Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4114054

MỞ ĐẦU Viêm là đáp ứng tự nhiên của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngoài như: tia tử ngoại, các chất phóng xạ, các chất hóa học và đặc biệt là các tác nhân g

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trịnh Tất Cường

Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

Trang

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 3 2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 3 2.1.1 Các chất kháng viêm 3

2.1.1.1 Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) 3 2.1.1.2.Các chất kha ́ ng viêm có bản chất steroid 4

2.1.2 Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm 5 2.1.3.Thụ thể họ toll-like và cơ chế kháng viêm 7 2.1.4.Tế bào marcrophage 12 2.1.5 Các mô hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro 13

2.1.5.1 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng gen ch ỉ thị luciferase có gắn

NF-κB (NF-κB dependent luciferase reporter assay)

13

2.1.5.2 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng thụ thể GR 15

2.1.5.3 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng thụ thể toll like (TLRs) 17

2.1.5.4.Mô hi ̀nh nghiên cứu viêm thực nghiê ̣m in vivo sử dụng

LPS

19

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

3 Cây nhọ nồi và cây ngải cứu 22

3.2 Cây ngải cứu 23

4 Vai trò Wedelolactone của cây nhọ nồi và một số hợp chất của ngải cứu

trong quá trình chống viêm

24

4.2 Một số hợp chất của cây ngải cứu 25 Chương 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.1.Động vật thí nghiệm 27

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1.Tách chiết macrophage từ tủy xương của chuột 27 2.2.2.Đánh giá hoạt tính độc tố của Wedelolactone tới khả năng

sống của BMDM bằng kít CCK-8

27

2.2.3 Đánh giá khả năng sản xuất cytokine bằng ELISA Kit 28

2.2 4 Phương pháp Western blot 31

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3 1 Khả năng sống của tế bào không bị ảnh hưởng bởi Wedelolactone 38 3.2 LPS kích thích tế bào BMDM sinh cytokine 39 3.3 Wedelolactone ức chế quá trình sinh cytokine thông qua thụ thể

Giải thích các chữ viết tắt

1 BMDM Bone Marrow-Derived Macrophage

2 ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Danh mục các hình trong luận văn

Hình 1 Cơ chế hoa ̣t đô ̣ng của thu ̣ thể Glucocorticoid trong tế bào 7 Hình 2 Mô hình cơ chế kháng viêm của Glucocorticoid 7 Hình 3 Cơ chế hoạt động của một số TLR 10 Hình 4 Biểu hiê ̣n của các TLR ở các tế bào ba ̣ch cầu 12 Hình 5 Mô hình sàng lọc sử dụng gen thông báo luciferase có gắn NF -

Hình 18 LPS kích thích quá trình phospho hóa của p47phox trong

BMDM

44

Hình 19 Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho hóa của p47phox 45 Hình 20 Dầu ngải cứu không gây độc đối với tế bào BMDM 46 Hình 21 Tinh dầu ngải cứu không có khả năng ức chế quá trình sinh

cytokine tiền viêm trong BMDM đƣợc kích thích bằng LPS

47

MỞ ĐẦU

Viêm là đáp ứng tự nhiên của cơ thể để chống lại các tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngoài như: tia tử ngoại, các chất phóng xạ, các chất hóa học và đặc biệt là các tác nhân gây bệnh Kết quả của viêm là loại bỏ hoặc triệt tiêu hoàn toàn các điều kiện sinh ra nó Như vậy, viêm là đáp ứng có lợi cho cơ thể Tuy nhiên, nếu thời gian tồn tại quá lâu thì viêm sẽ chuyển từ giai đoạn cấp tính sang mãn tính

và gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể Những tác động do viêm mãn tính mang lại phải kể đến như: gây rối loạn quá trình chuyển hóa, trao đổi chất, ảnh hưởng đến hoạt động của các cơ quan, thậm chí nếu để nặng hơn có thể dẫn đến suy giảm chức năng của thận, gan…

Do vậy, điều trị và làm giảm bớt tác động bất lợi của viêm đối với cơ thể là vấn đề hết sức quan trọng hiện nay, đặc biệt là trong quá trình điều trị bệnh Các thuốc kháng viêm trên thị trường mà phổ biến là Dexamethasone, các chất có nguồn gốc là cortiocoid, chủ yếu là các thuốc tổng hợp hóa học Các loại thuốc này tuy có tác động nhanh song cũng tiềm tàng các khả năng gây độc cho cơ thể và có thể gây nên những tác dụng phụ không mong muốn Sử dụng thuốc kháng viêm có nguồn gốc thực vật có thể giải quyết những lo ngại trên với ưu điểm là an toàn, hiệu quả lâu dài và giá thành thấp

Cho đến nay, việc tìm kiếm các chất chống viêm mới có nguồn gốc từ thực vật đang được quan tâm bởi những hiệu quả của nó Gần đây, tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã xây dựng mô hình để sàng lọc và đánh giá khả năng chất chống viêm trên cả

mô hình in vitro và in vivo Với mô hình này, Wedelolactone từ cây nhọ nồi đã được tách chiết và bước đầu khẳng định được khả năng chống viêm

Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiềm năng của Wedelolactone, cũng như trên mô hình sàng lọc chất chống viêm mới này, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm ở mức in vitro Ngoài ra, chúng tôi cũng

tiếp túc đánh giá khả năng chống viêm của cây ngải cứu qua mô hình này Từ những kết quả có được này sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng là làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm có nguồn gốc từ thực vật góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng Xuất phát từ cơ sở khoa học thực

tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng chống viêm của cây

nhọ nồi và ngải cứu thông qua thụ thể TLR4”

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu đề tài

Nội dung nghiên cứu

1 Đánh giá khả năng điều hòa của Wedelolactone và tinh dầu ngải cứu trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của TLR4,

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Khái niệm viêm

Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ thể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay

là những tế bào bị hỏng Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra , nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến ổ viêm như các loại tế bào di chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân , đa nhân, các tế bào lympho , tiểu cầu, tế bào nội mạc… Các tế bào này giải phóng ra hàng loa ̣t các chất trung gi an, phần lớn

là các chất p rostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) và interleukin-1 Các chất này lại tiếp tục hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme “dọn dẹp” chủ yếu phân giải protein như các proteinase , các interleukin , TNF-α, các superoxide , H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô , qua đó khép kín quá trình viêm ma ̣n tính Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết ra làm hẹp dòng chảy củ a máu dẫn tới bị sưng Khi quá trình viêm kéo dài s ẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chi ếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [37]

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Các chất kháng viêm

Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:

2.1.1.1 Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)

