Nghiên cứu hóa thực vật cây vông nem (erythrina orientalis (l ) murr , fabaceae)

Luận văn, khóa luận, chuyên đề, tiểu luận, quản trị, khoa học, tự nhiên, kinh tế

LỜI MỞ ĐẦU

Vốn là một đất nước được thiên nhiên ưu đãi, nằm trong vùng nhiệt đới giómùa, Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ lànguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữabệnh hết sức quý giá Cho đến nay, việc nghiên cứu và phát triển các dược phẩmmới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên vẫn đang đóng góp mạnh mẽ vào các lĩnhvực điều trị bao gồm chống ung thư, chống nhiễm khuẩn, chống viêm, điều chỉnhmiễn dịch và các bệnh về thần kinh Giữa những năm 2000 – 2005, hơn 20 thuốcmới là sản phẩm thiên nhiên hoặc dẫn xuất từ thiên nhiên đã được đưa vào sản xuất.Với việc đưa vào các phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học nhanh thách thức đặt

ra cho các nhà hóa học là việc nghiên cứu các quy trình phân tách hiệu quả các hợpchất thiên nhiên từ các nguồn thực vật, vi nấm, sinh vật biển… và thực hiện cácchuyển hóa hóa học, ví dụ như bằng các con đường biomimetic, để tạo ra các dẫnxuất mới

Cây Vông nem (Erythrina orientalis L Murr., Fabaceae) là một trong những

vị thuốc kinh nghiệm trong dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên thế giới cótác dụng an thần, hạ huyết áp, kháng khuẩn và chống loãng xương Cây Vông nemcủa Việt Nam còn chưa được nghiên cứu nhiều về hóa học Trong chương trìnhnghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc cổ truyền

của Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn cây Vông nem (Erythrina orientalis L Murr.,

Fabaceae) làm đối tượng nghiên cứu của luận văn này

Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI ERYTHRINA [1, 32, 33, 34]

Họ Đậu (Fabaceae) là họ lớn thứ hai của thực vật có hoa với 650 chi và trên18.000 loài Các tên gọi thông thường chủ yếu của các loài trong họ này là Đỗ hayĐậu và họ này chứa một số loài cây quan trọng bậc nhất trong cung cấp thực phẩmcho con người

Tất cả các thành viên trong họ này đều có hoa chứa 5 cánh hoa, trong dó bầunhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thểtách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ Các loài trong họ nàytheo truyền thống được phân loại trong ba phân họ:

 Phân họ Vang (Caesalpinioideae), hay họ Vang (Caesalpiniaceae)

 Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), hay họ Trinh nữ (Mimosaceae)

 Phân họ Đậu (Faboideae hay Papilionoideae) (họ Fabaceae nghĩa hẹp

hay họ Papilionaceae)

Erythrina [2] là một chi của loại cây có hoa trong phân họ Đậu (Fabaceae

nghĩa hẹp hay họ Papilionaceae) thuộc họ Đậu (Fabaceae) Các loài cây trong chinày phổ biến khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt trên thế giới Có khoảng 130 loài

trong chi Erythrina với một số loài thường gặp như sau:

 Erythrina abyssinica DC.

 Erythrina americana Mill (Mexico)

 Erythrina ankaranensis Du Puy & Labat (Madagascar)

 Erythrina atitlanensis Krukoff & Barneby

 Erythrina berteroana Urb.

 Erythrina burana Chiov (Ethiopia)

 Erythrina caffra Thunb (Southeastern Africa)

 Erythrina corallodendron L (Hispaniola, Jamaica)

 Erythrina coralloides D.C (Arizona in the United States, Mexico)

 Erythrina crista-galli L (Argentina, Uruguay, Brazil, Paraguay)

 Erythrina decora Harms

 Erythrina edulis Micheli – Basul

 Erythrina eggersii Krukoff & Moldenke (United States Virgin

Islands, Puerto Rico)

 Erythrina elenae Howard & Briggs (Cuba)

 Erythrina euodiphylla Hassk ex Backh (Indonesia)

 Erythrina falcata Benth (Brazil)

 Erythrina flabelliformis Kearney

 Erythrina fusca Lour (Pantropical)

 Erythrina haerdii Verdc (Tanzania)

 Erythrina hazomboay Du Puy & Labat (Madagascar)

 Erythrina herbacea L (Southeastern United States, Northeastern Mexico)

 Erythrina humeana Spreng (South Africa)

 Erythrina lanceolata Standl.

