Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây vông nem erythrina orientalis l murr fabaceae và cây hậu phác magnolia officinalis rehd et wils magnoliaceae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH MINH HỌA vi BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Tổ ng quan về ung thƣ 1.1.1 Một số đặc điểm ung thƣ 1.1.2 Các giai đoạn phát triển ung thƣ 1.2 Các mô hình sàng lọc thuố c chố ng ung thƣ 1.2.1 Nuôi cấy quan 1.2.2 Nuôi cấy tế bào 1.2.3 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thƣ (multicellular tumor spheroid)………………… 10 1.2.4 Mơ hình in vivo 12 1.3 Mô ̣t số dòng tế bào ung thƣ 14 1.3.1 Dịng tế bào ung thƣ biểu mơ ruột kết ngƣời - HCT116 14 1.3.2 Dòng tế bào ung thƣ biểu mô cổ tử cung ngƣời - Hela 14 1.3.3 Dịng tế bào ung thƣ biểu mơ vú ngƣời - MCF7 15 1.3.4 Dòng tế bào ung thƣ vú ngƣời - KPL4 16 1.4 Chế phẩ m Honokiol, Magnolol, Derrone và thuố c Taxol 16 1.4.1 Honokiol (H) Magnolol (M) 16 1.4.2 Derrone (D) 19 1.4.3 Taxol (Paclitaxel) 20 1.5 Enzyme Aurora kinaza 22 CHƢƠNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Máy móc, dụng cụ 25 2.3 Hóa chất sử dụng 26 2.4 Phƣơng pháp hoạt hóa nhân ni dòng tế bào in vitro 27 2.5 Phƣơng pháp thử độc tính MTS 28 2.6 Phƣơng pháp thử độc tính mơ hình spheroid 30 2.7 Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kế t quả khảo sát đô ̣c tin ́ h của Honokiol , Magnolol và Derrone mô hình 2D…………… 33 3.1.1 Với dòng HCT116 33 3.1.2 Với dòng Hela 38 3.1.3 Với dòng MCF7 41 3.1.4 Với dòng KPL4 44 3.2 Kế t quả nghiên cƣ́u tác đô ̣ng của Honokiol mô hin ̀ h 3D khố i cầ u đa bào MCF7………… 51 3.2.1 Kết thí nghiệm theo dõi tăng trƣởng khối spheroid MCF7……………………… 51 3.2.2 Kết thí nghiệm kiểm tra tác động Honokiol lên trình tạo khối spheroid MCF7 54 3.2.3 Kết thí nghiệm kiểm tra tác động Honokiol lên tăng trƣởng khối spheroid MCF7 56 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Honokiol lên hệ vi sợi actin 59 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Derrone lên phosphoryl hóa Histon H3 vị trí Serine 10 62 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Luận văn cao học Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Dụng cụ vật tư tiêu hao 25 Bảng 2: Thiết bị sử dụng 26 Bảng 3: Hóa chất sử dụng 26 Bảng 4: Dải nồng độ cuối thuốc thử giếng 28 Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol Taxol 35 Bảng 6: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol Taxol với dòng HCT116 38 Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol Taxol 39 Bảng 8: Giá trị IC50 Honokiol Taxol với dòng Hela 41 Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) MCF7 với Honokiol Taxol 43 Bảng 10: Giá trị IC50 Honokiol (H) Taxol với dòng TBUT MCF7 44 Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol 47 Bảng 12: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 số tương quan R2 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol 50 Bảng 14:Thể tích khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau hạ giọt treo 52 Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol 58 Luận văn cao học Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Sáu đặc trưng ung thư Hình 2: Thận chuột sử dụng để sàng lọc thuốc Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy Hình 4: Mơ hình cấu trúc khối u invivo khối cầu đa bào ung thư 10 Hình 5: Dịng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết HCT116 người 14 Hình 6: TBUT vú MCF7 nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro 15 Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) cấu trúc phân tử hai đồng phân Honokiol Magnolol (phải) 16 Hình 8: Cơ chế tác động Honokiol (H) Magnolol (M) lên đường truyền tin dẫn đến apoptosis tế bào 18 Hình 9: Cây vơng nem Erythrina orientalis L., Fabaceae công thức cấu tạo Derrone 19 Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol 20 Hình 11: Cơ chế tác động Taxol lên tế bào gây apoptosis 22 Hình 12: Hình ảnh mô liên kết