NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae)

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG Hà Nội – Năm 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Trần Công Yên, người thầy tạo nên niềm ham thích với lĩnh vực nghiên cứu ung thư thu nhận tơi vào nhóm Ung thư thực nghiệm Thầy thấu hiểu động viên gặp khó khăn ngày đầu vào nhóm Tơi ln cảm thấy may mắn học làm việc hướng dẫn thầy dù thời gian khơng dài PGS.TS Nguyễn Thị Quỳ, người đồng sáng lập nhóm Ung thư thực nghiệm Cơ ln tận tình hướng dẫn, bảo lý thuyết kỹ thực nghiệm từ tơi cịn sinh viên đại học, tạo tảng giúp phát triển luận văn sau Tơi anh chị, bạn học viên, sinh viên nhóm ln muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô, cảm ơn cô quan tâm chia sẻ, ủng hộ hệ sinh viên tiếp bước đường đóng góp cho khoa học TS Hồng Thị Mỹ Nhung, người có ảnh hưởng lớn đến việc thơi thúc tơi gia nhập nhóm Ung thư thực nghiệm thời điểm tơi chưa có hội làm việc cô Cô không người gợi mở, giúp đỡ tơi thực thí nghiệm mà cịn tạo nên tơi lịng tin tưởng, mong muốn chia sẻ khó khăn, khúc mắc gặp phải công việc chủ động nêu lên ý kiến Tơi học khơng kiến thức, kỹ thuật mà cịn tính lạc quan, bình tĩnh xử lý tháo gỡ khó khăn gặp phải Cô đã, gương cho học tập cố gắng ThS Bùi Thị Vân Khánh, chị người tơi có hội làm việc từ ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu Với vai trị thành viên hữu dày kinh nghiệm, chị tận tâm bảo, chia sẻ kinh nghiệm thực nghiệm quý báu khúc mắc sống với Footer Page of 126 Header Page of 126 hệ học viên, sinh viên sau Đặc biệt khoảng thời gian chuẩn bị bảo vệ, chị sẵn sàng giúp đỡ động viên nhiều Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học nói chung thầy Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói riêng trang bị cho tơi kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo tảng vững giúp thực luận văn cơng việc sau Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người bạn lớp K51B Công nghệ Sinh học, anh chị, bạn em sinh viên thành viên nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ mơn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh, Khoa Sinh học bên cạnh, chia sẻ với tơi gặp khó khăn cơng việc sống Tơi may mắn có người bạn, người anh chị em Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Phịng thí nghiệm Trọng điểm, ĐH Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ TS Phương Thiện Thương, Viện Dược liệu Trung ương cung cấp mẫu để thực nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình ln ủng hộ tin tưởng tơi, góp ý tôn trọng lựa chọn suốt thời gian tơi học tập xa nhà, giúp tơi có chỗ dựa vững hoàn thành lựa chọn Luận văn thực tài trợ kinh phí từ đề tài Trọng điểm Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QGTĐ 10.28 Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH MINH HỌA ix BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 T ng u n ung hư 1.1.1 Một số đặc điểm củ ung hư 1.1.2 Các gi i đoạn phá riển củ ung hư 1.2 Các m h nh sàng ọc huốc chống ung hư 1.2.1 Nu i cấy u n 1.2.2 Nu i cấy tế bào 1.2.3 Nu i cấy khối cầu đ bào ung hư (mu ice u r umor spheroid)………………… 10 M h nh in i o 12 1.2.4 1.3 Mộ số ng ế bào ung hư 14 1.3.1 D ng ế bào ung hư biểu m ruột kết người - HCT116 14 1.3.2 D ng ế bào ung hư biểu m c tử cung người - Hela 14 1.3.3 D ng ế bào ung hư biểu m 1.3.4 D ng ế bào ung hư ú người - KPL4 16 1.4 ú người - MCF7 15 Chế ph m Hono io M gno o Derrone huốc T o 16 1.4.1 Hono io (H) M gno o (M) 16 1.4.2 Derrone (D) 19 Footer Page of 126 Header Page of 126 1.4.3 1.5 Taxol (Paclitaxel) 20 Enzyme Aurora kinaza 22 CHƯƠNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối ượng nghiên cứu 25 2.2 Máy móc 2.3 Hó chất sử dụng 26 2.4 Phương pháp hoạ hó 2.5 Phương pháp độc ính MTS 28 2.6 Phương pháp độc ính rên m h nh spheroi 30 2.7 Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31 ụng cụ 25 nhân nu i ng ế bào in vitro 27 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kế u h o sá độc ính củ Hono io M gno o Derrone rên m h nh 2D…………… 33 3.1.1 Với ng HCT116 33 3.1.2 Với ng He 38 3.1.3 Với ng MCF7 41 3.1.4 Với ng KPL4 44 3.2 Kế u nghiên cứu ác động củ Hono io rên m h nh 3D hối cầu đ bào MCF7………… 51 3.2.1 Kết qu hí nghiệm heo õi ăng rưởng khối spheroid MCF7……………………… 51 3.2.2 Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên uá r nh ạo khối spheroid MCF7 54 3.2.3 Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên ăng rưởng khối spheroid MCF7 56 Footer Page of 126 Header Page of 126 3.3 Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin 59 3.4 Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên phosphory hó Histon H3 vị rí Serine 10 62 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Dụng cụ vật tư tiêu hao 25 Bảng 2: Thiết bị sử dụng 26 Bảng 3: Hóa chất sử dụng 26 Bảng 4: Dải nồng độ cuối thuốc thử giếng 28 Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol Taxol 35 Bảng 6: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol Taxol với dòng HCT116 .38 Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol Taxol 39 Bảng 8: Giá trị IC50 Honokiol Taxol với dòng Hela .41 Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) MCF7 với Honokiol Taxol 43 Bảng 10: Giá trị IC50 Honokiol (H) Taxol với dòng TBUT MCF7 .44 Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol .47 Bảng 12: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 số tương quan R2 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol 50 Bảng 14:Thể tích khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau hạ giọt treo 52 Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol 58 Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Sáu đặc trưng ung thư Hình 2: Thận chuột sử dụng để sàng lọc thuốc Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy .9 Hình 4: Mơ hình cấu trúc khối u invivo khối cầu đa bào ung thư 10 Hình 5: Dịng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết HCT116 người .14 Hình 6: TBUT vú MCF7 nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro 15 Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) cấu trúc phân tử hai đồng phân Honokiol Magnolol (phải) .16 Hình 8: Cơ chế tác động Honokiol (H) Magnolol (M) lên đường truyền tin dẫn đến apoptosis tế bào .18 Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae công thức cấu tạo Derrone .19 Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol 20 Hình 11: Cơ chế tác động Taxol lên tế bào gây apoptosis 22 Hình 12: Hình ảnh mơ liên kết Taxol với vi sợi tubulin 22 Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza 24 Hình 14: Các dịng TBUT bảo quản bình đựng Nito lỏng .27 Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) .33 Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) 10µg/mL (phải) (100x) 33 Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol nồng độ 5µg/mL (trái) 50µg/mL (phải) (100x) 34 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm ix Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Luận văn cao học Danh mục vi t t t Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Honokiol (H) 36 Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Magnolol (M) 36 Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Taxol 37 Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 38 Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol nồng độ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 38 Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 39 Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Honokiol (H) 40 Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Taxol 40 Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 41 Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol nồng độ (trái); 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), 30µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Honokiol (H) 43 Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Taxol 44 Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 45 Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 45 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm x Footer Page 10 of 126 Header Page 72 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol N y Thể ích n b nh h he ( ) ĐCSH H 10ug/mL H 20ug/mL 2,03 2,15 2,42 3,07 3,08 2,94 5,09 3,21 4,77 7,61 5,45 5,47 11 8,51 6,55 5,16 13 10,91 8,44 5,95 15 12,46 10,84 5,11 Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 ảnh hưởng Honokiol (H) Như ậy ết qu thử ác động H ên uá r nh ạo khối ăng rưởng củ m h nh 3D spheroi ế bào ung hư ú MCF7 cho hấy H gây chết tế bào ẫn đến h ng tạo khối spheroid nồng độ 10 µg/mL ức chế ăng sinh khối nồng độ 10 20 µg/mL Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 58 Footer Page 72 of 126 Header Page 73 of 126 Luận văn cao học Các ết qu K t thảo luận u n sá h nh hái biến đ i cấu rúc khối đặt cho chúng i nghi vấn liệu H có ác động đến mối iên ết giữ ế bào ung hư àm lỏng lẻo cấu rúc khối spheroid hay lỏng lẻo cấu rúc đơn huần o độc ính H với tế bào Để gi i đáp nghi vấn chúng i iến hành hí nghiệm kiểm r ác động H ên hệ thống vi sợi c in ubu in tế bào ung hư c tử cung Hela phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence – IF) 3.3 K ả n h ên ảnh h ởn c a H n ên hệ ợ ac n Rất nhi u nghiên cứu Hono io có nh hưởng đến nhi u uá r nh hác nh u rong ế bào uá r nh o i hó chống iêm nhiễm, chết theo chương r nh Tuy nhiên chế ác động cụ thể Honokiol chư hoàn toàn hám phá Gần nhấ có số c ng bố v nh hưởng củ Hono io ên uá r nh ăng sinh mạch máu di chuyển tế bào Trong Hono io nh hưởng đến t chức củ phân c in hành cấu rúc iên u n đến vận động tế bào Trong nghiên cứu hi u n sá ế bào ý ới Hono io chúng nhận thấy tế bào có h y đ i v i ích hước, kh r i rộng tế bào ém iên ết giữ ế bào ới nh u ới n n nu i cấy bị gi m sú Tất c biến đ i rên phần lớn iên u n đến actin – loại protein quan trọng tạo nên cấu rúc ương ế bào V miễn dịch tế bào HeL ậy chúng i iến hành hí nghiệm nhuộm huỳnh quang ới phalloidin gắn rho mine Ph oi in chất chiết từ loại nấm độc có ên Amanita phalloides có h iên ế đặc hiệu với F-actin (chuỗi actin dạng sợi) Bằng cách sử dụng phalloidin gắn huỳnh u ng chúng i u n sá phân bố cách xếp sợi actin tế bào Kết qu cho thấy, quần thể tế bào HeL sau ủ với Honokiol nồng độ 10 µg/mL có h y đ i rõ rệt Từ mộ ượng tế bào b n đầu, sau 48h xử