 Erythrina latissima E.Mey.

 Erythrina lysistemon Hutch (South Africa)

 Erythrina madagascariensis Du Puy & Labat (Madagascar)

 Erythrina megistophylla (Ecuador)

 Erythrina mulungu Diels Mart (Brazil)

 Erythrina perrieri R.Viguier (Madagascar)

 Erythrina poeppigiana (Walp.) O.F.Cook

 Erythrina polychaeta Harms (Ecuador)

 Erythrina rubrinervia Kunth

 Erythrina sacleuxii Hua (Kenya, Tanzania)

 Erythrina sandwicensis O.Deg (Hawaii)

 Erythrina schimpffii Diels (Ecuador)

 Erythrina schliebenii Harms (extinct: 1938)

 Erythrina senegalensis DC.

 Erythrina speciosa Andrews (Brazil)

 Erythrina stricta Roxb (Southeast Asia)

 Erythrina suberosa Roxb.

 Erythrina tahitensis Nadeaud (Tahiti)

 Erythrina tuxtlana Krukoff & Barneby (Mexico)

 Erythrina variegata L (Cambodia, Okinawa, Fiji, Bangladesh, Tibet,

Thailand, Vietnam)

 Erythrina velutina Willd (Caribbean, South America, Galápagos

Islands)

 Erythrina vespertilio Benth (Australia)

 Erythrina zeyheri Harv

Các cây lai (hybrid):

 Erythrina × bidwillii Lindl.

 Erythrina × sykesii Barneby & Krukoff.

1.2CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr.)

1.2.1 Thực vật học [1, 2]

Cây Vông nem còn được gọi bằng nhiều tên gọi khác là cây lá Vông, Hải

đồng bì, Thích đồng bì, tên khoa học là Erythrina orientalis L Murr [1], ngoài ra còn có các tên đồng nghĩa khác như Erythrina indica Lam., Erythrina variegata L var orientalis (L.) Merr., Erythrina variegata L.

Cây cao khoảng từ 10 – 20 m, thân có gai ngắn Lá gồm 3 lá, chét giữa rộnghơn là dài, dài 10 – 15 cm, hai lá chét hai bên dài hơn là rộng Hoa màu đỏ tươi tụhọp từ 1 – 3 thành chum dầy Quả giáp dài 15 – 30cm, đen, hơi hẹp lại giữa các hạt.Trong mỗi quả có 5 – 6 hạt hình thận màu đỏ hoặc nâu, tễ rộng, hình trứng đen cóvành trắng

Loài phân bố rộng từ Ðông Á châu tới Phi châu nhiệt đới Ở châu Á, loài nàyphổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam, Malaixia,Inđônêxia và Philippin Thường gặp trong các bụi dọc bờ biển, lân cận với các rừngngập mặn và trong rừng thưa, nhiều nơi ở nước ta Cũng thường được trồng làm câybóng mát dọc đường ở các khu dân cư Người ta thu hái lá vào mùa xuân, chọn lábánh tẻ, dùng tươi hay phơi khô, thu hái vỏ cây quanh năm

Dưới đây là ảnh của cây, hoa và vỏ thân cây Vông nem

Hình 1: Cây Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae)

Hình 2: Hoa Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae)

Hình 3: Vỏ thân Vông nem (Erythrina orientalis L., Fabaceae)

1.2.2 Tác dụng dược lý của E orientalis [1, 2]

Bộ phận dùng của cây Vông nem là vỏ và lá ( Cortex et Folium Erythrinae variegatae).