Taxol với vi sợi tubulin 22 Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza 24 Hình 14: Các dịng TBUT bảo quản bình đựng Nito lỏng 27 Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 33 Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) 10µg/mL (phải) (100x) 33 Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol nồng độ 5µg/mL (trái) 50µg/mL (phải) (100x) 34 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vi Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Honokiol (H) 36 Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Magnolol (M) 36 Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Taxol 37 Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 38 Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol nồng độ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 38 Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 39 Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Honokiol (H) 40 Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Taxol 40 Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 41 Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol nồng độ (trái); 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), 30µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Honokiol (H) 43 Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Taxol 44 Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 45 Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 45 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 45 Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ (trái) 20µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Honokiol (H) 48 Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Magnolol (M) 48 Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Derrone (D) 49 Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Taxol 49 Hình 41: Đồ thị biểu diễn tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể từ hạ giọt treo 52 Hình 42: Khối spheroid MCF7 25 ngày quan sát kể từ hạ giọt treo 53 Hình 43: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau (a) (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau (c) (d) ngày không tạo khối ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e) 55 Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo 56 Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 56 Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 57 Hình 47: Các khối spheroid tác động Honokiol trở nên lỏng lẻo mặt cấu trúc, tế bào bên ngồi bong tróc khỏi khối từ ngày thứ sau hạ giọt treo (400x) 57 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm viii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 ảnh hưởng Honokiol (H) 58 Hình 49: Ảnh hưởng Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào 60 Hình 50: Sự rối loạn phân bố F-actin tác động Honokiol NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ 60 Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol NĐ 20µg/mL 61 Hình 52: Sự biểu H3PS10 kỳ khác trình phân chia tế bào 64 Hình 53: So sánh biểu H3PS10 mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) mẫu đối chứng (a) 65 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm ix Luận văn cao học Danh mục viết tắt BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ VIẾT TẮT ADN Acid deoxiribinucleic ARN Acid ribonucleic c-FLIP FLICE-like inhibitory protein D Derrone ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium FBS Huyết thai bê – Fetal bovine serum FLICE Caspase H Honokiol HCT116 Human colorectal carcinoma cell line HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line KHV Kính hiển vi KPL4 Human breast cancer cell line M Magnolol MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- MTS carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium) NĐ Nồng độ Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm x Luận văn cao học Kết thảo luận Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol Ngày thứ Thể