Đại diê ̣n cho nhóm này là aspirin , ibuprofen và naproxen Cơ chế kháng viêm của NSAID đư ợc phát hiện là do chúng ức chế sự tổng hợp prostaglandins (PG) Đích tác du ̣ng được biết rõ nhất của các chất này là cyclooxygenase (COX), là enzym có vai trò chuyển hóa axit ar achidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX) Một số chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) lại

có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày dạ dày Nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID) này có tác du ̣ng ức chế sự hình thành prostaglandins (PG) ở màng nhày dạ dày Tuy nhiên, salysilate, mô ̣t chất kháng viêm thuô ̣c nhóm này cũng có tác du ̣ng

ức chế sự sinh tổng hợp của prostaglandins (PG) nhưng la ̣i không làm bào m òn màng nhày dạ dày như aspirin Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là vấn đề chưa giải thích được [42]

2.1.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid

Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane Thuộc về nhóm chất này có các chất corticoid Chúng tác dụng thông qua ức chế enzyme phospholipases A2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A 2 thành axit arachidonic Như vâ ̣y, cuối cùng thì corticoid cũng ức chế sự sinh tổng

hơ ̣p của prostaglandins (PG), thromboxane và leukotrienes Các chất kháng viêm có bản chất stero id ức chế phospholipase A 2 mô ̣t cách gián tiếp thông qua viê ̣c giải phóng các chất ức chế protein có tên go ̣i là macrocortin , lipomodulin hay renocortin

có khối lượng phân tử đạt khoảng 15, 30 và 40 kDa Đa ̣i diê ̣n nhóm chất này là lipocortin đã được tinh sa ̣ch , thương ma ̣i và được xem là mô ̣t trong những chấ t kháng viêm mạnh [42] Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thụ thể glucocorticoid

2.1.1.3 Các chất khác

Thuộc về nhóm này có vàng và colchicine Trong trường hợp của colchichine , chất này ức chế sự hì nh thành tinh thể urate trong khớp của bê ̣nh nhân gout thông qua viê ̣c làm giảm sự tiết các chất chemotaxis của ba ̣ch cầu đa nhân và giải phóng enzyme lysosom Colchicine có tác du ̣ng ức chế đă ̣c hiê ̣u sự giải phóng mô ̣t

glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da Đây là mô ̣t chất chemotaxis của ba ̣ch cầu đa nhân đối với các ba ̣ch cầu trung tính và monocytes có khả năng thực bào các thể urate [42]

2.1.2 Thụ thể glucocorticoid (GR) và cơ chế kháng viêm

Các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors – PRRs), bao gồm các thụ thể toll-like, lectin và dectin-1 chi phối khả năng sống sót của vật chủ bằng việc nhận dạng những phân tử mầm bệnh (pathogen-associated molecular patterns - PAMPs) ở vi khuẩn, virus và nấm Sau khi nhận dạng mầm bệnh, các thụ thể sẽ truyền tín hiệu vào tế bào và kích thích tế bào ti ết ra các chất trung gian (mediator) như cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, thậm chí ta ̣o mi ễn dịch đáp ứng ban đầu [24, 12] Bên cạnh các thụ thể PRRs như đã trình bày ở trên , Schäcke và cộng sự (2009) đã phát hiê ̣n ra loa ̣i th ụ thể khác là glucocorticoid có khả năng kìm

hãm các yếu tố sinh ra quá trình viêm bằng cách liên kết vào Acid Deoxyribo

Nucleic (AND) trong nhân tế bào [38]

Glucocorticoid (GC) tự nhiên là hormon do tuyến thượng thận sản xuất, gồm hai chất là hydrocortison và cortison, có vai trò quan trọng trong điều hòa chuyển hóa các chất Glucocorticoid hoạt động theo cơ chế liên kết với thụ thể gluc ocorticoid (GR) Thụ thể glucocorticoid (GR) là một thành viên của siêu họ thụ thể trong nhân

tế bào [38] Thụ thể glucocorticoid có thể được phân chia thành 3 đoạn chính: thứ nhất là đoạn cuối đầu N kích hoạt phiên mã , thứ hai là đoạn liên kết Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trung tâm và thứ ba là đoạn cuối đầu C liên kết với phối

tử (ligand) [26] Các phối tử đặc hiệu liên kết thụ thể glucocorticoid bằng cách xuyên qua màng plasma của tế bào Khi thụ thể glucocorticoid đã được hoạt động nhờ liên kết với phối tử đặc hiệu, nó sẽ thay đổi hình dạng và chuyển tới định vị

trên Acid Deoxyribo Nucleic (AND) của nhân tế bào và điều khiển quá trình biểu hiện của các gen đích Ở trạng thái chưa gắn kết với phối tử, thụ thể glucocorticoid bất hoạt nằm ở tế bào chất có ch ứa các protein shock nhiệt 90, 70, 50 Sau khi liên kết với phối tử đặc hiệu, thụ thể glucocorticoid được kích hoạt sẽ thay đổi hình dạng, tách ra khỏi những protein shock nhiệt và tương tác trực tiếp với các vị trí trên chuỗi Acid Deoxyribo Nucleic (AND) trong nhân tế bào bao gồm các y ếu tố phản ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong vùng promoter của những gen đích, hoặc những yếu tố (factor) phiên mã khác thông qua các tương tác protein với protein, giữa thụ thể glucocorticoid và nhân tố phiên mã AP -1 (activator protein 1) hoặc giữa thụ thể glucocorticoid với tổ hơ ̣p protein kiểm soát phiên mã của Acid Deoxyribo Nucleic (AND) là NF -КB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) (Hình 1)

Glucocorticoid thực hiện vai trò cơ bản trong quá trình điều hòa trạng thái cân bằng nội sinh của cơ thể sống Chúng cần thiết để duy trì rất nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, chẳng hạn trạng thái cân bằng nội sinh của trung tâm thần kinh và

hệ thống tim mạch, quá trình phản ứng miễn dịch và quá trình viêm nhiễm Glucocorticoid đóng vai trò như là các chất ức chế miễn dịch và kháng viêm đặc trưng không thay thế với nhiều bệnh viêm nhiễm, mẫn cảm miễn dịch, dị ứng và liên quan đến quá trình phát triển của tế bào lympho, ví dụ bệnh th ấp khớp… Mặc

dù Glucocorticoid tổng hợp là những đại diện có tiềm năng nhất về chống viêm nhưng khi sử dụng chúng lại sinh ra những phản ứng phụ không có lợi cho cơ thể Để khắc phu ̣c vấn đề này , cấu trúc của đoạn liên kết với ph ối tử của thụ thể glucocorticoid được xác đi ̣nh và c ấu trúc của phối tử đươ ̣c cải biến đ ể làm thay đ ổi hình dạng cuối cùng của phức hơ ̣p thụ thể glucocorticoid - phối tử Điều này đã đem lại thành công như trong trườ ng hơ ̣p các ph ối tử của thụ thể oestrogen Phối tử này giúp thụ thể glucocorticoid vẫn giữ được hoạt tính kháng viêm nhưng lại giảm đi khả năng gây hiệu ứng phụ Hướ ng nghiên cứu này đã mở ra kh ả năng phát triển được nhiều hợp chất chống viêm hi ệu quả từ các Glucocorticoid tổng hợp trong tương lai [15]

