động: A N : Đệm CH 3 COONa 0,05M pH 4,0 = 12:88 (%)

3.2.2.2 Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Acid ferulic 3 àg/mL theo điều kiện trờn

Kết quả được trình bày trong bảng 4.7

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

STT RT Area Tailing factor

CV% 1.0 1.0 3.3 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu < 1 Độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng < 2

=> chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao

Pha dóy dung dịch chuẩn Acid ferulic cú nồng độ 1,0 – 5,0 àg/mL Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Cách pha đường chuẩn Acid ferulic

Hoà tan chính xác 20 mg chất chuẩn Acid erulic vào bình định mức 20mL, hòa tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Acid ferulic khoảng 1000 àg/mL => thu được dd (1)

Hỳt 1,0mL dd (1)/ hũa tan trong 10mL MeOH (~ 100 àg/mL) (WS1)

Hỳt 1,0mL dd (WS1) vào bỡnh 10mL, bổ sung MeOH vừa đủ (~ 10 àg/mL) (WS2)

Pha dóy dung dịch chuẩn Acid ferulic cú nồng độ 1,0 – 5,0 àg/mL Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ Dựng phương trình hồi quy tuyến tính

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ các dung dịch

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của

3.2.2.4 Kết quả định lượng Acid ferulic

Lọc mẫu thử qua màng lọc 0.45 àm, tiờm sắc ký

Tiến hành trên 3 mẫu độc lập

Công thức tính kết quả Nồng độ Acid ferulic trong dung dịch mẫu tiêm sắc ký (mẫu thử ban đầu)

St: Diện tích píc của Acid ferulic của dung dịch tiêm sắc ký

% Quercetin trong dịch mẫu thử = Khối lượng Acid ferulic (g) có trong 100 mL dung dịch mẫu thử

Bảng 3.10: Kết quả xác định nồng độ Acid ferulic trong mẫu thử

Area Nồng độ mẫu tiêm

Nồng độ ban đầu (g/mL) % Acid ferulic

BÀN LUẬN Chiết xuất cao Lan kim tuyến

Công nghệ mới được sử dụng trong nghiên cứu này để thu nhận cao có các hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến là công nghệ lên men

Trong công nghệ lên men ứng dụng trong đề tài nghiên cứu này đã sử dụng các chủng nấm để thu nhận các chất thay cho công nghệ tách chiết truyền thống bằng nước hoặc bằng cồn nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đa dạng các chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất

Theo công nghệ truyền thống việc chiết xuất các hoạt chất từ thảo dược được thực hiện bằng công nghệ chiết sử dụng nước hoặc sử dụng cồn Khi sử dụng nước: dịch chiết thu được chứa chủ yếu các chất ưa nước (các chất hòa tan trong nước), còn khi sử dụng cồn lại chủ yếu thu được các chất ít hoặc không hòa tan trong nước

Vì vậy, việc sử dụng công nghệ lên men được xem là công nghệ có thể khắc phục được những hạn chế nêu trên

Công nghệ lên men hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước ứng dụng để tạo ra những sản phẩm có giá trị kinh tế và chữa bệnh đồng thời tiết kiệm được nguồn nguyên liệu do khả năng chiết xuất gần như tối đa các hợp chất quý trong nguyên liệu ban đầu Để đạt hiệu quả trong tách chiết và tạo cao chứa các hợp chất có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến, cần khảo sát để lựa chọn các điều kiện lên men tối ưu (như nhiệt độ, nồng độ chủng giống, cách xử lý nguyên liệu ban đầu trước khi lên men, thời gian lên men, thu nhận sản phẩm sau khi lên men,…) để thu nhận cao từ Lan kim tuyến đạt yêu cầu về chất lượng

Quy trình thu nhận cao ổn định có thể áp dụng vào sản xuất

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Định tính và định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch lên men cây Lan kim tuyến

 Có thể sử dụng phổ hấp thụ UV-Vis để sơ bộ xác định các hợp chất quan trọng trong mẫu cao Lan kim tuyến

 Phổ hấp thụ của mẫu cao Lan kim tuyến cho thấy các đỉnh hấp thụ rõ ràng, tập trung ở các bước sóng

Tiêu đề	Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Thu Hái Tại Thanh Hóa
Tác giả	Nguyễn Nam Phương
Người hướng dẫn	PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Hà Thị Thanh Hương
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,93 MB