(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học san hô mềm sinularia dissecta

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ ANH TÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HÔ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN HOÀI NAM Hà Nội – 2015 download by : skknchat@gmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HƠ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Học viên: Vũ Anh Tú Cao học: Khóa 17 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoài Nam Hà Nội – 2015 download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cảm ơn Luận văn hoàn thành Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn GS VS Châu Văn Minh, TS Nguyễn Văn Thanh, TS Nguyễn Xuân Cường tập thể cán phịng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển tạo điều kiện, giúp đỡ q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo anh chị Phịng Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học thử nghiệm dược lý Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Luận văn hỗ trợ kinh phí thực khn khổ nội dung Nhiệm vụ nhánh Hợp tác quốc tế với L.B.Nga cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nhiệm vụ Trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, VAST.TĐ.ĐAB.02/13-15 TS Nguyễn Hoài Nam làm chủ nhiệm Tác giả luận văn Vũ Anh Tú i download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Lời cam đoan Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi thực hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Nam Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Vũ Anh Tú ii download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Danh mục chữ viết tắt CC Sắc ký cột (Collumn chromatography) YMC Sắc ký cột pha ngược TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatomatography) MPLC Sắc ký lỏng trung áp NMR Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) C HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single-Quantum Coherence) Mp Điểm nóng chảy (Melting point) MTT [3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] LU-1 Dòng tế bào ung thư phổi người (Lung carcinoma cell line) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú người (Human breast cancer cell line) KB Dòng tế bào ung thư biểu mơ HepG2 Dịng tế bào ung thư gan người TBUT Tế bào ung thư iii download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hơ mềm I.2 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học số lồi san hơ mềm điển hình thuộc giống Sinularia giới I.3 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống Sinularia nước 12 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 II.1 Đối tượng nghiên cứu 13 II.2 Phương pháp nghiên cứu 14 II.2.1 Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển 14 II.2.2 Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu tạo dịch chiết 14 II.2.3 Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc hợp chất 16 II.2.4 Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư 17 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19 III.1 Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu 19 III.2 Phân lập hợp chất, số vật lý, liệu phổ hợp chất 20 III.3 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 25 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 28 IV.1 Kết xác định cấu trúc hợp chất 28 IV.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 52 KẾT LUẬN 53 Tài liệu tham khảo 55 Danh mục cơng trình cơng bố 58 PHỤ LỤC iv download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú MỞ ĐẦU Cùng với tiến hóa nhanh văn minh nhân loại phát triển vượt bậc khoa học kỹ thuật bệnh nguy hiểm gia tăng nhiều, đặc biệt thấy gia tăng ngày lớn bệnh ung thư quái ác, thuộc tứ chứng nan y y học Nó gây nỗi ám ảnh đáng sợ cho loài người Và biệt dược phục vụ công tác chữa bệnh, thực phẩm chức hỗ trợ phục hồi sức khỏe giúp người bệnh chống lại bệnh tật tốt nhà khoa học trọng nghiên cứu Các sinh vật biển có nhiều người biết đến Hải sâm, Sao biển, Cá ngựa, cầu gai, san hô, bọt biển… hay gần gũi thực phẩm giàu dinh dưỡng bữa ăn lồi ốc, sị, cá, cua, sứa biển … nghiên cứu nhiều theo hướng thực phẩm thực phẩm chức Nghiên cứu nguồn hợp chất thiên nhiên biển năm 50 kỷ trước ngày nhận quan tâm nhà khoa học giới Những nghiên cứu nguồn dược liệu biển thời gian gần tăng chất lượng số lượng đạt thành đáng ý Đã có nhiều hợp chất có nguồn gốc biển trở thành loại thuốc quan trọng lĩnh vực sống loài người Các sinh vật biển trở thành tâm điểm cho nhiều cơng trình nghiên cứu có ý nghĩa to lớn cho sức khỏe đời sống Các nguồn dược liệu từ sinh vật biển bổ sung, hỗ trợ cịn điều trị bệnh nguy hiểm ngày gia tăng xã hội phát triển Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi san hơ góp phần chuyển sinh vật khơng có giá trị mặt hải sản trở thành sinh vật biển có giá trị nghiên cứu y dược Chính vậy, có nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm hợp chất từ san hô mềm nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất phát