Hình 2: Mô hình cơ chế kháng viêm của thụ thể glucocorticoid [33]

Theo các tác giả này thì thụ thể glucocorticoid trong tế bào chất sau khi đươ ̣c kích hoạt bởi glucocorticoid sẽ di chuyển vào nhân Ở đây chúng liên k ết với các yếu tố phản ứng Glucocorticoid (glucocorticoid response element-GREs) trong các gen đích đáp ứng steroid, dẫn tới làm tăng quá trình phiên mã Tuy nhiên, thụ thể glucocorticoid lại làm gi ảm quá trình phiên mã c ủa những gen tham gia vào quá trình gây viêm và những gen không có vị trí GRE (glucocorticoid response element) trong các vùng promoter của chúng Khi hoạt động, thụ thể glucocorticoid có thể liên kết với NF-КB đã được kích hoạt và ngăn cản nó không gắn vào các vị trí kB ở những gen tham gia vào quá trình viêm Quá trình tương tác này có th ể xảy ra trong tế bào chất hoặc ở trong nhân Cụ thể là glucocorticoid làm tăng quá trình phiên mã

của gen IКBα mã hóa cho chất ức chế IkBa (NF-kappa-B inhibitor alpha) dẫn tới

quá trình thay đổi hình dạng của protein liên kết với NF-КB Protein IkBa kappa-B inhibitor alpha) kích thích quá trình tách rời của NF-КB trong phức hệ NF-

(NF-КB dẫn tới NF-(NF-КB tách rời khỏi phức hê ̣ và di chuyển từ tế bào chất vào nhân Những NF-КB bị tách ra khỏi phức hệ này sẽ bị thụ thể glucocorticoid bắt cặp và cản trở liên kết vớ i các đo ạn gen gây viêm Các kết quả thu đươ ̣c là rất có giá tr ị trong viê ̣c tìm ra nh ững phối tử thụ thể glucocorticoid tổng hợp và tự nhiên từ thực vật có tính kháng viêm ưu viê ̣t hơn các thuốc glucocorticoid đã tìm thấy trước đó Điều này đã được khẳng định trong các nghiên cứu của Schäcke và cộng sự [38] Sử

dụng mô hình sàng lọc in vitro theo cơ chế hoạt hóa hay ức chế thụ thể

glucocorticoid và mô hình gây viêm in vivo trên chuột NMRI để theo dõi các phản ứng phụ đặc trưng của thụ th ể glucocorticoid cũng như động dược học (pharmacokinetic) của chất tiềm năng , các tác giả đã phát hiện thấy chất ZK

245186, một chất ức chế cho ̣n lo ̣c thụ thể glucocorticoid mới không có bản chất steroid đang trong giai đoa ̣n thử nghiê ̣m cho xử lý viêm bề mă ̣t , thể hiê ̣n hoa ̣t tính kháng viêm ưu việt nhất hiện nay

2.1.3.Thụ thể họ toll-like va ̀ cơ chế kháng viêm

Đáp ứng ban đầu hay đáp ứng bẩm sinh với quá trình viêm gây ra bởi các mầm bệnh là đáp ứng không đặc hiệu của quá trình bảo vệ vật chủ Năm 1996, Toll đã phát hiện ra protein c ủa ruồi dấm Drosophila và nhâ ̣n thấy r ằng protein này không chỉ đòi hỏi trong sự phát triển của phôi đối với ruồi mà còn đáp ứng hiệu quả chống lại nấm [30] Từ khám phá này, các nghiên cứu đã phát hiện và hiểu rõ được chức năng của các protein có tên go ̣i toll trong quá trình đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Ở chuột có 12 loại thụ thể toll go ̣i là toll like receptors (TLR) được phân loại thành TLR1- TLR12, ở người thì chỉ có 11 loại TLR TLR là protein màng loại I được biểu hiện trong các tế bào miễn dịch tham gia đáp ứng ở giai đoạn đầu tiên của vật chủ đối với mầm bệnh bao gồm các đại thực bào (macrophage), tế bào tua, tế bào da

và bạch cầu trung tính Lớp thụ thể này được gọi là các thụ thể nhận dạng mẫu mầm bệnh (PRR) Chúng có khả năng nhận dạng rất phong phú t ừ protozoa tới vi khuẩn, nấm và virus Đây là các thu ̣ thể nhâ ̣n biết quan tro ̣ng nhất các sản phẩm của vi sinh

vâ ̣t Các vùng ngoại bào của T LR chứa các motif giàu leucin (LRR) lă ̣p đi lă ̣p la ̣i tạo dạng đế ngựa có thể nhận biết các LPS của vi khuẩn gram (-), peptidoglican của

vi khuẩn gram (+), các lipoprotein, pipopeptide, roi (flagellin)…của vi khuẩn TLR phát hiện các mầm bệnh bằng liên kết với các phân tử mẫu ở vi sinh vật (PAMPs) Lớp thụ thể này, sau khi nhận dạng ra mầm bệnh sẽ truyền tín hiệu vào bên trong tế

bào Khi đã được nhâ ̣n biết , các LRR của TLR khơi mào hàng loạt chuỗi các chuyển hóa , ví dụ LP S hoa ̣t hóa TLR 4, oligoderoxynucleotide vi khuẩn hoa ̣t hóa TLR9… và kích hoạt sản xuất các cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, interferon, quá trình phosphoryl hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase (mitogen-activated protein kinases-MAPKs), hay phản ứng oxi hóa [31] Bên cạnh đó, TLR còn tham gia vào quá trình kích thích ban đ ầu các lớp tín hiệu trong các tế bào để phát triển miễn dịch đáp ứng nên được xem như là các thành viên kích thích viêm Trong số này , TLR4 tham gia hoạt động trong hệ thống miễn dịch cảm ứng bằng lipopolysccharides vi khuẩn (LPS) thông qua nhận dạng đặc hiệu những phân

tử ngoại độc tố (lipid A) Đây là một yếu tố cơ b ản trong đáp ứng miễn dịch với vi khuẩn gram âm Quá trình hoạt động đầy đủ của TLR truyền tín hiệu đòi hỏi sự hợp tác hoạt động của một vài adapter tín hiệu, bao gồm MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88) và những adaptor của MyD88, chẳng hạn như các tín hiệu của TLR2 phụ thuộc hoàn toàn vào MyD88(myeloid differentiation primary response protein 88), hay TLR4 phụ thuộc vào đoạn protein

có chứa MyD88/TIR (TIRAP) hoặc đoạn thụ thể toll/IL-1 có chứa một adapter kích thích sinh interfron (TRAM) để tạo ra những đáp ứng phân biệt [32] (Hình 3)