ý ới chấ ế bào phân bố hư hớ rời rạc so ới đối chứng ( o h ng ăng Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 59 Footer Page 73 of 126 Header Page 74 of 126 Luận văn cao học ên K t thảo luận số ượng đồng thời xuất ế bào chế ) Các tế bào phần lớn có ạng sợi h ng r i rộng h nh s o chi u ngang bị thu hẹp nhi u so với đối chứng Hình 49: Ảnh hưởng Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào Hình 50: Sự rối loạn phân bố F-actin tác động Honokiol NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ H nh mũi ên: c in co cụm màng ế bào; h nh m giác: ế bào chết Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 60 Footer Page 74 of 126 Header Page 75 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận Kho ng cách giữ ế bào ớn đặc biệt giữ ế bào cách nh u ẫn nối với sợi c in éo ài Sự tồn dạng cấu rúc có hể nh hưởng chấ ên uá r nh phân chi bào s u uá r nh nguyên phân iễn r ế bào chất dẫn đến phân ách h i ế h ng hoàn oàn h i ế bào ẫn c n ính sợi actin Khi chuyển s ng u n sá nhân chúng bào có nhân bị biến đ i so với đối chứng: nhân c đặc chi i nhận thấy ế hành nhi u hùy hành nhi u m ng nhân r n rời rạc có ích hước hác nh u Đi u có hể gi i hích o Hono io gây r ượng apoptosis Hela Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol NĐ 20µg/mL H nh ph i: tế bào nhuộm với phalloidin-rho mine (400 ); h nh bên rái: ế bào nhuộm với phalloidin-rho mine ubu in – M488 (1000x) Sự biểu F-actin tế bào h y đ i: Trong ế bào đối chứng, hệ sợi c in phân bố đ u rên oàn tế bào chấ u n sá cấu rúc dạng sợi h rên nhi u tế bào HeL màng ế bào có hể ý ới Honokiol, có hể dễ àng nhận thấy hệ thống sợi c in ém biểu ( ín hiệu huỳnh yếu so với đối chứng) ùng ế bào chất tối màu h ng u n sá actin tồn dạng sợi căng Một số tế bào ẫn biểu nhi u F- c in uy nhiên sợi actin rên ế bào ại tập trung nhi u màng ế bào hành cụm h ng phân bố hành ạng sợi iên ế hành mạng ưới đối chứng Chúng Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 61 Footer Page 75 of 126 i Header Page 76 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận u n sá hấy số tế bào bị teo nhỏ đám F- c in biến đ i cấu rúc hồn ồn Đây ế bào chết Với mẫu Hela ủ Honokiol nồng độ 20µg/mL chúng tế bào MCF7 gần chế ế bào co r n ại i nhận thấy hầu hết c in h ng ồn hành hệ thống vi sợi nữ mà sáng rực hành ừng điểm tế bào nhân bị c đặc phân m nh so với mẫu đối chứng Ngay c ubu in h ng dạng vi ống mộ cách rõ rệt Một số tế bào ẫn ràng buộc với i sợi c vi ống Đây u bất hường cấu rúc iên ế b nh hường giữ ế bào h ng có mặt củ micro ubu in Như ậy có hể thấy Hono io nh hưởng rõ rệ ên biểu cách xếp phân bố củ c in Đồng thời t chức củ c in bị rối loạn, h ng ồn hành ạng mạng ưới sợi mà co cụm hành ứng đám rên màng ế bào c tế bào chấ Đây có hể nguyên nhân ẫn đến biến đ i h nh dạng hu nhỏ ích hước tế bào 3.4 K H ả n h ên n H3 ị ảnh h ởn c a De ne ên ự h h y hóa í Serine 10 Cấu rúc hó học c ba chấ Hono io M gnono Derrone cung cấp Viện Dược liệu đ u chứa số nhóm cấu rúc ương ự phân ức chế hoạ ính enzyme Aurora kinaza đ ng nghiên cứu Từ nhận định rên chúng i tiến hành kiểm tra kh ức chế hoạ ính enzym Auror kinaza c ba chấ His on H3 phosphory hoá ại serine 10 Aurora B rong uá r nh phân bào (gọi tắ H3PS10) Do h sử dụng mộ hước đo hoạ ính protein Aurora Sự khởi đầu uá r nh nguyên phân iên u n đến phosphory hoá H3 uá r nh éo ài đến tận kỳ cuối Sự ức chế uá r nh phory hoá H3 ại serine 10 ác định háng hể háng đặc hiệu H3 