tích trung bình khới spheroid (mm3) ĐCSH H 10ug/mL H 20ug/mL 2,03 2,15 2,42 3,07 3,08 2,94 5,09 3,21 4,77 7,61 5,45 5,47 11 8,51 6,55 5,16 13 10,91 8,44 5,95 15 12,46 10,84 5,11 Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 ảnh hưởng Honokiol (H) Nhƣ vậy, kết thử tác động H lên trình tạo khối tăng trƣởng mơ hình 3D spheroid tế bào ung thƣ vú MCF7 cho thấy H gây chết tế bào dẫn đến không tạo đƣợc khối spheroid nồng độ 10 µg/mL ức chế tăng sinh khối nồng độ 10 20 µg/mL Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 58 Luận văn cao học Kết thảo luận Các kết quan sát hình thái biến đổi cấu trúc khối đặt cho nghi vấn liệu H có tác động đến mối liên kết tế bào ung thƣ, từ làm lỏng lẻo cấu trúc khối spheroid hay lỏng lẻo cấu trúc này đơn là độc tính H với tế bào Để giải đáp nghi vấn này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm kiểm tra tác động H lên hệ thống vi sợi actin tubulin tế bào ung thƣ cổ tử cung Hela phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence – IF) 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Honokiol lên hệ vi sợi actin Rất nhiều nghiên cứu Honokiol có ảnh hƣởng đến nhiều q trình khác tế bào nhƣ trình oxi hóa, chống viêm nhiễm, chết theo chƣơng trình Tuy nhiên chế tác động cụ thể Honokiol chƣa đƣợc hồn tồn khám phá Gần có số công bố ảnh hƣởng Honokiol lên trình tăng sinh mạch máu di chuyển tế bào Trong Honokiol ảnh hƣởng đến tổ chức phân tử actin thành cấu trúc liên quan đến vận động tế bào Trong nghiên cứu này, quan sát tế bào xử lý với Honokiol, chúng tơi nhận thấy tế bào có thay đổi kích thƣớc, khả trải rộng tế bào kém, liên kết tế bào với với nuôi cấy bị giảm sút Tất biến đổi phần lớn liên quan đến actin – loại protein quan trọng tạo nên cấu trúc khung xƣơng tế bào Vì chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhuộm huỳnh quang miễn dịch tế bào HeLa với phalloidin gắn rhodamine Phalloidin chất chiết từ loại nấm độc có tên Amanita phalloides, có khả liên kết đặc hiệu với F-actin (chuỗi actin dạng sợi) Bằng cách sử dụng phalloidin gắn huỳnh quang chúng tơi quan sát phân bố nhƣ cách xếp sợi actin tế bào Kết cho thấy, quần thể tế bào HeLa sau ủ với Honokiol nồng độ 10 µg/mL có thay đổi rõ rệt Từ lƣợng tế bào ban đầu, sau 48h xử lý với chất, tế bào phân bố thƣa thớt rời rạc so với đối chứng (do không tăng Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 59 Luận văn cao học Kết thảo luận lên số lƣợng, đồng thời xuất tế bào chết) Các tế bào phần lớn có dạng sợi khơng trải rộng hình sao, chiều ngang bị thu hẹp nhiều so với đối chứng Hình 49: Ảnh hưởng Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào Hình 50: Sự rối loạn phân bố F-actin tác động Honokiol NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ Hình mũi tên: actin co cụm màng tế bào; hình tam giác: tế bào chết Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 60 Luận văn cao học Kết thảo luận Khoảng cách tế bào lớn, đặc biệt tế bào cách xa nối với sợi actin kéo dài Sự tồn dạng cấu trúc ảnh hƣởng chất lên q trình phân chia tế bào chất dẫn đến phân tách hai tế bào sau trình nguyên phân diễn khơng hồn tồn, hai tế bào cịn dính sợi actin Khi chuyển sang quan sát nhân, chúng tơi nhận thấy tế bào có nhân bị biến đổi so với đối chứng: nhân cô đặc hơn, chia thành nhiều thùy thành nhiều mảng nhân tròn rời rạc có kích thƣớc khác Điều giải thích Honokiol gây tƣợng apoptosis Hela Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol NĐ 20µg/mL Hình phải: tế bào nhuộm với phalloidin-rhodamine (400x,); hình bên trái: tế bào nhuộm với phalloidin-rhodamine tubulin – M488 (1000x) Sự biểu F-actin tế bào thay đổi: Trong tế bào đối chứng, hệ sợi actin phân bố toàn tế bào chất màng tế bào, quan sát đƣợc cấu trúc dạng sợi nhiều tế bào HeLa xử lý với Honokiol, dễ dàng nhận thấy hệ thống sợi actin biểu (tín hiệu huỳnh yếu so với đối chứng), vùng tế bào chất tối màu, không quan sát đƣợc actin tồn dạng sợi căng Một số tế bào biểu