CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí
1.2.2. Phương pháp sắc ký cột
a. Nguyên tắc.
Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động.
Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính trong rất hẹp còn dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.
Tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp đối với dung môi rửa cột mà mỗi chất được lấy ra trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là Al2O3, silica gel. Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Dung môi sử dụng rửa cột thường có độ phân cực tăng dần. Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên hở để tiếp thêm dung môi, có nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ khác nhau. Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt[6].
b. Cách tiến hành.
Chuẩn bị cột[6]:
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột.
- Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex.
Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3.
Đưa chất phân tích vào cột[6]:
- Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng.
- Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:
Cho thẳng hỗn hợp dung dịch lên cột.
Trộn hỗn hợp chất với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, quay khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột.
c. Rửa cột (giải li chất).
Có hai cách rửa cột là rửa áp suất thường và áp suất nén[6]:
-Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy xuống nhờ trọng lực.
-Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt silicagel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột. Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly và của chất cần giải li.
Thông thường người ta sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để giải li các chất. Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển
từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột. Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silicagel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt làm cho dung môi bốc hơi cục bộ sẽ tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt.
Theo dõi quá trình rửa cột
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất. Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc quyết định thể.
Tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành.
Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, những chất hay nhóm chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.
Trang bị cho sắc ký cột rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học của dược liệu. Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu.