M S CW De
1.Pha dung dịch chuẩn
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 1000pg/ml và dung dịch Assay
Sau đó tiến hành pha về các dung dịch có nồng độ thấp hơn gồm: 500pg/ml; 250pg/ml; 125pg/ml; 62.5pg/ml; 31.3pg/ml; 15.6pg/ml
Dung dịch Assay đƣợc coi là có nồng độ 0pg/ml
Sau khi đã thu đƣợc các dung dịch có nồng độ chuẩn nhƣ trên, tiến hành dựng đƣờng chuẩn. Đƣờng chuẩn là đƣờng có dạng hàm log, cho biết mối quan hệ giữa lƣợng OD đo đƣợc và nồng độ thực tế của các cytokine
Máy đọc ELISA sẽ cho kết quả là lƣợng OD trong dung dịch mẫu sau quá trình bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Kết quả này có đƣợc là do một chất hóa học đặc biệt đƣợc bổ sung trong kit, cho bƣớc sóng nhận biết đặc hiệu là 450nm. Sau khi thu đƣợc kết quả OD của các mẫu cần đo, số liệu đƣợc so sánh với đƣờng chuẩn. Dựng số liệu OD qua đƣờng tuyến tính sẽ cho kết quả nồng độ thực tế của cytokine
Các sai số trong phép đo đƣợc biểu thị thông qua hai lần xử lý số liệu:
- Sai số trong quá trình dựng đƣờng chuẩn biểu thị bằng sự sai lệch so với đƣờng tuyến tính
Conc 1 10 100 1000 0.01 0.1 1 10 StandardCurve
Log-Log Fit: Log(y) = A + B * Log(x): A B R^2
Std (Standards: Conc vs MeanValue) -1.95 0.902 0.988
Hình: Đường chuẩn của cytokine IL-6
Đối với phân tích khả năng sản xuất cytokine tiền viêm và kháng viêm bằng zymosan trong BMDM bằng kít ELISA, ở đây là TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10. BMDMs đƣợc tách ra từ chuột đƣợc ủ cùng với LPS hoặc zymosan sau một số thời gian nhất định. Thu dịch sau khi ly tâm các mẫu tế bào. Sau đó các dịch này sẽ đƣợc đo nồng độ TNF-α, IL-6, IL12p40, IL-10 bằng kít ELISA (BD bioscience). Các thủ tục tiến hành đo cytokine sẽ đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà chế tạo kít ELISA. Nồng độ cytokine tiết ra từ các tế bào nuôi cấy sẽ đƣợc đánh giá thông qua khả năng hấp thụ ở bƣớc sóng 450 nm bằng máy ELISA.
2. Quy trình thí nghiệm Westernblot A. Các hoá chất, thiết bị sử dụng :