photphoryl vị rí serine 10 Trong hí nghiệm chúng đồng tụ LSM 510 (Zeiss) để u n sá i sử dụng hệ thống ính hiển i chụp nh Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 62 Footer Page 76 of 126 ze ué Header Page 77 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận Các mẫu đối chứng mẫu hí nghiệm tiến hành iểm r rên ính sơ để ác định h ng số hích hợp v : độ mở ống nhận sáng (pinho e); độ phóng đại (zoom); cường độ ích hích ( zer power) S u đó, chúng i tiến hành chụp mẫu đối chứng hí nghiệm với mộ h ng số thiết lập Tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc độ mở ống nhận sáng cường độ l ze ích hích Do việc giữ h ng số chụp đ m b o so sánh his one H3 phory hó biểu ại serine 10 Đồng thời rong uá r nh chụp chúng i en ẽ chụp lại đối chứng để đ m b o ín hiệu huỳnh quang giữ mẫu kh ng bị sai lệch theo thời gian nguồn ze hoạ hó Chúng i hu kết qu s u: ế bào đối chứng oàn tế bào phân chi ỳ rước, giữ s u cuối củ ph M đ u cho kết qu ính ới háng hể H3PS10 nghĩ phosphory hoá H3 iễn r b nh hường Chúng i u n sá hấy số tế bào h ng phân chi ương ẫn biểu huỳnh u ng ế bào ph G2 chu n bị bước gi i đoạn M Ta biết tất c uá r nh chu n bị cho phân chi đ u diễn G2, có uá r nh hởi động cuộn xoắn nhiễm sắc thể úc his one H3 bắ đầu photphoryl hó Các ế bào phân chi co r n ại, màng nhân iêu biến Các NST cuộn xoắn biểu mạnh H3PS10 Các ế bào kỳ trung gian tr i rộng rên n n nu i cấy, có ạng h nh s o h ng biểu phory hó Histon H3 Một số tế bào biểu ế bào pha G2 chu n bị bước phân bào Trong số 03 mẫu chất thử nồng độ 10 µg/mL chúng i nhận thấy có Derrone có biểu rõ rệt ức chế H3P mức độ tế bào Các ế bào phân chi pha lại có biểu huỳnh quang rấ ù hác biệt Một số tế bào có ín hiệu mạnh ương đương ới đối chứng rong hi số biểu yếu gần h ng biểu Đặc biệt mẫu Derrone có gi m sú đáng ể ín hiệu huỳnh u ng rên ế bào c ba kỳ: đầu (proph se) đầu-giữa (prometaphase) ỳ giữ (me ph se) Chúng i đếm số ượng tế bào âm ính ới ín hiệu huỳnh quang, ín hiệu yếu h hu tỷ lệ 42% rên với mẫu Hono io M gnono ế bào phần lớn đ u biểu mạnh H3PS10 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 63 Footer Page 77 of 126 ng số tế bào phân chi Đối Header Page 78 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận tất c ỳ rong phân bào Tỷ lệ tế bào biểu yếu H3PS10 % mẫu Hono io % mẫu Magnonol Hình 52: Sự biểu H3PS10 kỳ khác trình phân chia tế bào Derrone thuộc nhóm chấ f onoi nhóm chấ có nhi u hoạ ính sinh học Rất nhi u chất thuộc nhóm đ ng ứng dụng rong u trị ung hư Kết qu nghiên cứu củ chúng i cho hấy Derrone có nh hưởng ức chế phosphory hó his on H3 ại serine 10 Đây chấ chứng minh enzyme Auror B Như ậy có hể bước đầu khẳng định Derrone mà chúng dụng rong đ ài có h ức chế hoạt ính Aurora kinaza Mặc ù độc ính Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 64 Footer Page 78 of 126 i sử Header Page 79 of 126 Luận văn cao học K t thảo luận chấ ên ng ung hư chư c o so với hai chấ c n ại iệc ác định chế ác động chất óng góp phần quan trọng cho việc biến đ i chấ để àm ăng hoạ ính củ Ở rường hợp biến đ i cấu rúc để àm ăng ính cạnh tranh chất với vị rí gắn ATP rên phân enzyme (a) (b) (c) (d) Hình 53: So sánh biểu H3PS10 mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) mẫu đối chứng (a) Mũi ên ( ): ế bào phân chi ; m: me ph se; p: proph se Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 65 Footer Page 79 of 126 Header Page 80 of 126 Luận văn cao học K t luận ki n nghị KẾT