Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất phân lập từ cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và cây Hậu phác (Magnolia officinalis R

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd Et Wils, Magnoliaceae) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH MINH HỌA vi BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Tổ ng quan về ung thƣ 1.1.1 Một số đặc điểm ung thƣ 1.1.2 Các giai đoạn phát triển ung thƣ 1.2 Các mô hình sàng lọc thuố c chố ng ung thƣ 1.2.1 Nuôi cấy quan 1.2.2 Nuôi cấy tế bào 1.2.3 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thƣ (multicellular tumor spheroid)………………… 10 1.2.4 Mơ hình in vivo 12 1.3 Mô ̣t số dòng tế bào ung thƣ 14 1.3.1 Dịng tế bào ung thƣ biểu mơ ruột kết ngƣời - HCT116 14 1.3.2 Dòng tế bào ung thƣ biểu mô cổ tử cung ngƣời - Hela 14 1.3.3 Dịng tế bào ung thƣ biểu mơ vú ngƣời - MCF7 15 1.3.4 Dòng tế bào ung thƣ vú ngƣời - KPL4 16 1.4 Chế phẩ m Honokiol, Magnolol, Derrone và thuố c Taxol 16 1.4.1 Honokiol (H) Magnolol (M) 16 1.4.2 Derrone (D) 19 1.4.3 Taxol (Paclitaxel) 20 1.5 Enzyme Aurora kinaza 22 CHƢƠNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Máy móc, dụng cụ 25 2.3 Hóa chất sử dụng 26 2.4 Phƣơng pháp hoạt hóa nhân ni dòng tế bào in vitro 27 2.5 Phƣơng pháp thử độc tính MTS 28 2.6 Phƣơng pháp thử độc tính mơ hình spheroid 30 2.7 Phƣơng pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kế t quả khảo sát đô ̣c tin ́ h của Honokiol , Magnolol và Derrone mô hình 2D…………… 33 3.1.1 Với dòng HCT116 33 3.1.2 Với dòng Hela 38 3.1.3 Với dòng MCF7 41 3.1.4 Với dòng KPL4 44 3.2 Kế t quả nghiên cƣ́u tác đô ̣ng của Honokiol mô hin ̀ h 3D khố i cầ u đa bào MCF7………… 51 3.2.1 Kết thí nghiệm theo dõi tăng trƣởng khối spheroid MCF7……………………… 51 3.2.2 Kết thí nghiệm kiểm tra tác động Honokiol lên trình tạo khối spheroid MCF7 54 3.2.3 Kết thí nghiệm kiểm tra tác động Honokiol lên tăng trƣởng khối spheroid MCF7 56 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Honokiol lên hệ vi sợi actin 59 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng Derrone lên phosphoryl hóa Histon H3 vị trí Serine 10 62 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Luận văn cao học Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Dụng cụ vật tư tiêu hao 25 Bảng 2: Thiết bị sử dụng 26 Bảng 3: Hóa chất sử dụng 26 Bảng 4: Dải nồng độ cuối thuốc thử giếng 28 Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol Taxol 35 Bảng 6: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol Taxol với dòng HCT116 38 Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol Taxol 39 Bảng 8: Giá trị IC50 Honokiol Taxol với dòng Hela 41 Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) MCF7 với Honokiol Taxol 43 Bảng 10: Giá trị IC50 Honokiol (H) Taxol với dòng TBUT MCF7 44 Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol 47 Bảng 12: Giá trị IC50 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC50 số tương quan R2 Honokiol, Magnolol, Derrone Taxol 50 Bảng 14:Thể tích khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau hạ giọt treo 52 Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol 58 Luận văn cao học Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Sáu đặc trưng ung thư Hình 2: Thận chuột sử dụng để sàng lọc thuốc Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy Hình 4: Mơ hình cấu trúc khối u invivo khối cầu đa bào ung thư 10 Hình 5: Dịng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết HCT116 người 14 Hình 6: TBUT vú MCF7 nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro 15 Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) cấu trúc phân tử hai đồng phân Honokiol Magnolol (phải) 16 Hình 8: Cơ chế tác động Honokiol (H) Magnolol (M) lên đường truyền tin dẫn đến apoptosis tế bào 18 Hình 9: Cây vơng nem Erythrina orientalis L., Fabaceae công thức cấu tạo Derrone 19 Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol 20 Hình 11: Cơ chế tác động Taxol lên tế bào gây apoptosis 22 Hình 12: Hình ảnh mô liên kết Taxol với vi sợi tubulin 22 Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza 24 Hình 14: Các dịng TBUT bảo quản bình đựng Nito lỏng 27 Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 33 Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) 10µg/mL (phải) (100x) 33 Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol nồng độ 5µg/mL (trái) 50µg/mL (phải) (100x) 34 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vi Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Honokiol (H) 36 Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Magnolol (M) 36 Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều HCT116 với Taxol 37 Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 38 Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol nồng độ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 38 Hình 24: Tế bào Hela ủ Taxol nồng độ 0,003 (trái), 0,3 (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 39 Hình 25: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Honokiol (H) 40 Hình 26: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều Hela với Taxol 40 Hình 27: Tế bào MCF7 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 41 Hình 28: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Honokiol nồng độ (trái); 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 29: Tế bào MCF7 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái), 0,3 (giữa), 30µg/mL (phải) (100x) 42 Hình 30: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Honokiol (H) 43 Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều MCF7 với Taxol 44 Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) ĐCDM (phải) (100x) 45 Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 45 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm vii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ (trái), 20 (giữa) 50µg/mL (phải) (100x) 45 Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ (trái) 20µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) 30µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Honokiol (H) 48 Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Magnolol (M) 48 Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Derrone (D) 49 Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều KPL4 với Taxol 49 Hình 41: Đồ thị biểu diễn tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể từ hạ giọt treo 52 Hình 42: Khối spheroid MCF7 25 ngày quan sát kể từ hạ giọt treo 53 Hình 43: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau (a) (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau (c) (d) ngày không tạo khối ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e) 55 Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo 56 Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 56 Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 57 Hình 47: Các khối spheroid tác động Honokiol trở nên lỏng lẻo mặt cấu trúc, tế bào bên ngồi bong tróc khỏi khối từ ngày thứ sau hạ giọt treo (400x) 57 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm viii Luận văn cao học Danh mục viế t tắ t Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích khối spheroid MCF7 ảnh hưởng Honokiol (H) 58 Hình 49: Ảnh hưởng Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào 60 Hình 50: Sự rối loạn phân bố F-actin tác động Honokiol NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ 60 Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol NĐ 20µg/mL 61 Hình 52: Sự biểu H3PS10 kỳ khác trình phân chia tế bào 64 Hình 53: So sánh biểu H3PS10 mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) mẫu đối chứng (a) 65 Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm ix Luận văn cao học Danh mục viết tắt BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ VIẾT TẮT ADN Acid deoxiribinucleic ARN Acid ribonucleic c-FLIP FLICE-like inhibitory protein D Derrone ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium FBS Huyết thai bê – Fetal bovine serum FLICE Caspase H Honokiol HCT116 Human colorectal carcinoma cell line HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line KHV Kính hiển vi KPL4 Human breast cancer cell line M Magnolol MCF7 Human breast adenocarcinoma cell line (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- MTS carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium) NĐ Nồng độ Nguyễn Thị Ngọc Ánh K19 Sinh học thực nghiệm x ... TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƢ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY... cứu hoạt tính kháng u ba chất Honokiol, Magnolol đƣợc tách chiết từ Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils, Magnoliaceae Derrone đƣợc tách chiết từ Vông nem Erythrina orientalis L Murr.,. .. hợp chất từ nguồn dƣợc liệu thiên nhiên có khả chữa ung thƣ là hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học thầy thuốc đầu tƣ tập trung nghiên cứu nhiều năm Trong xu hƣớng này, tiến hành nghiên cứu