Hình 3 Cơ chế hoạt động của một số TLR [30]

Tín hiệu TLR không thích hợp hoặc không kiểm soát được sẽ làm ảnh hưởng xấu tớ i sinh lý m ầm bệnh của nhiều bệnh bao gồm: bệnh nhiễm trùng, các bệnh

viêm loét đại tràng, hội chứng mẫn cảm miễn dịch hay bệnh hủi Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như những điều kiện lâm sàng gây ra b ởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân với quá trình nhiễm trùng, được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [16] Các n ỗ lực nhằm đi ều trị kháng viêm (kháng LPS, kháng cytokine) và kháng đông tụ trong nhiều năm qua đều không mang la ̣i hiệu quả bởi lẽ các liệu pháp này b ị giới hạn bởi tính kháng nhi ễm và viê ̣c chăm sóc h ỗ trợ không được xử lý dưới góc độ mầm bệnh về mặt sinh lý học Các nghiên cứu chu ẩn đoán cho thấy nhi ễm trùng gram âm chiếm khoảng 60% trong tổng số các trường hợp và LPS là chất truyền đi ban đầu kích thích đáp ứng tăng cường viêm thông qua hệ thống miễn dịch Ngoài ra , Bhattacharjee và Akira (2005) cũng chứng minh được

TLR4 là thụ thể nhận dạng đặc hiê ̣u LPS với bằng chứng là các vi khu ẩn đột biến

LPS không bộc lộ hoặc các động vật thiếu TLR4 không pháp triển choáng nhiễm khuẩn trong quá trình đáp ứng với LPS [10] Vớ i phát hiê ̣n này, các nhà nghiên cứu

hy vo ̣ng rằng viê ̣c điều tri ̣ bê ̣nh nhiễm trùng vi khuẩn có thể được cải thiê ̣n nhờ cách can thiê ̣p vào con đường tín hiệu TLR, cụ thể là TLR4 Chất ức chế phân tử liên kết với TLR4 là MD-2 được xem như một đại diện chống viêm đã có m ặt trong danh sách của các thuốc tiềm năng Bên ca ̣nh đó, viê ̣c phát hiê ̣n thấy LPS là phối tử đă ̣c hiê ̣u của TLR4 cũng giúp định ra hướng nghiên cứu mới về đi ều trị nhiễm trùng sử dụng mô hình chuột gây nhiễm trù ng bởi LPS Đây là hướng nghiên cứu rất có triển vọng trong việc tìm ra đư ợc các chất có khả năng kìm hãm quá trình sinh ra các yếu

tố gây viêm [10] Chính vì thế , trong số các TLR đươ ̣c phát hiê ̣n thì TLR 4 được quan tâm nghiên cứ u nhiều nhất

TLR4 được nhận dạng đầu tiên và chứng minh chức năng thông qua nghiên cứu với chuột C3H/HeJ và C57BL/10ScCr kháng LPS [31] Các nghiên cứu ở chuột đột biến đã chứ ng minh vai trò c ủa TLR4 trong quá trình bảo vệ chống lại nội độc tố trong máu [22] Chuột bị đột biến TLR4 có tính nhạy cảm v ới quá trình nhiễm vi khuẩn gram âm hệ thống so vớ i đối chứng [43] vì quá trình hoạt động của TLR4 là rất cần thiết để ta ̣o mi ễn dịch bảo vệ chống lại quá trình viêm cũng như truyền các tín hiệu viêm nhiễm ngoại độc tố hệ thống mô ̣t cách hiệu quả Hàng loạt các nghiên

cứu về các mầm bệnh vi khuẩn gram âm bao g ồm Neisseria meningitides, E coli,

Haemophilus influenzae, Kleb-siella pneumoniae và Brucella abortus, S pneumoniae và Mycobacteria tuberculosis trên mô hình chuột bị nhiễm khuẩn đã

chứng minh vai trò quan trọng c ủa TLR4 [39] TLR4 cũng có thể nhận dạng đươ ̣c một số loại virus trong quá trình viêm bao gồm virus syncytial [28], các retrovirus ở chuột, virus gây u động vật có vú và gây ung thư máu ở chuô ̣t (murine leukemia virus) [36] Vai trò của TLR4 trong các bệnh lây nhiễm ở người đã được chứng minh thông qua các nghiên cứu về tính đa hình biểu hiê ̣n của TLR 4 trong các bệnh lây nhiễm tế bào, bệnh lây nhiễm, nhiễm trùng, quá trình lây nhiễm gram hoặc các

vi khuẩn khác như vi khuẩn lao hay sốt rét [20, 25, 41]

2.1.4.Tế ba ̀o marcrophage

Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các t ế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên quan đến m ột số tình trạng bệnh lý do miễn dịch Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh sinh của các hội chứng này Các cytokine chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố hoại tử khối u α (Tumor Necrosis Factor α - TNF α), IL-6, IL-8, IL-12, interferon (IFN)-γ, nitric oxide (NO) và các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm Như

vâ ̣y, viê ̣c kiểm soát sản xuất các chất này có thể làm giảm khả năng viêm Macrophage là tế bào có kích thước tương đối lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm ta ̣o ra bởi LPS Ngoài ra, các TLR ở macrophage được biểu hiê ̣n mạnh hơn so với các tế bào ba ̣ch cầu khác (Hình 4) nên nó thường được l ựa

chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm in vitro của chất

quan tâm [48]

Hình 4 Biểu hiê ̣n của các TLR ở các tế bào bạch cầu [47]

2.1.5 Các mô hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro

Việc sàng lo ̣c các chất có hoa ̣t tính sinh ho ̣c thường được bắt đầu với mô hình in

vitro Hê ̣ thống in vitro cho phép sàng lo ̣c nhanh , hiê ̣u quả, đơn giản và ít tốn kém hơn nhiều so với sử du ̣ng mô hình sàng lo ̣c in vivo Ví dụ sử dụng mô hình sàng lọc chất kháng viêm in vitro sẽ rút ngắn thời gian sàng lọc xuống tới hơn 10 lần mà

không phải sử du ̣ng đô ̣ng vâ ̣t thực nghiê ̣m vì qui đi ̣nh về đa ̣o đức đối với các nghiên cứu hiê ̣n nay ở các nước phát triển là phải giảm tối đa tới mức có thể viê ̣c sử du ̣ng