Theo [1, 2] tác dụng dược lý của lá Vông nem như sau Lá Vông có tác dụng

ức chế thần kinh trung ương, làm yên tĩnh, gây ngủ, hạ nhiệt độ, hạ huyết áp, co bópcác cơ; lá vông ít độc Nước sắc 10% lá vông, 9% NaCl có tác dụng làm co cứng cơchân ếch và cơ thắt trực tràng, co thắt cơ van, cơ hậu môn

Ở Trung Quốc vỏ cây vông được dùng làm thuốc chữa sốt, sát trùng, thôngtiểu, an thần và gây ngủ; dùng trong bệnh thổ tả, lỵ, amip và trực trùng, nhuậntràng Ngoài ra còn dùng làm thuốc xoa bóp, thuốc mỡ

1.2.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của E.

orientalis

Các nghiên cứu được thực hiện trên E orientalis được thu thập ở Trung

Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Pakistan, Indonesia, Samoa với các bộ phận lá, vỏ thân, rễ

và gỗ nhằm mục đích xác định các hợp chất thành phần, đặc biệt là các hoạt chấtquyết định cho các hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm Các hợp chất được phân

flavonoid (isoflavanon, isoflavon, pterocarpan, stilben và benzofuran) vàdiphenylpropandiol Sự prenyl hóa là một đặc trưng cấu trúc lý thú có thể đóng vai

trò nhất định trong các hoạt tính của các hợp chất flavonoid từ E orientalis.

1.2.3.1Các alkaloid

Từ những năm 1970, S Ghosal và cộng sự (Đại học Banaras Hindu, Ấn Độ)

đã tiến hành định lượng alkaloid trong các bộ phận của E orientalis [4] Vỏ thân

chứa 0,11% alkaloid với các alkaloid chính là erysotrin (1), erysodin (2), erysovin (3), erysonin (4), hypaphorin (5) và muối picrat của metyl ete (6) Lá chứa 0,035 % alkaloid với các alkaloid chính là erysotrin (7), erysodin (8), erythralin hiđroclorua (9) và hypaphorin Hạt chứa 0,082 % alkaloid trong đó hypaphorin là thành phần chính, erysopin (10) và erysotin (11).

Năm 1999, K Ito (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã tổng kết các alkaloid có

trong E orientalis [8] Ngoài các alkaloid trên, erybidin (12) và reticulin (13), báo

cáo còn nêu ra alkaloid dãy tetrahydroprotoberberin, scoulerin (14) và coreximin (15).

CH3N

H3CO

H3CO

H3CO

CH3N

H3CO

H3CO

1 3

N H

N(CH3)3COOR

CH3N

H3CO

5 10

Năm 1977, Deshpande V H và cộng sự đã phân lập từ vỏ ngoài E.

orientalis các isoflavon, erytrinin A (16), B (17) và C (18); osajin (19), alpinum

isoflavon (20), styrene oxyresveratrol (21) và dihydrostilben dihydrooxyresveratrol (22) [3].

Nănm 1990, Telikepalli H và cộng sự (Đại học Kansas, Mỹ) đã phân lập

được từ rễ E variegata L var orientalis (syn E indica) 4 pterocarpan,

erycristagallin (23), erythrabyssin-II (24), phaseollin (25) và phaseollidin (26); 2 isoflavon, warangalon (scandenon) (27) và 5,7,4’-trihydroxy-6,8-diprenylisoflavon (28) cùng với một flavanon, isobavachin (29), và một cinnamylphenol mới, eryvariestyren (30) [26].

O H

23 24

OH O

Năm 1996, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập

được một pterocarpan mới từ gỗ E orientalis, hydroxycristacarpon

(11b-hydroxydienon) (31) 11b-Hydroxydienon đã được biết đến như là dẫn xuất của các

pterocarpan phytoalexin được tạo thành bằng sự loại độc oxi hóa sự biến hóa của vi

khuẩn Đây là công bố đầu tiên về 11b-hydroxydienon từ chi Erythrina, và hydroxycristacarpon là một pterocarpan hiếm có cả nhóm prenyl và p-quinol trong

cấu trúc Các hợp chất khác được phân lập là pterocapan, crystacarpin (32) và 2

isoflavon, osajin (33) và wighteon (34) [19].

OH

H

Một pterocarpan mới, orientanol A (35), đã được H Tanaka và cộng sự (Đại

học Meijo, Nhật Bản) phân lập năm 1997 từ gỗ E orientalis cùng với một

isoflavon, daidzein (36) [20].