nhiều F-actin, nhiên sợi actin tế bào lại tập trung nhiều màng tế bào thành cụm không phân bố thành dạng sợi liên kết thành mạng lƣới nhƣ đối chứng Chúng Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 61 Luận văn cao học Kết thảo luận quan sát thấy số tế bào bị teo nhỏ chứa đám F-actin biến đổi cấu trúc hoàn toàn Đây là tế bào đã chết Với mẫu Hela ủ Honokiol nồng độ 20µg/mL, nhận thấy hầu hết tế bào MCF7 gần nhƣ chết, tế bào co trịn lại, actin khơng tồn thành hệ thống vi sợi mà sáng rực thành điểm tế bào, nhân bị cô đặc phân mảnh so với mẫu đối chứng Ngay tubulin không dạng vi ống cách rõ rệt Một số tế bào ràng buộc với vi sợi vi ống Đây là điều bất thƣờng cấu trúc liên kết bình thƣờng tế bào khơng có mặt microtubulin Nhƣ thấy Honokiol ảnh hƣởng rõ rệt lên biểu nhƣ cách xếp, phân bố actin Đồng thời tổ chức actin bị rối loạn, không tồn thành dạng mạng lƣới sợi mà co cụm thành tứng đám màng tế bào tế bào chất Đây nguyên nhân dẫn đến biến đổi hình dạng thu nhỏ kích thƣớc tế bào 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Derrone lên phosphoryl hóa Histon H3 vị trí Serine 10 Cấu trúc hóa học ba chất Honokiol, Magnonol Derrone cung cấp Viện Dƣợc liệu chứa số nhóm cấu trúc tƣơng tự nhƣ phân tử ức chế hoạt tính enzyme Aurora kinaza đƣợc nghiên cứu Từ nhận định trên, tiến hành thử kiểm tra khả ức chế hoạt tính enzym Aurora kinaza ba chất Histon H3 đƣợc phosphoryl hoá serine 10 Aurora B trình phân bào (gọi tắt H3PS10) Do đó, khả này đƣợc sử dụng nhƣ thƣớc đo hoạt tính protein Aurora Sự khởi đầu trình nguyên phân liên quan đến phosphoryl hoá H3 và trình này kéo dài đến tận kỳ cuối Sự ức chế trình photphoryl hố H3 serine 10 đƣợc xác định kháng thể kháng đặc hiệu H3 photphoryl vị trí serine 10 Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng hệ thống kính hiển vi laze quét đồng tụ LSM 510 (Zeiss) để quan sát chụp ảnh Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 62 Luận văn cao học Kết thảo luận Các mẫu đối chứng mẫu thí nghiệm đƣợc tiến hành kiểm tra kính sơ để xác định thơng số thích hợp về: độ mở ống nhận sáng (pinhole); độ phóng đại (zoom); cƣờng độ kích thích (lazer power) Sau đó, chúng tơi tiến hành chụp mẫu đối chứng thí nghiệm với thơng số đƣợc thiết lập Tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc vào độ mở ống nhận sáng và cƣờng độ laze kích thích Do việc giữ thơng số chụp đảm bảo so sánh biểu histone H3 photphoryl hóa serine 10 Đồng thời q trình chụp, chúng tơi xen kẽ chụp lại đối chứng để đảm bảo tín hiệu huỳnh quang mẫu không bị sai lệch theo thời gian nguồn laze đƣợc hoạt hóa Chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau: tế bào đối chứng, toàn tế bào phân chia kỳ trƣớc, giữa, sau cuối pha M cho kết dƣơng tính với kháng thể H3PS10, nghĩa là phosphoryl hố H3 diễn bình thƣờng Chúng tơi quan sát thấy số tế bào không phân chia biểu huỳnh quang, là tế bào pha G2 chuẩn bị bƣớc vào giai đoạn M Ta biết tất trình chuẩn bị cho phân chia diễn G2, có trình khởi động cuộn xoắn nhiễm sắc thể, là lúc histone H3 bắt đầu đƣợc photphoryl hóa Các tế bào phân chia co trịn lại, màng nhân tiêu biến Các NST cuộn xoắn biểu mạnh H3PS10 Các tế bào kỳ trung gian trải rộng ni cấy, có dạng hình sao, khơng biểu photphoryl hóa Histon H3 Một số tế bào biểu tế bào pha G2 chuẩn bị bƣớc vào phân bào Trong số 03 mẫu chất thử nồng độ 10 µg/mL, chúng tơi nhận thấy có Derrone có biểu rõ rệt ức chế H3P mức độ tế bào Các tế bào phân chia dù pha lại có biểu huỳnh quang khác biệt Một số tế bào có tín hiệu mạnh, tƣơng đƣơng với đối chứng, số biểu yếu gần nhƣ không biểu Đặc biệt mẫu Derrone có giảm sút đáng kể tín hiệu huỳnh quang tế bào ba kỳ: đầu (prophase), đầu-giữa (prometaphase) kỳ (metaphase) Chúng đếm số lƣợng tế bào âm tính với tín hiệu huỳnh quang, tín hiệu yếu thì thu đƣợc tỷ lệ 42% tổng số tế bào phân chia Đối với mẫu Honokiol Magnonol, tế bào phần lớn biểu mạnh H3PS10 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 