đô ̣ng vâ ̣t thực nghiê ̣m Hiê ̣n nay, để sàng lọc các chất chống viêm , các phòng thí nghiệm trên thế giới sử du ̣ng chủ yếu các mô hình in vitro với tế bào macrophage

2.1.5.1 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng gen ch ỉ thị luciferase có gắn NF -κB (NF-κB dependent luciferase reporter assay)

NF-κB là nhân tố phiên mã phản ứ ng nhanh ("rapid-acting" primary transcription factors) có vai trò chính trong sản xuất các cytokine tiền viêm và các chất trung gian, do đó đóng vai trò quan tro ̣ng trong điều hòa đáp ứng tế bào NF-κB là tác nhân đáp ứng đầu tiên khi tế bào bi ̣ kích thích Các chất kích thích hoạt động của NF-κB gồm rất nhiều yếu tố , ví dụ như các gốc oxi hoạt động (ROS), TNFα, interleukin 1-beta (IL-1β), lipopolysaccharide vi khuẩn (LPS), isoproterenol, cocaine và sự ion hóa NF-κB kiểm soát nhiều gen tham gia vào quá trình viêm nên không có gì nga ̣c nhiên khi nó đóng vai trò chính trong rất nhiều bê ̣nh viêm như :

Macrophage Granulocyte

viêm co thắt ruô ̣t (inflammatory bowel disease ), khớp, nhiễm trùng, hen Cùng khởi

đô ̣ng với NF -κB còn có AP-1 (activation Protein-1) điều khiển phiên mã các gen tiền viêm dưới sự kích thích của TLR AP-1(activation Protein-1) liên quan đến con đường tín hiê ̣u MAPK điều khiển sản xuất ra các TNF -α, IL-1, IL-6, IL-12, NO và

PG Vì NF-κB là chìa khóa trong quá trình đáp ứng viêm nên ức chế tín hiệu NF -κB

là liệu pháp có triển vọng trong điều trị các b ệnh về viêm Ví dụ như các thuốc disulfiram, olmesartan và dithiocarbamates đang bán trên thi ̣ trường Rất nhiều các chất tự nhiên được biế t có hoa ̣t tính chống ung thư và chống viêm đều thể hiê ̣n khả năng ức chế NF -κB Vì thế, các dịch chiết từ thực vật có thể là nguồn cung cấp các chất ức chế của NF -κB hiê ̣u quả [33] Trong mô hình sàng lo ̣c sử du ̣ng gen chỉ thị luciferase có gắn NF -κB, tế bào marcrophage của chuô ̣t được chuy ển nhiễm (transfected) vớ i gen mã hóa luciferase có gắn trung tâm liên kết NF -κB Viê ̣c gắn gen thông báo luciferase cho phép xác đi ̣nh được mức đô ̣ biểu hiê ̣n gen t hông qua viê ̣c đo hoa ̣t đô ̣ enzyme luciferase khi có mă ̣t cơ chất luciferin để ta ̣o thành sản phẩm phát quang có thể đo được b ằng huỳnh quang kế (luminator) Khi chất nghiên cứu có tác du ̣ng ức chế biểu hiê ̣n của NF -κB, nó sẽ làm giảm hoạt độ của enzyme luciferase Sử du ̣ng mô hình này , Chao và Lin (2010) đã sàng lo ̣c và phát hiê ̣n thấy

8 chất từ di ̣ch chiết ethyl acetate của thực vâ ̣t Andrographis paniculata có khả năng

chống viêm [14] Trong số này, chất andrograpanin thể hiê ̣n cả tính kháng viêm và chống nhiễm trùng thông qua ức chế biểu hiện của gen luciferase phụ thuộc NF-κB (NF-κB-dependent luciferase gen expression ) Kết quả là mức đô ̣ giải phóng các chất trung gian TNF-α, IL-6, macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2), oxit nito

(NO) bị giảm đi Đi sâu nghiên cứ u cơ chế kháng viêm, các tác giả đã phát hiện chất này đã làm giảm sự sinh các oxit nito nội sinh (iNOS) đươ ̣c cảm ứng bởi LPS và tăng cường cảm ứng ở con đường tín hiệu ERK 1/2 và PI3K cũng như tăng cường viê ̣c gắn của oligonucleotide NF -κB vào protein nhân thông qua con đường tín hiê ̣u ERK1/2 hay PI3/AKt Phải nói rằng , sàng lọc sử dụng gen chỉ thị luciferase có gắn NF-κB là phương pháp rất ưu viê ̣t và đươ ̣c mô ̣t số phòng thí nghiê ̣m trên thế giới sử dụng Tuy nhiên , do điều kiê ̣n trang thiết bi ̣ của phòng thí nghiê ̣m Viê ̣t Nam hiê ̣n

nay chưa cho phép đo được mức đô ̣ biểu hiê ̣n gen NF-κB sử du ̣ng máy luminat or nên ta ̣i thời điểm hiê ̣n ta ̣i, chúng tôi chưa tiến hành triển khai mô hình sàng lọc này

Hình 5 Mô hình sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng gen thông báo luciferase có gắn NF-κB

Đối tượng nghiên cứu tách lấy tế bào Macrophage Sau đó bổ sung LPS, chuyển gen luciferase, bổ sung thêm dịch chiết thực vật hoặc chất nghiên cứu Nghiên cứu khả năng ức chế biểu hiện gen luciferase ta thu được dịch chiết tiềm năng hoặc chất tiềm năng

2.1.5.2 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng thụ thể glucocorticoid

Đặc tính hóa học của các loại thuốc điều tri ̣ viêm mới đặc hiệu thông qua thụ thể glucocorticoid đã chứ ng minh hiệu quả ức chế chọn lọc các yếu tố phiên mã gen điều khiển GRE (glucocorticoid response element) và hạn chế được một số hiệu ứng phụ của thuốc Những chất có kh ả năng kìm hãm quá trình phiên mã như vâ ̣y đư ợc gọi là các phối tử chọn lọc của thụ thể glucocorticoid (selective glucocorticoid receptor adaptors-SEGRAs) [40], ví dụ như hydrocortisone , prednisolone, methyl predniso, dexamethasone, betamethasone Hướ ng nghiên cứu này đã đươ ̣c Jo và

cô ̣ng sự ở Đa ̣i ho ̣c Chungnam , Hàn Quốc rất quan tâm Nhóm nghiên cứu đã ch ứng minh được chất Compound K chi ết xuất từ sâm của Hàn Quốc là một phối tử của thụ thể glucocorticoid thông qua mô hình sàng lo ̣c thụ thể glucocorticoid [46] Gần đây, nhóm nghiên cứu của Elewaut (2009) đã phát hiê ̣n m ột chất tự nhiên khác có tên là Compound A (CpdA) tách từ cây Salsola ở Namibia có tính chất SEGRs (selective glucocorticoid receptor) bằng việc s ử dụng mô hình sàng lọc thụ thể