LUẬN Từ ết qu hí nghiệm phân ích rên chúng i rú r số kết luận s u:  Hono io có độc ính ới ng ế bào ung hư biểu m ruột kết HCT 116 ung hư c tử cung He ung hư ú MCF7 KPL4 với số IC50 ương ứng 2; 31,63; 17,8 8,3 µg/mL (R2 >0,9) M gno o có độc ính ới ng ế bào ung hư biểu m ruột kế HCT116 ung hư ú KPL4 ới số IC50 ương ứng à 14 µg/mL (R2 >0,9) Derrone có độc ính ới ng ế bào ung hư ú KPL4 ới số IC50 17 µg/mL (R2 >0,9)  Honokiol có ác động ngăn c n uá r nh ạo khối spheroid tế bào MCF7 nồng độ 10µg/mL ức chế ăng rưởng khối nồng độ 10 20 µg/mL  Hono io ác động đến biểu xếp phân bố hệ thống vi sợi c in àm chức actin bị rối loạn h ng ồn dạng mạng ưới sợi mà co cụm hành ừng đám rên màng ế bào c tế bào chất Derrone có h ức chế hoạ ính enzyme Aurora kinaza Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 66 Footer Page 80 of 126 Header Page 81 of 126 Luận văn cao học K t luận ki n nghị KIẾN NGHỊ  Nghiên cứu hêm chế ác động Honokiol, Magnolol Derrone ên tế bào  Tiếp tục kiểm r ác động Honokiol, M gno o m h nh 2D, 3D Derrone ên ng ế bào ung hư hác em é thử nghiệm rên m h nh in vivo Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 67 Footer Page 81 of 126 Header Page 82 of 126 Luận văn cao học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmedin Jemal, D., Phd, Freddie Bray P., Melissa M Center M., Jacques Fer y M E iz be h W r P n D i Form n P (2011) “G ob S C ncer is ics” CA: A Cancer Journal for Clinicians, 61, pp 69–90 Ahn, K.S., Sethi G., Shishodia S., Sung B., Arbiser J.L., and Aggarwal B.B (2006) “Hono io Po en i es Apop osis Suppresses Os eoc s ogenesis and Inhibits Invasion through Modulation of Nuclear Factor-κB Ac i ation P hw y” Molecular Cancer Research, (9), pp 621-633 Bai, X., Cerimele F., et al (2003) “Hono io Sm Mo ecu r Weigh N ur Pro uc Inhibi s Angiogenesis in Vi ro n Tumor Grow h in Vi o” Journal of Biological Chemistry, 278 (37), pp 35501-35507 Ch r bor y B.S (2001) “7 - Cancer drug development - Key regulatory consi er ions” Health Administrator, 20, pp 29-36 Chen, Y., Wu C., et al (2010) “Hono io in uces ce pop osis in hum n chondrosarcoma cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic re icu um s ress” Cancer Letters, 291 (1), pp 20-30 Chiang, C.-K., Sheu M.-L., et al (2011) “Hono io me ior es ren fibrosis by inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vi ro” British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp 586-597 Chiang, C., Sheu M., et al (2011) “Hono io me ior es ren fibrosis by inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in i ro” British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp 586-597 Di o S Losi T n Arbiser J.L (2008) “Hono io is po en sc enger of supero i e n pero y r ic s” Biochemical Pharmacology, 76 (5), pp 589-596 F G Ke G n Eyers P E.A (2006) “V i ing Auror B s an antic ncer rug rge ” Journal of Cell Science, 119 (36), pp 64-75 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 68 Footer Page 82 of 126 Header Page 83 of 126 Luận văn cao học 10 Fe oreye C Tài liệu tham khảo S.A Bu g o V.P e (2008) “Isof us Cu ure of he Re ic Tree M c i onoi Composi ion of murensis Rupr e M im” Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (16), pp 7023-7031 11 Freshney, R.I (2005), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thth edition, Willey Blackwell 12 Garcia, A., Zheng Y., et al (2008) “Hono io Suppresses Sur i Sign s Mediated by Ras-Dependent