63 Luận văn cao học Kết thảo luận tất kỳ phân bào Tỷ lệ tế bào biểu yếu H3PS10 1,2 % mẫu Honokiol 1,5 % mẫu Magnonol Hình 52: Sự biểu H3PS10 kỳ khác trình phân chia tế bào Derrone thuộc nhóm chất flavonoid, nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học Rất nhiều chất thuộc nhóm này và đƣợc ứng dụng điều trị ung thƣ Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy Derrone có ảnh hƣởng ức chế phosphoryl hóa histon H3 serine 10 Đây là chất đƣợc chứng minh enzyme Aurora B Nhƣ vậy, bƣớc đầu khẳng định Derrone mà chúng tơi sử dụng đề tài có khả ức chế hoạt tính Aurora kinaza Mặc dù độc tính Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 64 Luận văn cao học Kết thảo luận chất này lên dòng ung thƣ chƣa cao so với hai chất lại, nhƣng việc xác định đƣợc chế tác động chất dóng góp phần quan trọng cho việc biến đổi chất để làm tăng hoạt tính Ở trƣờng hợp này là biến đổi cấu trúc để làm tăng tính cạnh tranh chất với vị trí gắn ATP phân tử enzyme (a) (b) (c) (d) Hình 53: So sánh biểu H3PS10 mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) mẫu đối chứng (a) Mũi tên (a): tế bào phân chia; m: metaphase; p: prophase Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 65 Luận văn cao học Kết luận kiến nghị KẾT LUẬN Từ nhƣng kết thí nghiệm và phân tích đây, rút số kết luận nhƣ sau:  Honokiol có độc tính với dịng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT 116, ung thƣ cổ tử cung Hela, ung thƣ vú MCF7 KPL4 với số IC50 tƣơng ứng 2; 31,63; 17,8 8,3 µg/mL (R2 >0,9) Magnolol có độc tính với dịng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 và ung thƣ vú KPL4 với số IC50 tƣơng ứng 0,2 14,8 µg/mL (R2 >0,9) Derrone có độc tính với dòng tế bào ung thƣ vú KPL4 với số IC50 17,8 µg/mL (R2 >0,9)  Honokiol có tác động ngăn cản trình tạo khối spheroid tế bào MCF7 nồng độ 10µg/mL ức chế tăng trƣởng khối nồng độ 10 20 µg/mL  Honokiol tác động đến biểu nhƣ xếp, phân bố hệ thống vi sợi actin, làm tổ chức actin bị rối loạn, không tồn dạng mạng lƣới sợi mà co cụm thành đám màng tế bào tế bào chất Derrone có khả ức chế hoạt tính enzyme Aurora kinaza Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 66 Luận văn cao học Kết luận kiến nghị KIẾN NGHỊ  Nghiên cứu thêm chế tác động Honokiol, Magnolol Derrone lên tế bào  Tiếp tục kiểm tra tác động Honokiol, Magnolol Derrone lên mơ hình 2D, 3D dòng tế bào ung thƣ khác xem xét thử nghiệm mô hiǹ h in vivo Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 67 Luận văn cao học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmedin Jemal, D., Phd, Freddie Bray P., Melissa M Center M., Jacques Ferlay M., Elizabeth Ward P., and David Forman P (2011), “Global Cancer Statistics”, CA: A Cancer Journal for Clinicians, 61, pp 69–90 Ahn, K.S., Sethi G., Shishodia S., Sung B., Arbiser J.L., and Aggarwal B.B (2006), “Honokiol Potentiates Apoptosis, Suppresses Osteoclastogenesis, and Inhibits Invasion through Modulation of Nuclear Factor-κB Activation Pathway”, Molecular Cancer Research, (9), pp 621-633 Bai, X., Cerimele F., et al (2003), “Honokiol, a Small Molecular Weight Natural Product, Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo”, Journal of Biological Chemistry, 278 (37), pp 35501-35507 Chakraborty, B.S (2001), “7 - Cancer drug development - Key regulatory considerations”, Health Administrator, 20, pp 29-36 Chen, Y., Wu C., et al (2010), “Honokiol induces cell apoptosis in human chondrosarcoma cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress”, Cancer Letters, 291 (1), pp 20-30 Chiang, C.-K., Sheu M.