Tế bào macrophage LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

Ưc chế biểu hiện gen luciferase phụ thuộc NF-κB

- Dịch chiết tiềm năng

- Chất tiềm năng

Marcrophage mang gen luciferase phụ thuộc NF-κB

Tế bào macrophage LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

Ưc chế biểu hiện gen luciferase phụ thuộc NF-κB

- Dịch chiết tiềm năng

- Chất tiềm năng

Marcrophage mang gen luciferase phụ thuộc NF-κB

glucocorticoid in vitro và in vivo So sánh hiệu quả của Compound A và

dexamethasone đã cho th ấy dexamethasone vẫn dẫn tới tăng đường huyết và tăng insulin trong khi đó Compound A không kích thích gây ra các hi ện tượng này Chính việc phát hiện Compound A đã mở ra một hướng đi mới trong việc sử dụng các phối tử của thụ thể glucocorticoid từ các chiết xuất thực vật để điều tri ̣ các b ệnh viêm nhiễm mà không gây ra các phản ứng phụ [19] Trong mô hình sàng lo ̣c chất

kháng viêm in vitro sử du ̣ng thụ thể glucocorticoid, thụ thể glucocorticoid trên tế

bào macrophage, sau khi đươ ̣c gây ức chế hoa ̣t đô ̣ng bởi chất ức chế đă ̣c hiê ̣u , thì tế bào sẽ được g ây cảm ứng viêm bằng LPS và xử lý với các chất nghiên cứu Hàm lươ ̣ng các chất trung gian được giải phóng ra trong quá trình viêm (TNF-α, IL-6, IL-10) bị ức chế sẽ gợi ý khả năng dịch chiết nghiên cứu có chứa phối tử của thụ thể glucocorticoid (chất chống viêm tiềm năng ) Để khẳng định điều này , các tế bào macrophage mang gen GR-siRNA (glucocorticoid receptor-Small interfering RNA)

sẽ được sử dụng để sàng lọc thứ cấp Nếu kết quả nhâ ̣n được là tương tự với kết quả sàng lọc ban đầu thì có thể khẳng định chắc chắn phối tử của thụ thể glucocorticoid

có mặt trong dịch chiết nghiên cứu và cơ chế kháng viêm của nó là ức chế hoạt động của thụ thể glucocorticoid thông qua ức chế NF-κB di chuyển vào nhân t ế bào

LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

Đo mức độ ức chế chất

Có thể là phối tử của GR trong mẫu nghiên cứu

Ức chế biểu hiện gene GR-siRNA trong macrophage

Marcrophage có

GR bị ức chế

Chất ức chế

GR RU486

Tế bào macrophage

LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

Đo mức độ ức chế chất

Có thể là phối tử của GR trong mẫu nghiên cứu

Ức chế biểu hiện gene GR-siRNA trong macrophage

Marcrophage có

GR bị ức chế

Chất ức chế

GR RU486

Hình 6 Mô hình sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể glucocorticoid (GR)

Động vật nghiên cứu tách lấy tế bào Macrophage, bổ sung chất ức chế GR RU486 Sau đó bổ sung thêm LPS và dịch chiết thực vật hoặc chất nghiên cứu Đo mức độ ức chế thông qua chất trung gian giải phóng ra Từ kết quả có thể khẳng định có phối tử GR trong mẫu nghiên cứu Ức chế biểu hiện gene GR-siRNA trong Macrophage từ đó khẳng định phối tử GR có trong mẫu nghiên cứu

2.1.5.3 Mô hi ̀nh sàng lọc sử dụng thụ thể toll like (TLRs)

Kể từ khi TLR của động vật có vú được chứng minh là những yếu tố kích thích

cơ bản của hệ thống miễn dịch bẩm sinh thì viê ̣c khám phá ra nh ững mầm bệnh vi sinh vật được thực hiê ̣n thông qua các thu ̣ thể này TLR TLR có thể nhận dạng một phổ rộng các vi sinh vật và nhanh chóng sản xuất ra các chemokine, cytokine, interferon và phản ứng oxy hóa kháng lại vi sinh vật để bảo vệ vật chủ chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh Hơn nữa, tín hiệu TLR có thể k ết nối được v ới nhiều bệnh khác nhau Các nhà nghiên cứu hy v ọng rằng các ki ến thức sinh học về TLR

sẽ cho phép thiết kế những liệu pháp điều trị viêm mới, mang lại hiệu quả trong điều trị bệnh Nhiều công ty dược phẩm và phòng thí nghiệm đã tổng hợp đươ ̣c những phân t ử nhỏ, là những chất ức chế hoặc là phối tử đặc hiệu của TLR, chẳng hạn như CpG 7909, imiquimod, resiquimod hay chloroquine [10] và đã chứng minh đươ ̣c chúng rất an toàn khi sử dụng cho con người Đặc biệt, CpG đã được sử du ̣ng thử nghiệm làm tá dược vacxin cho rất nhiều bệnh của người Điều thú vi ̣ là dựa vào những tín hiệu của thụ thể TLR4, một số hợp chất từ thực vật cũng đ ã được chứng minh có khả năng điều hòa đáp ứng viêm và điều trị hiệu quả chuột bị nhiễm khuẩn nặng và choáng nhiễm trùng Ví dụ các ch ất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như

Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) [17,46], hay arctiin từ Forsythia suspensa [29] là

những chất đã đư ợc công bố có khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phospho hóa MAPK (mitogen-activated protein kinase), phản ứng oxy hóa

sinh ROS thông qua tín hiệu của thụ thể TLR4 Các dịch chiết của Amaranthus sp,

Eryngium campestre, Thymus pulegioides và Reichardia picroides cũng đã được

đánh giá là có kh ả năng kháng viêm thông qua họ thụ thể TLRs sử du ̣ng mô hình

nghiên cứu kháng viêm TLR 4 in vitro [35] Trong mô ̣t nghiên cứu tương tự , dịch chiết thực vâ ̣t Angelica sinensis cũng đã được chứng minh là có kh ả năng ức chế

sinh protein-2 (MIP-2) và nitric oxide (NO) [14] hay acid rosmarinic chiết xuất từ

