Tác động kháng tế bào ung thư máu K562 của cao chiết thô và phân đoạn từ cây ngải cứu

Bài viết Tác động kháng tế bào ung thư máu K562 của cao chiết thô và phân đoạn từ cây ngải cứu tập trung vào việc đánh giá tác động gây độc tế bào K562 của cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn của ngải cứu.

http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2022.05.338 TÁC ĐỘNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ MÁU K562 CỦA CAO CHIẾT THÔ VÀ PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY NGẢI CỨU Hồng Thành Chí(1), Bùi Thị Kim Lý(1) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một Ngày nhận 21/7/2022; Ngày phản biện 24/7/2022; Chấp nhận đăng 25/8/2022 Liên hệ Email: lybtk@tdmu.edu.vn https://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2022.05.338 Tóm tắt Bệnh bạch cầu mạn dịng tủy (BCMDT) bệnh lý ác tính máu tủy xương xảy trẻ em người lớn Hiện nay, có bốn hệ thuốc điều trị sản xuất chứng minh có hiệu điều trị nhiên vấn đề kháng thuốc chưa giải triệt để, cần phải tìm kiếm thuốc phương thức điều trị Ngải cứu gọi thuốc cứu, thuốc cao, ngải điệp, có tên khoa học Artemisia vulgaris L thuộc họ Cúc Ngải cứu vị thuốc thông dụng, mọc hoang nhiều nơi Việt Nam, ngồi cịn có nhiều nước châu Á, châu Âu khác Ngải cứu thường dùng điều trị vấn đề tiêu hóa, chữa nôn mửa, thuốc giun, sốt rét… Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tác động gây độc tế bào K562 cao chiết tổng cao chiết phân đoạn ngải cứu Kết nghiên cứu chứng minh cao chiết tổng ngải cứu có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư máu K562 Cụ thể tác động cao chiết lên tăng sinh tế bào ung thư máu K562 phụ thuộc vào thời gian nồng độ cao chiết Ngoài ra, cao chiết phân đoạn chloroform ngải cứu cho thấy có chứa nhiều hợp chất tiềm điều trị ung thư máu cần tiến hành nghiên cứu thêm Từ khóa: Artemisia vulgaris, khả kháng tế bào, K562, ngải cứu Abstract ANTI-LEUKEMIA EFFECT OF AR CRUDE AND FRACTIONS EXTRACTS Chronic myeloid leukemia is a malignancy of the blood and bone marrow that occurs in children and adults At least four generations of therapeutic drugs have been produced and proven to be effective, but the problem of drug resistance has not been completely solved, so it is necessary to search for new drugs or new treatment modalities Artemisia vulgaris, belonging to the daisy family, is a common medicine, growing wild in many places in Vietnam, in addition to many other Asian and European countries A vulgaris is commonly used in the treatment of digestive problems, vomiting, anthelmintics, malaria, etc This study focused on evaluating the cytotoxic effects of K562 of the total and fractional extracts of A vulgaris The results of the study demonstrated 66 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 5(60)-2022 that the total extract of A vulgaris has the ability to inhibit the growth of the leukemia cell line K562 Specifically, the effect of the extract on the proliferation of K562 cells was dependent on the time and concentration of the extract Also, the chloroform fraction of A vulgaris has been shown to have many compounds that could be used to treat leukemia, but more research is needed Đặt vấn đề Bệnh bạch cầu mạn dịng tủy (BCMDT) bệnh lý ác tính máu tủy xương xảy trẻ em người lớn Khoảng 90-95% bệnh nhân mắc BCMDT phát có