Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1

Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1 Thân Văn Minh Trường Đạ

Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1

Thân Văn Minh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học

Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS Trịnh Tất Cường

Năm bảo vệ: 2011

Abstract: Tổng quan về vai trò của dệ thống miễn dịch đối với bảo vệ cơ

thể Trình bày khái niệm viêm, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng cũng như miễn dịch bẩm sinh của vật chủ đáp ứng quá trình nhiễm vi khuẩn Tìm hiểu cây nhọ nồi và vai trò của Wedelolactone trong qúa trình chống viêm Nghiên cứu khả năng điều hòa của Wedelolactone trong quá trình sản xuất cytokine tiền viêm và quá trình tạo phản ứng oxy hóa trong BMDM thông qua cấu tử đặc hiệu của Dectin-1 Đánh giá hiệu quả điều trị của Wedelolactone trong chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gây ra bởi zymosan Đưa ra kết quả và thảo luận: khả năng sống của

tế bào không bị ảnh hưởng bởi Wedelolactone; đánh giá khả năng zymosan kích thích tế bào BMDM sinh cytokine;

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Điều trị bệnh; Sinh học; Cây nhọ nồi; Bệnh nhiễm trùng

Content

Nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng là hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi viêm hệ thống do nhiễm trùng Ngay cả điều trị tối ưu, tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gần 40% Tần suất của nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng gia tăng 15 năm gần đây Tại Mỹ: 750.000 ca/năm; là 1 trong 10 nguyên nhân tử vong thường gặp Mặc dù, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng đã được phát hiện từ 30 năm trước, nhưng các bệnh nhân mắc căn bệnh này vẫn có khả năng tử vong rất cao Do

vậy, việc tìm kiếm phương pháp và tá dược chữa bệnh là một vấn đề cần thiết và cấp bách để điều trị hiệu quả quá trình viêm hệ thống, và sẽ hỗ trợ cải thiện được khả năng điều trị của bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng

Cây nhọ nồi (có tên khoa học là Eclipta prostrata hoặc Eclipta alba) là thực vật

thuộc họ cúc (Asteraceae) và mọc ở những vùng ẩm như một loại cỏ ở khắp thế giới Cây nhọ nồi mọc nhiều ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam [2] Các hoạt tính

dược học của Wedelolactone từ nhọ nồi đã được chứng minh ở in vitro và in vivo [31]

Cho đến nay, nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU) Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp trên thế giới.Tại Việt Nam, trong nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của Wedelolactone từ cây nhọ nồi Việt Nam đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Bước đầu đã cho thấy tác dụng của chất này trong quá trình chống viêm

Với hoạt tính phòng chống viêm đầy tiêm năng của Wedelolactone, chúng tôi muốn nghiên cứu sâu hơn nữa các đặc tính, cơ chế chống viêm và khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng ở mức độ in vitro và in vivo tạo cơ sở cho các nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm và đặc biệt là bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng Xuất phát từ cơ sơ khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1”

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 VAI TRÒ CỦA HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI BẢO VỆ CƠ THỂ

Miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng là hai loại đáp ứng miễn dịch bảo vệ quan trọng đối với các động vật có xương sống Miễn dịch đáp ứng bẩm sinh có vai trò như hàng rào bảo vệ đầu tiên nhưng lại không có khả năng nhận dạng lập lại các mầm bệnh và trợ giúp đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đáp ứng nhận dạng mầm bệnh

dựa vào chọn lọc một vùng cụ thể nhờ vô số các tế bào lymphocyte mang rất nhiều thụ thể đặc hiệu kháng nguyên mà cho phép hệ thống miễn dịch có thể nhận dạng bất kỳ kháng nguyên bên ngoài xâm nhập vào cơ thể Hệ thống miễn dịch bẩm sinh sử dụng vô

số các thụ thể để nhận dạng và đáp ứng tới những mầm bệnh trong giai đoạn ban đầu của cơ thể Quá trình nhận dạng mầm bệnh của các thụ thể có một vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu tới những đáp ứng viêm, sản xuất những tế bào hiệu quả mới tham gia vào quá trình viêm cục bộ và bắt đầu những đáp ứng của quá trình miễn dịch đáp ứng Vô số các thụ thể nhận dạng mầm bệnh mẫu (PRR) bao gồm thụ thể Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1 và các thụ thể scavenger quyết định tới khả năng sống xót của vật chủ bằng quá trình nhận dạng những mẫu phân tử ở trên mầm bệnh như vi khuẩn, virut, nấm có cấu trúc giống như trên các thụ thể riêng biệt được gọi là PAMP (pathogenic associated molecules pattern) Quá trình nhận dạng mầm bệnh bằng quá trình thực bào kích thích thực bào hóa, sinh ra cytokine, chemokine tiền viêm, và thậm trí là kích thích quá trình ban đầu của miễn dịch đáp ứng