Năm 1997, V R Hegde và cộng sự (Viện nghiên cứu Schering-Plough, Mỹ)

đã phân lập từ vỏ cây E variegata 2 flavonoid, abyssinon V

(4’-hydroxy-3’,5’-diprenylisoflavonon) (37) và erycrystagallin diprenylpterocarp-6a-en) (23) cùng với một isoflavonon mới, 4’-hydroxy-6,3’,5’- triprenylisoflavonon (38) Abyssinon V và erycrystagallin đã được công bố là các

(3,9-dihydroxy-2,10-tác nhân kháng sinh vật từ loài Erythrina Ba flavonoid này là các chất ức chế

enzym photpholipase (PLA2) với các giá trị IC50 tương ứng là 6, 3, 10 μm [7].m [7]

H

OH

38

Năm 1998, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập từ

rễ E orientalis 2 pterocarpan mới là orientanol B (39) và orientanol C (40) cùng

với 2 pretocarpan đã biết, folitenol (41) và erythrabyssin II (24), một pterocarpen, erycristagallin (23), và isoflavon prenyl, bidwillol A (42) [21]

H

O

41 Năm 1998, các isoflavanon mới orientanol D, E và F (43, 44 và 45) đã được

H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) phân lập từ rễ E orientalis cùng

với 2 isoflavon, bidwillol A và bidwillol B (46) [22].

O

OH

OH O

O H

OH

OH

OH O

O

O O

OH

OH O

45 46

Năm 2002, M Sato và cộng sự (Đại học Asahi, Nhật Bản) đã công bố nghiên

cứu về hoạt tính kháng khuẩn của 7 isoflavonoid, orientanol B (39) methoxy-2-γ,γ-dimethylallylpterocarpan), erystagallin A (47) (3,6a-dihydroxy-9- methoxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)pterocarpan), cristacarpin (48) (3,6a-dihydroxy- 9-methoxy-10-γ,γ-dimethylallylpterocarpan), sigmoidin K (49) (3,9-dihydroxy- 2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)coumestan), erycristagallin (23) (3,9-dihydroxy-2,10-

(9-hydroxy-3-di(γ,γ-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan),

2-(γ,γ-dimethylallyl)-6a-hydroxyphaseollidin (50) (3,6a,9-trihydroxy 2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)pterocarpan), eryvarin A (51) (6a-hydroxy-3-methoxy(3′,4′-dihydro-3′-hydroxy)-2′,2′-

dimethylpyrano[5′,6′:9,10]pterocarpan) được phân lập từ E variegata đối với các vi

khuẩn gây sâu răng dehydropterocarpan (erycristagallin) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với

3,9-Dihydroxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)-6a,11a-các streptococci đường miệng, 3,9-Dihydroxy-2,10-di(γ,γ-dimethylallyl)-6a,11a-các chủng Actinomyces và Lactobacillus với nồng độ

MIC là 1,56–6,25 μm [7].g/ml tiếp đó là dimethylallyl) pterocarpan (erystagallin A) và 9-hydroxy-3-methoxy-2-γ,γ-dimethylallylpterocarpan (orientanol B) (MIC 3,13–12,5 μm [7].g/ml) Tác dụng khángkhuẩn của erycristagallin đối với các mutan streptococci được dựa trên một tácdụng diệt khuẩn Erycristagallin (MIC 6,25 μm [7].g/ml) đã ức chế hoàn toàn sự hợp nhất

3,6a-dihydroxy-9-methoxy-2,10-di(γ,γ-của thymidin được đánh dấu đồng vị vào các tế bào Streptococus mutans Sự hợp

nhất của glucozơ được đánh dấu đồng vị vào các tế bào vi khuẩn cũng được ức chếmạnh ở MIC, và ½ MIC của hợp chất giảm sự hợp nhất xuống khoảng một nửa

Các phát hiện đã cho thấy erycristagallin là tác nhân hóa học mạnh trong ngăn chặnsâu răng bằng cách ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây sâu răng và bằng cáchtác động vào sự hợp nhất của glucozơ quyết định cho sự sản sinh các axit hữu cơ[12]

O

O

O H

OH

OH

H

Cũng năm 2002, một nghiên cứu khác của H Tanaka và cộng sự (Đại học

Meijo, Nhật Bản) đã sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của 16 isoflavonoid được phân lập từ E variegata.