Phospholipase D Activity in Human Cancer Ce s” Clinical Cancer Research, 14 (13), pp 4267-4274 13 Gie R Pe re i C n Prigen C (2005) “Auror c ncer 250 coinci ence or re in ses neup oi y n in ? ” Trends in Cell Biololy, 15, pp 241- 14 Hanahan, D and Weinberg Robert (2011) “H Ne Gener ion” Cell, 144 (5), pp 646-674 m r s of C ncer: The 15 Hu L Hofm nn J Lu Y Mi s G.B n J ffe R.B (2002) “Inhibi ion of Phosph i y inosi o 3′-Kinase Increases Efficacy of Paclitaxel in in Vitro n in Vi o O ri n C ncer Mo e s” Cancer Research, 62 (4), pp 10871092 16 Ja, P.F., D R., S R., E R.-B n A C (2009) “Auror in se inhibi ors: new c ss of rugs rge ing he regu ory mi o ic sys em” Clinical & Translational Oncology, 11 (12), pp 787-798 17 Kim, S.C., Kim D.W., et al (2001) “In i o e u ion of po ymeric mice r p c i e formu ion: o ici y n effic cy” Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 72 (1-3), pp 191202 18 Kurebayashi, J., Otsuki T., et al (1999) “Iso ion n ch r c eriz ion of new human breast cancer cell line, KPL-4, expressing the Erb B family receptors and interleukin-6” British journal of cancer, 79 (5-6), pp 707-717 19 Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al (2010) “Hono io Inhibi s Epi erm Growth Factor Receptor Signaling and Enhances the Antitumor Effects of Epi erm Grow h F c or Recep or Inhibi ors” Clinical Cancer Research, 16 (9), pp 2571-2579 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 69 Footer Page 83 of 126 Header Page 84 of 126 Luận văn cao học 20 Tài liệu tham khảo Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al (2010) “Hono io inhibi s epi erm growth factor receptor signaling and enhances the antitumor effects of epi erm grow h f c or recep or inhibi ors” Clinical Cancer Research, 291 (1), pp 20-30 21 Li, Z., Liu Y., et al (2008) “Hono io n ur her peu ic c n i e in uces pop osis n inhibi s ngiogenesis of o ri n umor ce s” European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 140 (1), pp 95-102 22 Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M (2007) “Effec s of hono io n m gno o on cu e n inf mm ory p in mo e s in mice” Life Science, 81 (13) 23 Lin Y Chen H Ko C n Ch n M (2007) “Effec s of hono io n m gno o on cu e n inf mm ory p in mo e s in mice” Life Science, 81, pp 1071 - 1078 24 Lisa A Gurski, B., Nicholas J Petrelli M., Xinqiao Jia P., and Mary C Farach-C rson P (2010) “3D m rices for n i-cancer Drug testing and De e opmen ” Oncology Issues, January/February 25 Liu, S.H., Shen C.C., et al (2010) “Hono io inhibi s g s ric umourigenesis by activation of 15-lipoxygenase-1 and consequent inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and COX-2- epen en sign s” British Journal of Pharmacology, 160 (8), pp 1963-1972 26 Liu, Y., Chen L., et al (2008) “Enh ncemen of her peu ic effec i eness by combining iposom hono io wi h cisp in in o ri n c rcinom ” International Journal of Gynecological Cancer, 18 (4), pp 652-659 27 Masters, J.R.W (2002), Cancer cell lines, Vol I, II, III, Kluwer Academic Publishers 28 Mayer, B., Klement G., et al (2001) “Mu ice u r g s ric c ncer spheroi s recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric c rcinom s” Gastroenterology, 121 (4), pp 839-852 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 70 Footer Page 84 of 126 Header Page 85 of 126 Luận văn cao học 29 Tài liệu tham khảo Miller, K., Wang M., et al (2007) “P c i P ci e A one for Me s