Prunella vulgaris có kh ả năng ức chế sinh prostaglandin E 2 và NO (nitric oxide)

trong tế bào macrophages RAW 264.7 của chuô ̣t khi kích thích đáp ứng viêm thông qua LPS [23] Ở mô hình sàng lọc chất kháng viêm sử dụng thụ thể TLR , tế bào macrophage sau khi đươ ̣c gây cảm ứng viêm bằng LPS , là phối tử đặc hiệu của TLR4, sẽ được ủ với dịch chiết thực vật Việc đo mức đô ̣ ức chế chất trung gian giải phóng ra sẽ cho phép xác định được dịch chiết tiềm năng (có khả năng có hoạt

tính quan tâm ) Nếu hàm lượng chất trung gian IL -6, TNF-α sinh ra bi ̣ giảm đi sẽ

cho phép kết luận dịch chiết thực vật có chứa chất kháng viêm tiềm năng và chất này có tác dụng kháng viêm theo con đường thụ thể TLR 4 (Hình 7)

Tế bào

macrophage LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

- Đo mức độ ức chế chất trung gian giải phóng ra

- Đo tín hiệu viêm đặc hiệu

- Dịch chiết tiềm năng

- Chất tiềm năng

Macrophage có TLR4 được cảm ứng

Tế bào macrophage LPS

- Dịch chiết thực vật

- Chất nghiên cứu

- Đo mức độ ức chế chất trung gian giải phóng ra

- Đo tín hiệu viêm đặc hiệu

- Dịch chiết tiềm năng

- Chất tiềm năng Macrophage có TLR4

được cảm ứng

Hình 7 Mô hình sàng lo ̣c sƣ̉ du ̣ng thu ̣ thể toll like (TLRs)

Động vật nghiên cứu tách lấy tế bào Macrophage, bổ sung LPS thu được tế bào Macrophage có TLR4 được cảm ứng Sau đó bổ sung thêm dịch chiết thực vật hoặc chất nghiên cứu Tiến hành đo mức độ ức chế chất trung gian giải phóng ra và

đo tín hiệu viêm đặc hiệu Cuối cùng thu được dịch chiết tiềm năng hoặc chất tiềm năng

Nhìn chung, ba mô hình sàng lo ̣c và nghiên cứu các chất kháng viêm viê ̣c sử dụng các thụ thể glucocorticoid, TLR và gen mã hóa luciferase có gắn NF -КB đang đươ ̣c sử du ̣ng nhiều cho mục đích sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm in vitro ở các phòng thí nghiệm quốc tế hiện nay Đây la ̀ những mô hình nghiên cứu in

vitro hiện đa ̣i, khá đơn giản và chính xác ở mức phân tử Mô ̣t điểm ưu viê ̣t nữa của các mô hình sàng lo ̣c này là chúng cho phép sàng lo ̣c nhanh và hiê ̣u quả mô ̣t số

lươ ̣ng mẫu lớn trong thời gian ngắn do viê ̣c sàng lo ̣c có thể thực hiê ̣n với lượng mẫu nhỏ trên đĩa ELISA 96 giếng Đây chính là cơ sở để có thể phá t triển các mô hình sàng lọc này trên hệ thống sàng lọc nhanh HTS (hight throughput screening system)

2.1.5.4.Mô hi ̀nh nghiên cứu viêm thực nghiê ̣m in vivo sử dụng LPS

Khả năng kháng viêm của một chất nghiên cứu , đặc biê ̣t là sau bước sàng lo ̣c in

vitro, chỉ được khẳng định khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật thực

nghiê ̣m Đối với chất kháng viêm , các nghiên cứu thường sử dụng chuột vì hệ gen chuô ̣t và nguời có mức đô ̣ tương đồng khá ca o (85%) [9] Ngoài ra, sử du ̣ng chuô ̣t

sẽ ít tốn kém và dễ thực hiện hơn so với các động vật thực nghiệm khác Các nghiên

cứu trước đây thường sử du ̣ng trực tiếp các mô hình gây viêm thực nghiê ̣m in vivo

để sàng lọc và nghiên cứu cơ chế kháng viêm của chất cần nghiên cứu Các mô hình

này thường là : i) sử du ̣ng carrageenan , mô ̣t polysaccharide tách từ tảo đỏ , để gây

viêm ở chân chuô ̣t (caageenan-induced hind paw edema ) trong điều kiê ̣n có mă ̣t và

vắng mă ̣t của chất cần nghiên cứu và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối

chứng [45]; ii) gây viêm xoang bu ̣ng (peritroneal inflammation ) bằng cách tiêm

carrageenan vào bu ̣ng chuô ̣t trong điều kiê ̣n có mă ̣t và vắng mă ̣t của chất nghi ên cứu Lượng di ̣ch viêm tiết trong xoang bu ̣ng chuô ̣t sẽ được thu la ̣i và so sánh với

đối chứng về thể tích cũng như lượng ba ̣ch cầu và protein trong di ̣ch [11]; iii) gây

viêm ma ̣n tính (chronic inflammation ) bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuô ̣t trong điều kiê ̣n có mă ̣t và vắng mă ̣t của chất nghiên cứu để ta ̣o khối u Sau đó khối u đ ược lấy ra để đo trọng lư ợng khô so với mẫu đối chứng [21] Hiê ̣n nay,

mô hình gây viêm thực nghiê ̣m sử du ̣ng ta ̣i nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới gọi

là shock nội độc tố (endotoxin shock model ) thường sử du ̣ng LPS của vi khuẩn (một tác nhân gây viêm ma ̣nh ) để gây viêm cấp và viêm đặc hiệu với thụ thể TLR 4 cần nghiên cứu Ở mô hình này , chuô ̣t sau khi được gây viêm sẽ cho uống chất nghiên cứu Hàm lượng các chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham giá vào các con đường tín hiê ̣u viêm được theo dõi và đánh

giá, ví dụ như cytokine, chemokine tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein

kinase (MAPKs- mitogen-activated protein kinase), hay phản ứng ôxy hóa Từ đó

tác dụng của chất nghiên cứu được khẳng đi ̣nh (Hình 8) Với mô hình in vivo này,

viê ̣c đánh giá tác du ̣ng của chất kháng viêm sẽ có hê ̣ thống , chính xác và chi tiết hơn ở mức phân tử

