- Giải phẫu cơ quan
51 30 60 120 240 480 phút P-ERK1/
P-ERK1/2 ERK1/2 p38 P p-p38 LPS
39
3.5. Wedelolactone ức chế quá trình phospho của yếu tố tự phân bào bằng LPS kích thích thông qua thụ TLR4 kích thích thông qua thụ TLR4
LPS kích thích quá trình phospho hóa của ERK1/2(extracellular-signal- regulated kinases) và p38 mạnh nhất ở 30 phút sau khi ủ. Do vậy, để đánh giá khả năng ức chế của Wedelolactone trong quá trình phospho hóa của ERR1/2 (extracellular-signal-regulated kinases) và p38 các tế bào BMDM đã được ủ với Wedelolactone trong 45 phút. Tiếp sau, được ủ với LPS trong 18 giờ. Kết quả chỉ ra trên hình 5 cho thấy Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho hóa của ERK1/2 và p38. Từ những kết quả này gợi ý vai trò của điều hòa của Wedelolactone trong quá trình phospho hóa của yếu tố tự phân bào thông qua thụ thể TLR4 được kích thích bằng LPS
Hình 16. Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho của ERK1/2 và p38 trong BMDM
BMDMs đã được ủ cùng với Wedelolactone (20 µg/ml) hoặc Dexamethasone (100nM) trong 45 phút. Sau đó, các tế bào tiếp tục được ủ với LPS (100ng/ml) trong 18 giờ. Sau khi ly tâm các tế bào được phá vỡ nhờ đệm phá tế bào trong 4ºC. Quá trình phospho hóa được đánh giá thông qua quá trình western blot. (Môi trường: M; dung môi đối chứng: SD; Wedelolactone: W; Dexamethasone: Dex).
ERK p38 p38 M SD W SD Dex P-ERK P-p38 LPS
40
3.6.Wedelolactone đã ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể TLR4 kích thích bằng LPS
LPS có thể kích thích quá trình sản xuất ROS trong đại thực bào [25]. Tuy nhiên, vai trò của Wedelolactone trong quá trình sinh ROS do LPS kích thích trong BMDB vẫn chưa rõ. Để điều tra quá trình này, BMDMs đã được ủ cùng với Wedelolactone (20μg/ml) hoặc Dex (100nM). Sau đó, các tế bào này được ủ tiếp với LPS trong 30 phút. Các tế bào này tiếp tục được ủ với DHE (Fluorescent Dyes (dihydroethidium)- chất huỳnh quang) theo như phần phương pháp. Như chỉ ra ở Hình 5, LPS đã kích thích tạo ra ROS, tuy nhiên quá trình sản xuất ROS đã bị ức chế bởi tế bào được ủ với Wedelolactone hoặc với Dexamethasone. Những kết quả này chỉ ra rằng Wedelolactone đã điều hòa quá trình sinh ROS do LPS kích thích trong BMDM thông qua thụ thể TLR4.
Hình 17. Wedelolactone hoặc Dex ức chế quá trình sản sinh ROS đƣợc kích thích bởi LPS thông qua TLR4
BMDMs được ủ với Wedelolactone (20μg/ml ), galactan (0,5 mg/ml), hoặc dung môi (0,1% DMSO) trong 45 phút. Sau đó tế bào được ủ với LPS (100 ng/ml) trong 30 phút. Sau đó các tế bào được ủ với DHE (Fluorescent Dyes (dihydroethidium) - chất huỳnh quang). Kết quả chỉ Mật độ huỳnh quang của tế bào được xác định bằng kính hiển vi hội tụ lazer. Kết quả thí nghiệm chỉ sự sai số trong 5 thí nghiệm độc lập (W: Wedelolactone; Dex: dexamethasone).
lam+ W gal+ W Quá trình sinh ROS (O2-) LPS W Dex
41
3.7. LPS kích thích hoạt động p47 phox trong quá trình tạo ra ROS
Quá trình phospho hóa p47phox và p47phox-ser345 là một trong những sự kiện chính bên trong tế bào liên kết cùng với quá trình hoạt động của oxy hóa NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) để tạo ra ROS [25]. Do vậy, các tế bào BMDM đã được ủ với LPS (100ng/ml) trong các thời gian khác nhau. Động lực của quá trình phospho hóa p47phox-Ser345 đã được phân tích ở các thời gian khác nhau như trên hình 7. Kết quả chỉ ra rằng quá trình phospho hóa p47phox đã bắt đầu từ 15 cho đến 30 phút sau khi ủ với LPS. Tuy nhiên, quá trình này mạnh nhất tại 15 phút sau khi ủ với LPS.
p47phox-ser345
p47phox
Hình 18. LPS kích thích quá trình phospho hóa của p47phox trong BMDM.
BMDM được ủ với LPS (100ng/ml) tại các thời điểm từ 0 cho đến 120 phút. Sau khi ly tâm các tế bào được phá vỡ nhờ đệm phá tế bào trong 4ºC. Quá trình phospho hóa được đánh giá thông qua quá trình western blot.
0 5 15 30 60 120 (min) LPS LPS
42
3.8. Wedelolactone ức chế quá trình sinh ROS thông qua thụ thể TLR4 bằng LPS LPS
Vai trò của Wedelolactone trong quá trình phospho hóa p47phox vẫn chưa được chứng minh. Do vậy, các tế bào BMDM đã được ủ cùng với Wedelolactone (20μg/ml) hoặc Dexamethasone (100nM) trong 45 phút. Sau đó, các tế bào này được ủ với LPS (100ng/ml) trong 15 phút. Kết quả trên hình 8 cho thấy, Wedelolactone và Dex đã ức chế quá trình phospho hóa của p47phox trong BMDM. Từ những kết quả này chỉ ra rằng Wedelolactone có khả năng ức chế quá trình phospho hóa của p47phox. Do vậy, ức chế quá trình tạo ra ROS.
Hình 19. Wedelolactone đã ức chế quá trình phospho hóa của p47phox
BMDMs đã được của cùng với Wedelolactone (20 µg/ml) hoặc Dexamethasone (100nM) trong 45 phút. Sau đó, các tế bào tiếp tục được ủ với LPS (100ng/ml) trong 15 phút. Sau khi ly tâm các tế bào được phá vỡ nhờ đệm phá tế bào trong 4ºC. Quá trình phospho hóa được đánh giá thông qua quá đánh giá bằng Western blot. (Môi trường: M; dung môi đối chứng: SC; Wedelolactone: W; Dexamethasone: Dex).
p-ser345
p47phox LPS