Mười bốn trong số 16 hợp chất được nghiên cứu bao gồm cristacarpin (48) dihydroxy-9-methoxy-10-c,c-dimethylallylpterocarpan), erycristagallin (23) (3,9-

(3,6a-dihydroxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)-6a,11a-dehydropterocarpan), erystagallin A

(47)

(6a-hydroxy-3-methoxy(3’,4’-dihydro-3’-hydroxy)-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:9,10]pterocarpan), erysubin F (52) dimethylallyl)isoflavone), eryvarin A (51) (6a-hydroxy-3-methoxy(3’,4’-dihydro- 3’-hydroxy)-2’,2’-dimethylpyrano[5’,6’:9,10]pterocarpan), eryvarin C (53) (2’,4’- dihydroxy-2’’,2’’-dimethylpyrano[5’’,6’’:6,7]isoflavan, eryvarin D (54) (3-

(9-hydroxy-3-methoxy-di(c,c-dimethylallyl)coumestan) và 2-(c,c-dimethylallyl)-6a-hydroxyphaseollidin

(57) (3,6a,9-trihydroxy-2,10-di(c,c-dimethylallyl)pterocarpan) cho hoạt tính kháng

khuẩn ở nồng độ rất khác nhau Hai hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất làerycristagallin và orientanol B với các giá trị MIC 3,13–6,25 μm [7].g/ml [16]

Năm 2002, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập

được từ rễ của E variegata 2 diphenylpropan-1,2-diol mới, eryvarinol A (58) và

eryvarinol B (59) Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định là

1-(4-hydroxy-

2-methoxyphenyl)-2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyloxy)-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-ol và dẫn xuất 3’’-prenyl của nó Cả hai hợp chất nàyđều là diphenylpropan-1,2-diol khác thường với một nhóm syringyl [17]

58 59

Năm 2003, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) đã phân lập từ

rễ E variegata các 3-phenoxychromon mới, eryvarin F (60) và G (61) Eryvarin F

và G là 2 dẫn xuất 3-phenoxychromon khác thường với 2 nhóm isoprenoid Cấu

trúc của các hợp chất này đã được xác định là hydroxy-6,8-di(3,3-dimethylallyl)chromen-4-on và 3-(2,4-dihydroxyphenoxy)-8-(3,3-dimethylallyl)-2,2-dimethylpyrano[5,6:6,7]chromen-4-on [18]

H

O

O O

OH O

H O

60 61

Năm 2003, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) tiếp tục công

bố một arylbenzofuran, erypoegin F (62) và 4 isoflavonoid, erypoegin G–J (63-65) cùng với 6 isoflavonoid đã biết, erypoegin A–E (67-71) Erypoegin F là một 2-

arylbenzofuran hiếm có một nhóm fomyl và erypoegin là isoflavonoid thiên nhiênđầu tiên có nhóm 2-oxo-3-metylbutyl [28]

OCH3

CHO

OH O

O

OH

H

64 65

Năm 2004, M Sato (Đại học Asahi, Nhật Bản) nghiên cứu về khả năng

kháng khuẩn của bidwillon B (46) được phân lập từ E variegata Bidwillon B ức

chế sự phát triển của 12 chủng MRSA ở nồng độ MIC 3,13–6,25 μm [7].g/ml, trong khicác MIC của mupirocin là 0,20–3,13 mg/l Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) củabidwillon B và mupirocin tương ứng là 6,25–25 mg/l (MBC90: 1,25 mg/l) và 3,13-