e p us Be cizum b ersus ic Bre s C ncer” New England Journal of Medicine, 357 (26), pp 2666-2676 30 Minchin on A.I n T nnoc I.F (2006) “Drug pene r ion in so i tumours” Nature Reviews Cancer, (8), pp 583-592 31 Ota, T., Suto S., et al (2002) “Incre se mi o ic phosphory ion of his one H3 attributable to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number ins bi i y” The Journal of Cancer Research, 62, pp 5168-5177 32 Panno, J (2005), Cancer: The Role of Genes, Lifestyle, and Enviroment, Facts on File 33 Ponnurangam, S., Mammen J.M.V., et al (2012) “Hono io in combin ion with radiation targets notch signaling to inhibit colon cancer s em ce s” Molecule Cancer Therapy, 11 (4), pp 963-972 34 Rolf Bjerkvig, P.D (1992), Spheroid culture in cancer research, 1th edition, Informa Healthcare 35 Rowins y E.K n Donehower R.C (1995) “P c i England Journal of Medicine, 332 (15), pp 1004-1014 36 Ruddon, R.W (2007), Cancer Biology, 4thth edition, Oxford University Press 37 S R M C n Wc E (2007) “Chromosom p ssengers uc ing ce i ision” Nature Reviews Molecular Cell Biology, (8), pp 798-812 38 Shen, J.-L., Man K.-M e (2010) “Hono io n M gno o s Mu ifunc ion An io i i e Mo ecu es for Derm o ogic Disor ers” Molecules, 15 (9), pp 6452-6465 39 Teicher, B.A (1997), Anticancer Drug Development Guide 40 Teicher, B.A (2001), Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery and Deverlopment, ed B.A Teicher, Human Press, New Jersey 41 V er G L.S (2008) “The uror in se f mi y in ce c ncer” Biochimica et Biophysica Acta, 1786, pp 60-72 Nguyễn Thị Ngọc Ánh i ision n K19 Sinh học thực nghiệm 71 Footer Page 85 of 126 e (T o )” New Header Page 86 of 126 Luận văn cao học 42 Tài liệu tham khảo Vavilala, D.T., Ponnaluri V.K.C., Vadlapatla R.K., Pal D., Mitra A.K., and Mu herji M (2012) “Hono io inhibi s HIF p hw y n hypo i -induced e pression of his one ysine eme hy ses” Biochemical and Biophysical Research Communications, 422 (3), pp 369-374 43 Wang, T.-H., Wang H.-S., and Soong Y.-K (2000) “P c i e h” Cancer, 88 (11), pp 2619-2628 e -induced cell 44 Wu, S.-N., Yeh C.-C., Huang H.-C., and Yang W.-H (2011) “Effec s of Honokiol on Membrane Electroporation-Induced Inward Current in Pituitary Tumor (GH3) Ce s ” Journal of Natural Products, 4, pp 115-124 45 Wu X Chen X n Hu Z (2003) “High-performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of honokiol and m gno o in r p sm ” Talanta, 59 (1), pp 115-121 46 Xu H T ng W Du G n Ko u o N (2011) “T rge ing pop osis pathways in cancer with magnolol and honokiol, bioactive constituents of the bark of M gno i officin is” Drug Discoveries & Therapeutics, (5), pp 202-210 47 Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., and Yang S.-T (2012) “Ce -Based Assays in High-Throughpu Screening for Drug Disco ery” International Journal of Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1, pp 31-51 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 72 Footer Page 86 of 126 ... Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae). .. đồng phân hợp chất chứa gốc pheno ách chiết từ vỏ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, c n gọi Hậu phác bắc Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) cấu trúc phân. .. ba chất Hono io M gno o ách chiết từ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae Derrone ách chiết từ V ng nem Erythrina orientalis L Murr., Fabaceae Viện Dược liệu Trung ương cung