-L., et al (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”, British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp 586-597 Chiang, C., Sheu M., et al (2011), “Honokiol ameliorates renal fibrosis by inhibiting extracellular matrix and pro-inflammatory factors in vivo and in vitro”, British Journal of Pharmacology, 163 (3), pp 586-597 Dikalov, S., Losik T., and Arbiser J.L (2008), “Honokiol is a potent scavenger of superoxide and peroxyl radicals”, Biochemical Pharmacology, 76 (5), pp 589-596 F, G., Ke G., and Eyers Pa E.A (2006), “Validating Aurora B as an anticancer drug target”, Journal of Cell Science, 119 (36), pp 64-75 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 68 Luận văn cao học 10 Tài liệu tham khảo Fedoreyev, S.A., Bulgakov V.P., et al (2008), “Isoflavonoid Composition of a Callus Culture of the Relict Tree Maackia amurensis Rupr et Maxim”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (16), pp 7023-7031 11 Freshney, R.I (2005), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thth edition, Willey Blackwell 12 Garcia, A., Zheng Y., et al (2008), “Honokiol Suppresses Survival Signals Mediated by Ras-Dependent Phospholipase D Activity in Human Cancer Cells”, Clinical Cancer Research, 14 (13), pp 4267-4274 13 Giet, R., Petretti C., and Prigent C (2005), “Aurora kinases, aneuploidy and cancer, a coincidence or a real link? ”, Trends in Cell Biololy, 15, pp 241250 14 Hanahan, D and Weinberg Robert a (2011), “Hallmarks of Cancer: The Next Generation”, Cell, 144 (5), pp 646-674 15 Hu, L., Hofmann J., Lu Y., Mills G.B., and Jaffe R.B (2002), “Inhibition of Phosphatidylinositol 3′-Kinase Increases Efficacy of Paclitaxel in in Vitro and in Vivo Ovarian Cancer Models”, Cancer Research, 62 (4), pp 10871092 16 Ja, P.F., D R., S R., E R.-B., and A C (2009), “Aurora kinase inhibitors: a new class of drugs targeting the regulatory mitotic system”, Clinical & Translational Oncology, 11 (12), pp 787-798 17 Kim, S.C., Kim D.W., et al (2001), “In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation: toxicity and efficacy”, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 72 (1-3), pp 191202 18 Kurebayashi, J., Otsuki T., et al (1999), “Isolation and characterization of a new human breast cancer cell line, KPL-4, expressing the Erb B family receptors and interleukin-6”, British journal of cancer, 79 (5-6), pp 707-717 19 Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al (2010), “Honokiol Inhibits Epidermal Growth Factor Receptor Signaling and Enhances the Antitumor Effects of Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors”, Clinical Cancer Research, 16 (9), pp 2571-2579 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 69 Luận văn cao học 20 Tài liệu tham khảo Leeman-Neill, R.J., Cai Q., et al (2010), “Honokiol inhibits epidermal growth factor receptor signaling and enhances the antitumor effects of epidermal growth factor receptor inhibitors”, Clinical Cancer Research, 291 (1), pp 20-30 21 Li, Z., Liu Y., et al (2008), “Honokiol, a natural therapeutic candidate, induces apoptosis and inhibits angiogenesis of ovarian tumor cells”, European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, 140 (1), pp 95-102 22 Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M (2007), “Effects of honokiol and magnolol on acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81 (13) 23 Lin, Y., Chen H., Ko C., and Chan M (2007), “Effects of honokiol and magnolol on acute and inflammatory pain models in mice”, Life Science, 81, pp 1071 - 1078 24 Lisa A Gurski, B., Nicholas J Petrelli M., Xinqiao Jia P., and Mary C Farach-Carson P (2010), “3D matrices for anti-cancer Drug testing and Development”, Oncology Issues, January/February 25 Liu, S.H., Shen C.C., et al (2010), “Honokiol inhibits gastric tumourigenesis by activation of 15-lipoxygenase-1 and consequent inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and COX-2-dependent signals”, British Journal of Pharmacology, 160 (8), pp 1963-1972 26 Liu, Y., Chen L., et al (2008), “Enhancement of therapeutic effectiveness by combining liposomal honokiol with cisplatin in ovarian carcinoma”, International Journal of Gynecological Cancer, 18 (4), pp 652-659 27 Masters, J.R.W (2002), Cancer cell lines, Vol I, II, III, Kluwer Academic