25 mg/l (MBC90: 25 mg/l) Khi bidwillon B và mupirocin được kết hợp, các tácdụng hợp đồng đã được xác định cho 11 chủng MRSA (chỉ số nồng độ ức chế cácphân đoạn, 0,5–0,75) Các giá trị MBC của mupirocin khi có bidwillon B (3,13g/ml) đã được giảm xuống 0,05–1,56 g/ml Bidwillon B ở các giá trị MIC ức chếmạnh sự hợp nhất của thymidin, uridin, glucozơ và isoleucin được đánh dấu phóng

xạ vào các tế bào MRSA Mupirocin có tác dụng ức chế thấp hơn bidwillon B đốivới sự hợp nhất của thymidin, uridin và glucozơ, nhưng sự hợp nhất isoleucin đãđược ngăn chặn hoàn toàn bởi kháng sinh này Các kết quả này đã cho thấybidwillon B có hoạt tính kháng MRSA đủ mạnh để ức chế sự phát triển và hồi phục

và hợp chất này đã tác dụng hợp đồng với mupirocin Các kết quả cũng cho thấy cả

2 hợp chất đã tác dụng lên MRSA qua các cơ chế khác nhau Bidwillon B có thểđược chứng tỏ là một tác nhân điều trị hóa thực vật mạnh và tác nhân kết hợp vớimupirocin trong sự điều trị và dự phòng các bệnh nhiễm khuẩn MRSA [10]

Năm 2004, H Tanaka và cộng sự (Đại học Meijo, Nhật Bản) công bố phân

lập được 3 isoflavonoid mới, eryvarin M (72), eryvarin N (73) và eryvarin O (74); 2

2-arylbenzofuran mới, các eryvarins P (75) và Q (76), một

3-aryl-2,3-dihydrobenzofuran mới, eryvarin R (77) cùng với ba hợp chất đã biết khác từ rễ E.

variergata Eryvarin R được xác định là một dẫn xuất 3-aryl-2,3-dihydrobenzofuran

khác thường với một nhóm fomyl Eryvarin Q cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối

với vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin [30].

OH OCH3OCH3

72 73

O O

H

OH

OCH3O

OH

H3CO

OCH3O

CHO

O H

74 75

OH O

OCH3

OCH3

OH

76 77

Năm 2006, L Xiaoli và cộng sự (Đại học Dược Shen Yang, Trung Quốc) đã

phân lập từ vỏ E varirgata 3 isoflavon mới,

5,4’-dihydroxy-8-(3,3-dimethylallyl)-2’-methoxyisopropylfurano[4,5:6,7]isoflavon (78), dimethylallyloxiranylmethyl)isoflavon (79) và 5,4’-dihydroxy-8-(3,3- dimethylallyl)-2’-hydroxymethyl-2’-methylpyrano[5,6:6,7]isoflavon (80), một

5,7,4’-trihydroxy-6-(3,3-isoflavanon mới,

5,4’-dihydroxy-2’-methoxy-8-(3,3-dimethylallyl)-2’,2’dimethylpyrano[5,6:6,7]isoflavanon (81) cùng với 7 hợp chất đã biết,

euchrenon b10 (82), isoerysenegalensein E (83), wighteon (34), laburnetin (84),

lupiwighteon (85), erythrodiol (86) và axit oleanolic (87) Ảnh hưởng của các hợp

chất này lên sự tăng sinh ung thư cốt xương chuột (UMR 106) đã được nghiên cứu[23]

O O

H3CO

O OH

OH

O

O OH

OH

O O

H

78 79

O OH

Năm 2007, Y Zhang và cộng sự (Đại học Dược Shen Yang, Trung Quốc)

công bố nghiên cứu về hoạt tính chống loãng xương của phần chiết vỏ thân E variegata (EV) được thử nghiệm trên chuột được cắt bỏ buồng trứng Sự tiếp nhận

phần chiết EV ở lượng 300 và 600 mg/kg mỗi ngày bằng đường uống trong 14 tuần

đã ngăn chặn sự tăng các mức ALP, OCN huyết thanh và DPD nước tiểu gây bởiOVX Sự phân tích hình thái mô đầu gần xương chày cho thấy phần chiết EV ngănchặn sự giảm độ dày thớ và diện tích thớ gây bởi sự thiếu hụt estrogen cũng nhưkhôi phục sự tăng phân tách thớ trong một sự phụ thuộc vào nồng độ Hơn thế nữa,phần chiết EV làm tăng sự hấp thụ năng lượng và sự cứng chắc của thân xương giữaxương đùi chuột Nghiên cứu này đã cho thấy rõ EV có thể kìm hãm tốc độ luânchuyển xương cao gây bởi sự thiếu hụt estrogen, kìm hãm sự mất xương và tăng cáctính chất cơ sinh của xương trên chuột OVX [24]

Năm 2008, Y Zhang và cộng sự (Đại học Chicago, Mỹ) đã phân lập đượccác dẫn xuất của genistein chủ yếu ở dạng prenylgenistein từ phần chiết EV, bao

gồm 6-prenylgenistein (88), 8-prenylgenistein (89), và 6,8-diprenylgenistein (90).