download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu san hơ mềm San hơ lồi sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa, lớp Anthozoa chia thành hai phân lớp tùy theo số xúc tu, đường đối xứng loạt phận tương ứng với kiểu xương bao gồm phân lớp san hơ có tám xúc tu gọi san hơ tám ngăn Octocorallia, phân lớp san hơ có số xúc tu lớn tám bội số sáu gọi san hô sáu ngăn Hexacorallia Các san hơ mềm, san hơ sừng bút chì biển thuộc phân lớp san hô Octocorallia, san hô cứng nằm phân lớp Hexacorallia Theo thống kê giới, phân lớp Octocorallia có khoảng 2000 lồi chia làm 310 giống 45 họ San hô sinh vật đơn giản, chúng tồn khắp vùng biển, nông sâu cá thể hình trụ nhỏ có hàng xúc tu đỉnh, sử dụng để bắt mồi môi trường nước Mặc dù trông giống cây, san hô thực động vật cấu tạo tương tự sứa hải q, chúng thuộc vào nhóm động vật biển có trâm gây ngứa (thích ty bào) Có đến hàng trăm kiểu san hơ khác tất cá thể nhỏ bé, gọi polyp tạo nên Các cá thể tiết canxi cacbonat để tạo xương cứng, xây nên rạn san hô vùng biển nhiệt đới Trên giới, rạn san hơ ngầm ước tính bao phủ 284.300 km2, chủ yếu vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%) Các rạn san hơ mềm phân bố rộng rãi đại dương giới có vai trị quan trọng hệ sinh thái rạn san hô, chúng tạo nguồn vật chất hữu cơ, habitat, tham gia tạo rạn Cuộc sống cộng sinh san hơ mềm với lồi tảo biển tạo nên đặc điểm sinh học vô thú vị san hô mềm Rất nhiều hợp chất thứ cấp ditecpen dạng cembranoid, steroids … từ san hơ mềm sinh từ mối tương tác với môi trường sinh thái [1] Tuy đầu san hô trông thể sống, thực đầu nhiều cá thể giống hồn tồn di truyền, polip Các polip sinh vật đa bào với nguồn thức ăn nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù du tới loài cá nhỏ download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú Polip thường có đường kính vài milimet, cấu tạo lớp biểu mơ bên ngồi lớp mô bên giống sứa gọi ngoại chất Polip có hình dạng đối xứng trục với xúc tu mọc quanh miệng - cửa tới xoang vị (hay dày), thức ăn bã thải qua miệng Dạ dày đóng kín đáy polip, nơi biểu mơ tạo xương ngồi gọi đĩa Bộ xương hình thành vành hình khuyên chứa canxi ngày dày thêm Các cấu trúc phát triển theo chiều thẳng đứng thành dạng ống từ đáy polip, cho phép co vào xương ngồi cần trú ẩn Polip mọc cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc, chia thành vách ngăn để tạo đĩa cao Qua nhiều hệ, kiểu phát triển tạo nên cấu trúc san hô lớn chứa canxi, lâu dài tạo thành rạn san hơ Sự hình thành xương chứa canxi kết việc polip kết lắng aragonit khoáng từ ion canxi thu từ nước biển Tuy khác tùy theo loài điều kiện mơi trường, tốc độ kết lắng đạt mức 10 g/m² polip/ngày Điều phụ thuộc mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp 90% so với trưa Các xúc tu polip bẫy mồi cách sử dụng tế bào châm gọi nematocyst Đây tế bào chuyên bắt làm tê liệt mồi sinh vật phù du, có tiếp xúc, phản ứng nhanh cách tiêm chất độc vào mồi Các chất độc thường yếu, san hô lửa, đủ mạnh để gây tổn thương cho người Các lồi sứa hải quỳ có nematocyst Chất độc mà nematocyst tiêm vào mồi có tác dụng làm tê liệt giết chết mồi, sau xúc tu kéo mồi vào dày polip dải biểu mô co giãn gọi hầu Các polip kết nối với qua hệ thống phức tạp gồm kênh hô hấp tiêu hóa cho phép chúng chia sẻ đáng kể chất dinh dưỡng sinh vật cộng sinh Đối với lồi san hơ mềm, kênh có đường kính khoảng 50-500μm download by : skknchat@gmail.com Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú cho phép vận chuyển chất trình trao đổi chất thành phần tế bào Ngoài việc dùng sinh vật phù du làm thức ăn, nhiều lồi san hơ, nhóm Thích ti (Cnidaria) khác hải quỳ (ví dụ giống Aiptasia), hình thành quan hệ cộng sinh với nhóm tảo vàng đơn bào thuộc chi Symbiodinium Thông thường, polip sống loại tảo cụ thể Thông qua quang hợp, tảo cung cấp lượng cho san hô giúp san hô trình canxi hóa Tảo hưởng lợi từ mơi trường an tồn, sử dụng điơxít cacbon chất chứa nitơ mà polip thải Hình I.1a Cận cảnh polip tế bào châm ( Nguồn internet) Sinh sản Hữu tính San hơ chủ yếu sinh sản hữu tính, với 25% san hơ phụ thuộc tảo (san hơ đá) tạo thành quần thể đơn tính phần cịn lại lưỡng tính Khoảng 75% san hơ phụ thuộc tảo "phát tán giống" cách phóng giao tử (trứng tinh trùng) vào nước để phát tán quần thể san hô xa Các giao tử kết hợp với thụ tinh để hình thành ấu trùng nhỏ gọi planula, thường có màu hồng hình ơvan; quần thể san hơ cỡ trung bình năm tạo vài nghìn ấu trùng để vượt qua xác suất nhỏ việc ấu trùng tạo quần thể download by : skknchat@gmail.com ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HƠ MỀM SINULARIA DISSECTA. .. dissesterol thể hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 4.0 ± 0.1 μM [22] Trên sở đó, luận văn với tiêu đề ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học san hô mềm Sinularia dissecta Việt... Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú I.3 Tình hình nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học giống Sinularia nước San hô mềm thuộc giống Sinularia chưa có nhiều nghiên cứu