CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc
1.3.1. Phổ khối lượng MS
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, một số phương phấp chủ yếu được nêu ra dưới đây[11]:
Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70Ev.
Phổ ESI (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử.Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
Phổ khối lượng phân giải cao (Hight Resolution Mass spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao, kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của các hợp chất hữu cơ
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ, phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng cấc hợp chất. Có thể dùng GC-MS (sắc kí khí- khối phổ) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng- khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt
hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). [11]
1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng với phổ khối và nhiễu xạ đơn tinh thể tia X hiện là những công cụ mạnh và thường được sử dụng nhất hiện nay trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm, còn của cacbon-13 là từ 0 - 240 ppm.[11]
Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này:
- Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét.
- Cách thứ 2 là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT– NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay.
Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton.
Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau được áp dụng. Mỗi kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân. Tuỳ vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, người ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ 2 chiều (COSY, HETCOR, Long-range HETCOR, NOESY...).
1.3.3. Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng từng phần. Mỗi proton cộng hưởng ở một trường khác nhau.Vì vậy chúng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học khác nhau.Ví dụ, các proton của liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6 - 8 ppm, các proton trong alkan thường chuyển dịch trong vùng 0 - 2 ppm. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hoá học (như 3 proton của nhóm CH3) thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba... tới 7 đỉnh thành phần (đỉnh 7). Diện tích của mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó. Một thông số quan trọng khác của phổ proton là hằng số ghép (J) tính bằng Hz, cho biết tương tác của proton với các proton kế cận. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc của hợp chất.[11]
1.3.4. Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hoá học
của cacbon. Cacbon lai hoá sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0 - 60 ppm. Cacbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45 - 85 ppm. Cacbon lai hoá sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 - 150 ppm; nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể chuyển dịch tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của cacbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một cacbon (hơn 1 cacbon nếu chúng có chung môi trường hoá học) của phân tử.[11]
1.3.5. Phổ DEPT
Kỹ thuật này giúp xác định số lượng proton trên cacbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi cacbon. Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Nói cách khác, nó cho biết cacbon đó là C, CH, CH2 hay CH3, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Trong phổ DEPT- 153, cacbon bậc IV không xuất hiện, cacbon bậc II là các đỉnh âm, C bậc III và bậc I là các đỉnh dương, ở phổ DEPT-90, chỉ còn các C bậc III là các đỉnh dương trong phổ. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135. Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu của nhóm CH.[11]
1.3.6. Phổ 2D-NMR
Đây là các kĩ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau[11]:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ các tương tác trên phổ này.
- Phổ 1H-1H COSY(1H-1H Chemical Sift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của các phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung bằng đúng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngày nay còn sử dụng nhiều kĩ thuật phổ hai chiều hiện đại khác như: kĩ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định, ví dụ trên phổ proton, xóa tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton bên cạnh.
Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới còn có loại phổ X- RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt, đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó khăn xã định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có đơn vị đường, thì việc xác định chính xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi sử dụng bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.