Nghiên cứu đã được thực hiện để xác định mối liên quan giữa cấu trúc-chức năngcủa các hợp chất này trong sự tăng sinh của tế bào xương, sự biệt hóa và khoánghóa trong các tế bào UMR 106 Kết quả đã cho thấy genistein không kích thích pháttriển tế bào trong khi 8-prenylgenistein thúc đẩy sự phát triển của tế bào khoảng 10-

tế bào UMR 106 khi được so sánh với tế bào đã được xử lý bằng genistein Sự tăngsinh của các tế bào được xử lý bằng 6,8-diprenylgenistein mạnh hơn so với các tếbào được xử lý bằng 6-prenylgenistein trong tất cả các nồng độ thử nghiệm Đối vớihoạt tính ALP, sự tăng mạnh đã được phát hiện trong các tế bào được xử lý bằng 8-prenylgenistein hoặc 6,8-diprenylgenistein trong 48h ở nồng độ 10-10 M Trongnghiên cứu khoáng hóa, hàm lượng Ca và P trong chất ngoại bào đã được tăngmạnh trong các tế bào được xử lý bằng 8-prenylgenistein Các kết quả cho thấy cácdẫn xuất genistein cho các tác dụng kích thích mạnh lên sự loãng xương trong các tếbào UMR 106 Dựa trên các nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc sự prenylhóa ở C-8 chứ không phải ở C-6 có thể làm tăng tác dụng bảo vệ xương củagenistein [31].

O O

Chương 2:

NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN

1- Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứacác hợp chất hữu cơ thiên nhiên từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem

2- Nghiên cứu quy trình phân tích và phân tách các phần chiết nhận được từ

từ lá, vỏ thân và gỗ cây Vông nem

3- Phân lập các hợp chất chính trong các phần chiết nhận được từ từ lá, vỏthân và gỗ cây Vông nem

4- Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết và phân tách các hợp chất trong mẫu thực vật

Ngâm chiết mẫu thực vật đã phơi khô, nghiền nhỏ bằng MeOH Để tăng hiệusuất chiết tiến hành ngâm chiết nhiều lần, mỗi lần ngâm trong 3 ngày Phần chiếtMeOH này sau đó được phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằmlàm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập sắc ký

a Sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được sửdụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá dược với nhiềumục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phântích nhỏ (thường từ 1 đến 100x10-6 g), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễthực hiện Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân tích định

tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợcho các phương pháp sắc ký cột để xác định và kiểm soát điều kiện phân tách.

b Sắc ký cột

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi trênsilica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết,phân lập và tinh chế các hợp chất

Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén để dungmôi rửa giải đi qua cột nhanh hơn

Sắc ký cột tinh chế (Mini–C) được thực hiện để tinh chế lượng nhỏ các mẫuchất (<15 mg)

c Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạchchất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu vàcủa tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc (các phương pháp phổ)

Các phương pháp phổ hiện nay là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhấtđể xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ bao gồm:

- Phổ hồng ngoại (IR);

- Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS);

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từhạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT; và

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR), HSQC và HMBC

Chương 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là lá, vỏ thân và gỗ cây vông nem

(Erythrina orientalis (L) Murr., Fabaceae) được thu thập tại Hà Nội vào tháng 10

năm 2008 (lá) và tháng 4 năm 2009 (vỏ thân và gỗ)

Mẫu được hong trong bóng dâm, sấy ở nhiệt độ 50oC sau đó được xay thànhbột mịn

3.2 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY VÔNG NEM

Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợpchất thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn Nhằm đạt được một sự làm giàu sơ bộmỗi loại chất trong các phần chiết riêng biệt, các bộ phận từ cây Vông nem (lá, vỏthân và gỗ) đã được chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần

Ba mẫu trên được ngâm chiết theo cùng một quy trình như sau:

Mẫu đã xay mịn được ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 3 lần,mỗi lần 3 ngày Dịch MeOH thu được sau khi đã lọc bỏ bã được cất loại dung môidưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH Chiết 2 pha lỏng (H2O - dung môi hữu cơ)các lớp chất trong phần chiết MeOH bằng các dung môi với độ phân cực tăng dần:

Mẫu lá (EL): Chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, điclometan và etyl

axetat Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , cất loại dung môi dưới áp suất

giảm và thu được các phần chiết tương ứng EL1 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô), EL2 (hiệu suất 0,57% so với lượng nguyên liệu khô) và EL3 (hiệu suất

0,25% so với lượng nguyên liệu khô)

Mẫu vỏ thân (EB): Chiết lần lượt bằng 2 dung môi là n-hexan và etyl

axetat Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất

giảm và thu được các phần chiết tương ứng EB1 (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô) và EB2 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô)

Mẫu gỗ (EW): Chiết bằng dung môi etyl axetat Dịch chiết được làm khan

bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được phần chiết tươngứng EOC (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô)

Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ 3 mẫu lá (EL), vỏ thân (EB) và gỗ (EW) được nêu trong Bảng 10, Mục 4.3, Chương 4

Quy trình chiết được tóm tắt ở Sơ đồ 1

Dịch nước

Chiết với n-hexan

Chiết với điclometan

Chiết với etyl axetat

Dịch chiếtđiclometan

Dịch chiếtEtyl axetat

Dịch chiết

n-hexan

Phần chiết điclometan

Phần chiết etyl axetat

Phần chiết

n-hexan

1 Làm khô bằng

Na2SO4

2 Cất loại kiệt dung môi

Phần chiết MeOH – trong nước

Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất từ cây Vông nem 3.3 PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)

Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck) Quá trình phân tích sắc ký được thực hiện với các hệdung môi với độ phân cực khác nhau nhằm mục đích tìm hệ cho sự phân giải tốtnhất Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được sấy khô, hiện màu với thuốc hiện1% vanilin/ H2SO4 đặc , hơ nóng ở 120oC và đánh dấu các vệt chất màu xuất hiệntrên bản mỏng

DC-3.3.1 Phân tích phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1)

Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy các hệ n-hexan-axeton 10:1, 6:1 và 3:1 (v/v) cho sự phân giải tốt đối với phần chiết n-hexan

Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EL1)

Như vậy, phần chiết n-hexan có nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể

hiện ở Rf phân tán Các tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, 6:1, 3:1) có thể được

sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải tốt

3.3.2 Phân tích phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2)

Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như EtOAc, axeton, n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận

điclometan-thấy các hệ n-hexan-axeton với 20:1, 10:1 và 6:1 (v/v) cho khả năng tách tốt đối với

phần chiết điclometan

Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 2

Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết điclometan (EL2)

Kết l uận:

Như vậy, phần chiết điclometan có nhiều chất với độ phân cực liền nhau, thểhiện ở Rf rất phân tán Tuy vậy, tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton với tỷ lệ 6:1 có thểđược sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt

3.3.3 Phân tích phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3)

Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận

thấy hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:20:1 (v/v/v) cho khả

năng phân giải tốt đối với phần chiết etyl axetat

Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (EL3)

lệ 20:20:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt

3.3.4 Phân tích TLC phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1)

Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận

thấy hệ điclometan-etyl axetat 49:1, 19:1 và 10:1 (v/v) cho khả năng phân giải tốt nhất đối với phần chiết n-hexan

Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 4

Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EB1)

Như vậy, phần chiết n-hexan có rất nhiều chất với độ phân cực khác nhau,

thể hiện ở Rf phân tán Các tỷ lệ dung môi điclometan - etyl axetat với tỷ lệ khácnhau 49:1, 19:1 và 10:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phângiải khá tốt

3.3.5 Phân tích phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem (EB2)

Tiến hành khảo sát TLC so sánh phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem

(EB2) song song với phần chiết n-hexan từ vỏ thân (EB1) cho các kết quả định tính