Publishers 28 Mayer, B., Klement G., et al (2001), “Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas”, Gastroenterology, 121 (4), pp 839-852 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 70 Luận văn cao học 29 Tài liệu tham khảo Miller, K., Wang M., et al (2007), “Paclitaxel plus Bevacizumab versus Paclitaxel Alone for Metastatic Breast Cancer”, New England Journal of Medicine, 357 (26), pp 2666-2676 30 Minchinton, A.I and Tannock I.F (2006), “Drug penetration in solid tumours”, Nature Reviews Cancer, (8), pp 583-592 31 Ota, T., Suto S., et al (2002), “Increased mitotic phosphorylation of histone H3 attributable to AIM-1/Aurora-B overexpression contributes to chromosome number instability”, The Journal of Cancer Research, 62, pp 5168-5177 32 Panno, J (2005), Cancer: The Role of Genes, Lifestyle, and Enviroment, Facts on File 33 Ponnurangam, S., Mammen J.M.V., et al (2012), “Honokiol in combination with radiation targets notch signaling to inhibit colon cancer stem cells”, Molecule Cancer Therapy, 11 (4), pp 963-972 34 Rolf Bjerkvig, P.D (1992), Spheroid culture in cancer research, 1th edition, Informa Healthcare 35 Rowinsky, E.K and Donehower R.C (1995), “Paclitaxel (Taxol)”, New England Journal of Medicine, 332 (15), pp 1004-1014 36 Ruddon, R.W (2007), Cancer Biology, 4thth edition, Oxford University Press 37 S., R., M C., and Wc E (2007), “Chromosomal passengers conducting cell division”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, (8), pp 798-812 38 Shen, J.-L., Man K.-M., et al (2010), “Honokiol and Magnolol as Multifunctional Antioxidative Molecules for Dermatologic Disorders”, Molecules, 15 (9), pp 6452-6465 39 Teicher, B.A (1997), Anticancer Drug Development Guide 40 Teicher, B.A (2001), Tumour Models in Cancer Research, Cancer Drug Discovery and Deverlopment, ed B.A Teicher, Human Press, New Jersey 41 Vader G., L.S (2008), “The aurora kinase family in cell division and cancer”, Biochimica et Biophysica Acta, 1786, pp 60-72 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 71 Luận văn cao học 42 Tài liệu tham khảo Vavilala, D.T., Ponnaluri V.K.C., Vadlapatla R.K., Pal D., Mitra A.K., and Mukherji M (2012), “Honokiol inhibits HIF pathway and hypoxia-induced expression of histone lysine demethylases”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 422 (3), pp 369-374 43 Wang, T.-H., Wang H.-S., and Soong Y.-K (2000), “Paclitaxel-induced cell death”, Cancer, 88 (11), pp 2619-2628 44 Wu, S.-N., Yeh C.-C., Huang H.-C., and Yang W.-H (2011), “Effects of Honokiol on Membrane Electroporation-Induced Inward Current in Pituitary Tumor (GH3) Cells ”, Journal of Natural Products, 4, pp 115-124 45 Wu, X., Chen X., and Hu Z (2003), “High-performance liquid chromatographic method for simultaneous determination of honokiol and magnolol in rat plasma”, Talanta, 59 (1), pp 115-121 46 Xu, H., Tang W., Du G., and Kokudo N (2011), “Targeting apoptosis pathways in cancer with magnolol and honokiol, bioactive constituents of the bark of Magnolia officinalis”, Drug Discoveries & Therapeutics, (5), pp 202-210 47 Zang, R., Li D., Tang I.-C., Wang J., and Yang S.-T (2012), “Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery”, International Journal of Biotechnologyfor WellnessIndustries, 1, pp 31-51 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm 72 ... Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN L? ??P TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L. ) Murr. , Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) ... chiết từ vỏ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, gọi Hậu phác bắc Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) cấu trúc phân tử hai đồng phân Honokiol Magnolol (phải)... hành nghiên cứu hoạt tính kháng u ba chất Honokiol, Magnolol đƣợc tách chiết từ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae Derrone đƣợc tách chiết từ Vông nem Erythrina orientalis L