Chất nghiên cứu

- Chất trung gian giải phóng ra

- Giải phẫu cơ quan

Khẳng định tác dụng kháng viêm LPS

Chất nghiên cứu

- Chất trung gian giải phóng ra

- Giải phẫu cơ quan

Khẳng định tác dụng kháng viêm

LPS hoặc chất nghiên cứu được đưa vào đối tượng nghiên cứu Tiến hành đo chất trung gian giải phóng ra và giải phẫu cơ quan ta đưa đến khẳng định tác dụng kháng viêm của chất nghiên cứu hoặc LPS

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn do viêm là rất cao Cho đến nay, viêm nặng và choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên thế giới và Việt Nam Trong nhiều trường hợp , quá trình bị viêm kéo dài mà không được điều tri ̣ ki ̣p thời còn dẫn đến những bê ̣nh mãn tính nguy hiểm như tim ma ̣ch, tiểu đường, thấp khớp…

Việt Nam cũng là nước có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt về thực vật Theo thống kê của Viện Dược liệu thì tính đến năm 2000, nước ta có gần

4000 loài thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau, đó là chưa kể đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể được dùng làm thuốc [5] Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc để tìm ra những chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới

có hiệu quả cao mà không gây ra các phản ứng phụ Tuy vậy, có thể nói các nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nước

để phát triển thành các sản phẩm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng còn rất hạn chế

Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng chúng ta chưa có các nghiên cứu sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất chống viêm Đây chính

là cơ sở để phát triển các sản phẩm thuốc có thể thương mại được trên thị trường Việt Nam và quốc tế Các nghiên cứu về viêm được thực hiện chủ yếu ở Viện Dược

liệu Trung ương, các trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân Y 103 Các nghiên cứu ở những cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo được mô

hình gây viêm thực nghiệm in vivo cổ điển như đã trình bày ở trên Cụ thể là các thí

nghiê ̣m được thực hiê ̣n trên chuột thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mô hình viêm cấp dưới hình thức gây phù bàn chân chuột và gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột Việc đánh giá tác dụng kháng viêm được thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đánh giá tác dụng kháng viêm cũng chủ yếu được thực hiện với các cao chiết thô của thực vật Điển hình như các nghiên cứu của Đă ̣ng Diễm Hồng và cô ̣ng sự với các di ̣ch chiết rong tảo biển Việt Nam [2] Nhóm nghiên cứu đã phát hiện thấy dịch chiết methanol của

hai loài tảo biển là Sargassum swartzii và Ulva reticulata thể hiê ̣n hoa ̣t tính kháng

viêm cao mà không gây đô ̣c với đô ̣ng vâ ̣t thử nghiê ̣m [2] Hàng loạt các nghiên cứu khác trong thời gian gần đây cũng chỉ sử dụng các mô hình nghiên cứu này để đánh giá tác dụng kháng viêm của các dịch chiết thực vật nghiên cứu Ví dụ như Hà Vân

Oanh và cộng sự (2010) trên cao lỏng của rễ cây bạch đồng nữ (Clerodendrum

chinense) [8], Đỗ Thị Oanh và cộng sự (2010) trên cao so ́i rừng (Sapium sebiferum) [7] hay Nguyễn Thị Bích Hằng (2009) trên cao lỏng lá vọng cách (Premna

corymbosa) [ 1] Như vậy có thể nói rằng , mô hình nghiên cứu viêm và đánh giá

tác dụng kháng viêm ở Việt Nam hiện nay là đơn giản , cổ điển, tốn nhiều thời gian

và thiếu tin câ ̣y Như vâ ̣y, chúng ta còn thiếu các nghiên cứu hiện đại với các mô hình gây viêm đạt chuẩn quốc tế hay nghiên cứu cơ chế kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hưởng của chất nghiên cứu lên các thụ thể như TLR, glucocorticoid, mức

độ giải phóng các chất trung gian được tiết ra trong quá trình tiền viêm và viêm, các tín hiệu gây viêm đặc hiệu Đặc biệt, cho đến nay chúng ta chưa có mô hình sàng

lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh , chính xác và hiệu quả các chất kháng viêm

mới từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

3 Cây nhọ nồi và cây ngải cứu

3.1 Cây nhọ nồi

Thực vật là nguồn vô giá đối với những sản phẩm dược học Trên thế giới, những thực vật có tính dược học được sử dụng truyền thống đã sản xuất ra một loạt những hợp chất có rất nhiều tiềm năng chữa bệnh Việt Nam, trong lĩnh vực dược học đã sản xuất nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật mang những dược tính mới Thực vật làm thuốc đã góp một phần quan trọng trong điều trị một số bệnh thông qua những dược tính quí giá [4]

Cây nhọ nồi hay là cây cỏ mực, hàn liên thảo (danh pháp khoa học: Eclipta alba Hassk hoặc Eclipta prostrata L), thuộc bộ Asterales, họ Asteraceae, chi Eclipta,

loài E alba

Cây nhọ nồi là cây cỏ, sống một hay nhiều năm, mọc đứng hay mọc bò, cao 40cm Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng Lá mọc đối, gần như không cuống, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt lá có lông Hoa hình đầu, màu trắng, mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân, gồm hoa cái ở ngoài và hoa lưỡng tính ở giữa Quả bế dài 3mm, có 2-3 vảy nhỏ, có 3 cạnh, hơi dẹt [5]

Hình 9: Cây nhọ nồi

Theo đông y cây nhọ nồi có thể chữa can, thận âm hư, các chứng huyết nhiệt, chứng ho ra máu, nôn ra máu, đại tiện và tiểu tiện ra máu, chảy máu cam, chảy máu dưới da, băng huyết rong huyết, râu tóc sớm bạc, răng lợi sưng đau

3.2 Cây ngải cứu

Ngải cứu còn có tên khác là thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải (tiếng Tày), quá

sú (H'mông), cỏ linh li (Thái), danh pháp khoa học: Artemisia vulgaris, thuộc bộ Asterales, họ Asteraceae, chi Artemisia, loài A.vulgaris

Cây ngải cứu hay cây cỏ, sống nhiều năm, cao 0,4 - 1m; cành non có lông

Lá mọc so le, phiến lá xẻ lông chim, mặt trên xanh sẫm, mặt dưới màu trắng xám,

có lông Vò nát có mùi thơm hắc Cụm hoa hình đầu nhỏ, màu vàng lục nhạt, mọc tập trung thành từng chùm kép ở đầu cành Quả bế nhỏ, không có túm lông

Theo đông y, cây ngải cứu chữa kinh nguyệt không đều, khí hư, động thai, băng huyết, thổ huyết, chảy máu cam, lỵ ra máu, nôn mửa, đau bụng, đau dây thần kinh, thấp khớp ghẻ lở [5]