diện nhiễm sắc thể Philadelphia Đây nhiễm sắc thể số 22 hình thành chuyển đoạn nhiễm sắc thể số mang gen ABL nhiễm sắc thể 22 mang gen BCR, gọi chuyển đoạn t(9,22), kết dẫn đến việc hình thành nhiễm sắc thể Philadelphia, chứa gen BCR-ABL Gen BCR-ABL mã hóa protein thuộc họ tyrosine kinase BCR-ABL tự hoạt hóa chức khởi phát đường sinh ung thư dẫn đến phát triển bệnh BCMDT (Chereda nnk., 2015) Do đời imatinib, chất ức chế tyrosine kinase, bệnh nhân BCMDT hưởng lợi từ việc điều trị (Hochhaus nnk., 2017) Tuy nhiên, sau thời gian điều trị phát sinh vấn đề kháng imatinib Hiện nay, có bốn hệ thuốc ức chế tyrosine kinase sản xuất chứng minh có hiệu điều trị nhiên vấn đề kháng thuốc chưa giải triệt để, cần phải tìm kiếm thuốc phương thức điều trị Ngải cứu gọi thuốc cứu, thuốc cao, ngải điệp, có tên khoa học Artemisia vulgaris L thuộc họ Cúc Ngải cứu vị thuốc thông dụng, mọc hoang nhiều nơi Việt Nam, ngồi cịn có nhiều nước châu Á, châu Âu khác Đông y coi ngải cứu vị thuốc có tính ơn, vị cay, dùng làm thuốc chữa đau bụng hàn, an thai, điều kinh Ngồi ra, ngải cứu cịn dùng điều trị vấn đề tiêu hóa, chữa nôn mửa, thuốc giun, sốt rét (Lợi, 2004) Năm 2013, Sharmila cộng nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư ngải cứu dòng tế bào ung thư gan (HEPG2) với giá trị IC50 khoảng 0,1mg xác định phương pháp MTT (Sharmila nnk., 2013) Chiết xuất methanol phận không từ ngải cứu nhà nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ thử nghiệm để phân tích tác dụng gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư người dịng tế bào bình thường Saleh cộng đánh giá độc tính tinh dầu chiết xuất từ chồi ngải cứu tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư Các kết chứng minh trình apoptosis tinh dầu gây dòng tế bào bạch cầu HL-60 qua đường phụ thuộc caspase, liên quan đến caspase3, -9 -8, bắt đầu Bcl-2/Bax/Bid, dẫn đến giải phóng cytochrome c tế bào chất để hoạt hóa caspase Kết nghiên cứu cho thấy khả gây độc dòng tế bào ung thư khác Dựa quan sát này, tác giả cho ngải cứu nguồn đầy hứa hẹn chất chống ung thư (Erel nnk., 2011; Saleh nnk., 2014) Năm 2020, nhóm nghiên cứu Serbia chứng minh chiết xuất 67 http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2022.05.338 methanol ngải cứu có khả gây độc tế bào, thực dòng tế bào ung thư ruột kết SW-480 Các nhà nghiên cứu hoạt tính gây flavonoid hợp chất phenol khác có (Jakovljević nnk., 2020) Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tác động gây độc tế bào K562 cao chiết tổng cao chiết phân đoạn Ngải cứu Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chuẩn bị cao chiết Mẫu ngải cứu thu hái vùng Bảy Núi tỉnh An Giang vào tháng 9/2017 Mẫu sau thu hái loại bỏ hư hỏng, sâu bệnh rửa với nước trước tiến hành sấy khô 40oC tủ sấy mẫu khơ hồn tồn có trọng lượng không thay đổi Tiến hành xay lọc qua rây để thu bột khô ngải cứu Bột tiến hành ngâm với lượng methanol vừa đủ, lắc liên tục ngày Dịch chiết thu nhận cách lọc qua giấy lọc whattman sau cho bay dung môi với áp suất thấp 40oC để thu cao chiết thô Cao thô định lượng hoà tan DMSO (Sigma-Aldrich ) với nồng độ cuối 200mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45µm 0,22µm điều kiện vơ trùng Chia nhỏ thành eppendorf, bảo quản tủ -20℃ sử dụng (Nguyễn-Kim-Phi-Phụng, 2007) Để thu cao phân đoạn, dịch chiết methanol thô ngải cứu pha với nước chiết lỏng-lỏng với dung môi theo độ phân cực tăng dần, từ n-hexan chloroform sau ethyl axetate (EtOAc) cuối nước Sau đặc máy quay chân không để tạo phân đoạn tương ứng 2.2 Tế bào điều kiện nuôi cấy tế bào Các tế bào K562 nuôi cấy môi trường Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Sigma-Aldrich) có bổ sung 10% huyết thai bò (Thermofisher Scientific), 100IU/mL penicilin 0,1mg/mL streptomycin (SigmaAldrich) sau ủ tủ ấm 5% CO2 37oC 2.3 Thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào Tế bào huyền phù phân phối vào đĩa giếng mật độ 105 tế bào/mL có khơng có diện cao chiết nồng độ khác Sau thời gian xử lý, tế bào nhuộm thuốc nhuộm trypan blue để đánh giá tác động loại cao chiết lên tăng sinh tế bào (Chi nnk., 2012) 2.4 Phương pháp phân tích số liệu Các thí nghiệm thực ba lần phân tích phần mềm Graphpad prism phiên 9.0.0 Phân tích hồi quy phi tuyến thực để xác định nồng độ ngải cứu mà ức chế 50% quần thể tế bào (IC50) Sự khác biệt đáng kể xác định giá trị p 0,05 Dữ liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình 68 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 5(60)-2022 Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Tác động cao chiết thô cao chiết phân đoạn ngải cứu dòng tế bào K562 Cao chiết tổng cao chiết phân đoạn từ ngải cứu đánh giá độc tính dòng tế bào ung thư máu K562 nồng độ khác Kết hình cho thấy cao chiết tổng ức chế phát triển tế bào K562 phụ thuộc vào nồng độ cao chiết với giá trị IC50 ghi nhận bảng Nhìn chung nồng độ cao chiết tăng số lượng tế bào sống giảm Vì dịch chiết thô ngải cứu thường chứa nhiều thành phần chất khác nhau, chúng tơi tiến hành chiết lỏng –lỏng phân đoạn cao tổng thành phân đoạn nhỏ tương ứng với độ phân cực dung mơi tăng dần cách hịa tan dịch chiết thơ dung môi khác nhau, từ không phân cực (n-hexan) đến phân cực thấp (chloroform), phân cực trung bình (ethyl axetate) phân cực mạnh (nước) Tiếp theo, chúng tơi tiến hành kiểm tra độc tính cao chiết phân đoạn tăng sinh tế bào K562 Điều thú vị phát phân đoạn chloroform ethyl acetate ngăn chặn hiệu phát triển tế bào K562, phân đoạn nước khơng có tác động rõ (Hình 1) Hình Kết đánh giá độc tính cao chiết tổng cao chiết phân đoạn ngải cứu tế bào K562 Cao chiết phân đoạn chloroform phân đoạn ethyl acetate cho kết ức chế tăng sinh dòng tế bào K562 (giá trị IC50 5,84 ± 0,64µg/ml; 7,48 ± 0,50µg/ml, bảng 1) tốt so với phân đoạn n- hexan nước Như vậy, kết cho phép kết luận cao chiết phân đoạn chloroform phân đoạn ethyl acetate ngải cứu có chứa nhiều hợp chất tiềm điều trị ung thư máu, cần nghiên cứu thêm 69 http://doi.org/10.37550/tdmu.VJS/2022.05.338 Bảng Giá trị IC50 cao chiết thử nghiệm dòng tế bào K562 Giá trị IC50 (µg/ml) 44.27 ± 1.43 28.50 ± 1.48 5.84 ± 0.64 7.48 ± 0.50 184.14 ± 23.63 Cao thô Cao phân đoạn n-Hexan Cao phân đoạn Chloroform Cao phân đoạn EtOAc Cao phân đoạn Nước 3.2 Sự thay đổi hình thái tế bào tác động cao chiết ngải cứu Hình minh họa thay đổi hình thái tế bào sau 72 ủ với cao chiết tổng cao chiết phân đoạn ngải cứu nồng độ 100µg/ml Nhận xét chung, so với tế bào giếng đối chứng nhìn rõ nhân màng tế bào nghiệm thức xử lý với cao chiết cho thấy tế bào bị co lại nhuộm trypan blue quần thể tế bào gần bắt màu hồn toàn với thuốc nhuộm thể tế bào chết Riêng cao phân đoạn nước cụm tế bào sống thấy rõ nhân màng tế bào nguyên vẹn nhiều Hình Kết quan sát hình thái tế bào kính hiển vi soi ngược xử lý tế bào với cao chiết ngải cứu 3.3 Độc tính cao chiết ngải cứu theo thời gian dòng tế bào ung thư máu K562 Hình Phần trăm tế bào TCCY TCCY-T315I sống theo thời gian tác động ngải cứu 70 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 5(60)-2022 Dựa giá trị IC50 thí nghiệm trên, tiếp tục đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào K562 cao chiết ngải cứu theo thời gian Kết thể qua hình cho thấy, số tế bào sống sau ủ với cao chiết ngải cứu giảm dần qua ngày đến ngày thứ khơng cịn tế bào sống Trong giếng đối chứng khơng có cao chiết ngải cứu số tế bào sống tăng dần theo ngày đạt mật độ cao ngày thứ Kết nghiên cứu chứng minh cao chiết tổng ngải cứu có khả ức chế phát triển dịng tế bào ung thư máu K562 Cụ thể tác động cao chiết lên tăng sinh tế bào ung thư máu K562 phụ thuộc vào thời gian nồng độ cao chiết Ngoài ra, cao chiết phân đoạn chloroform ngải cứu cho thấy có chứa nhiều hợp chất tiềm điều trị ung thư máu cần tiến hành nghiên cứu thêm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chereda, B., & Melo, J V (2015) Natural course and biology of CML Ann Hematol, 94 Suppl 2, S107-121 doi: 10.1007/s00277-015-2325-z [2] Chi, H T., Ly, B T., Kano, Y., Tojo, A., Watanabe, T., & Sato, Y (2012) ETV6-NTRK3 as a therapeutic target of small molecule inhibitor PKC412 Biochem Biophys Res Commun, 429(1-2), 87-92 doi: 10.1016/j.bbrc.2012.10.087 [3] Erel, Ş B., Şenol, S G., Köse, F A., & Ballar, P (2011) In vitro cytotoxic properties of six Artemisia L species Turk J Pharm Sci, 8(3), 247-252 [4] Hochhaus, A., Larson, R A., Guilhot, F., Radich, J P., Branford, S., Hughes, T P., Investigators, I (2017) Long-Term Outcomes of Imatinib Treatment for Chronic Myeloid Leukemia N Engl J Med, 376(10), 917-927 doi: 10.1056/NEJMoa1609324 [5] Jakovljević, M R., Grujičić, D., Vukajlović, J T., Marković, A., Milutinović, M., Stanković, M., Milošević-Djordjević, O (2020) In vitro study of genotoxic and cytotoxic activities of methanol extracts of Artemisia vulgaris L and Artemisia alba Turra South African Journal of Botany, 132, 117-126 [6] Lợi, Đ T (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam [7] Nguyễn-Kim-Phi-Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [8] Saleh, A M., Aljada, A., Rizvi, S A., Nasr, A., Alaskar, A S., & Williams, J D (2014) In vitro cytotoxicity of Artemisia vulgaris L essential oil is mediated by a mitochondriadependent apoptosis in HL-60 leukemic cell line BMC complementary and alternative medicine, 14(1), 1-15 [9] Sharmila, K., & Padma, P (2013) Anticancer activity of Artemisia vulgaris on hepatocellular carcinoma (HepG2) cells Int J Pharm Pharmaceut Sci, 5(3), 479-483 71 ... nghiên cứu thảo luận 3.1 Tác động cao chiết thô cao chiết phân đoạn ngải cứu dòng tế bào K562 Cao chiết tổng cao chiết phân đoạn từ ngải cứu đánh giá độc tính dịng tế bào ung thư máu K562 nồng... nnk., 2020) Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tác động gây độc tế bào K562 cao chiết tổng cao chiết phân đoạn Ngải cứu Phương pháp nghiên cứu 2.1 Chuẩn bị cao chiết Mẫu ngải cứu thu hái vùng... đoạn EtOAc Cao phân đoạn Nước 3.2 Sự thay đổi hình thái tế bào tác động cao chiết ngải cứu Hình minh họa thay đổi hình thái tế bào sau 72 ủ với cao chiết tổng cao chiết phân đoạn ngải cứu nồng