2 KHÁI NIỆM VIÊM

Viêm (inflammation) là một phần đáp ứng sinh học phức tạp của các mao mạch với các vị trí bị tổn thương trên cơ th ể do bị kích thích bởi các mầm bệnh hay là những tế bào bị hỏng Quá trình này nhằm bảo vệ các cơ quan, loại bỏ hay sửa chữa những vị trí kích thích bị thương và bị lỗi Khi phản ứng viêm xảy ra , nhiều loa ̣i tế bào sẽ được hoa ̣t hóa và tập trung đến ổ viêm như các loa ̣i tế bào di chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân , đa nhân, các tế bào lympho , tiểu cầu , tế bào nô ̣i ma ̣c… Các t ế bào này giải phóng ra hàng loạt các chất trung gi an, phần lớn là các chất p rostaglandins (PG), leukotrienes (LT), histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu và interleukin-1 Các chất này la ̣i tiếp tu ̣c hoa ̣t hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loa ̣t các enzyme

“do ̣n de ̣p” chủ yếu phân giải protein như các prote inase, các interleukin, yếu tố ngoại tử khối u (TNF-α), các superoxide , H+, hydroperoxide gây ra tổn thương mô , qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới những vùng bị xâm nhập và dẫn tới hiện tượng bị đỏ, nóng Một vài chất tiết ra làm h ẹp dòng chảy củ a máu d ẫn tới bị sưng Khi quá trình viêm kéo dài

sẽ dẫn tới hiệu quả tích lũy và trạng thái mất cân bằng do quá trình viêm chi ếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ

huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23]

3 NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG NHIỄM TRÙNG

Nhiễm trùng có thể được định nghĩa như một phổ của những điều kiện lâm sàng gây

ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân tới quá trình nhiễm trùng mà được đặc trưng bởi viêm hệ thống và quá trình đông tụ [6,7,8] Các bệnh nhân mắc nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng trải qua hai giai đoạn đáp ứng miễn dịch [7] Thời kỳ đầu sẽ biểu hiện những đáp ứng viêm ồ ạt tới quá trình nhiễm trùng Hầu hết, đó là các cytokine tiền viêm như TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12, và interferon gamma (IFN gamma) Sau

đó, cơ thể sẽ điều hòa những đáp ứng này bằng sản xuất những cytokine kháng viêm (IL-10), các chất ức chế của thụ thể TNF, thụ thể IL-1 loại II, và IL-1RA (một dạng bất hoạt của IL-1) [12] Các lớp đáp ứng viêm hệ thống của vật chủ được bắt đầu bằng một

số sản phẩm vi khuẩn Những sản phẩm vi khuẩn (vi khuẩn gram âm bao gồm nội độc tố: lipopolysaccharide (LPS), formyl peptides, ngoại độc tố và proteases; các vi khuẩn gram dương như ngoại độc tố, các siêu kháng nguyên, ngoại độc tố A của streptococcal pyrogenic (SpeA), peptidoglycan, axít lipotechoic) và một số chất của vỏ tế bào nấm

(zymosan được phân tách từ Saccharomyces cerevisiae) liên kết các thụ thể trên

macrophage của vật chủ và kích hoạt những protein điều hòa (yếu tố nhân Kappa B (NFқB)) [12] Chẳng hạn, thụ thể Toll like 4 (TLR4) nhận dạng LPS, còn thụ thể Dectin-1 nhận dạng đối với zymosan [8,15] Sau đó, các thụ thể chuyển tín hiệu vào tế bào Hiệu quả tích lũy của những lớp viêm hệ thống này dẫn tới trạng thái mất cân bằng, cùng với quá trình viêm chiếm ưu thế hơn quá trình kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết (fibrin) Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tổn thương sẽ là hậu quả tiếp sau dẫn tới nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng, mất chức năng của đa cơ quan và tử vong [23]

4 MIỄN DỊCH BẨM SINH CỦA VẬT CHỦ ĐÁP ỨNG QUÁ TRÌNH NHIỄM VI KHUẨN

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm vô số các thành phần khác nhau để chống lại quá trình xâm nhập của vi sinh vật Thứ nhất, các chức năng của hàng rào biểu bì của

cơ thể có thể cản trở quá trình gây viêm nhiễm của mầm bệnh Thứ hai, các tế bào và các phân tử kiểm soát hoặc phá hủy các mầm bệnh mà có thể trốn thoát khỏi lớp hàng rào bảo vệ biểu bì để xâm nhập tiếp vào bên trong Thứ ba cũng là hàng rào quan trọng nhất của hệ thống bảo vệ miễn dịch bẩm sinh đó các mô của tế bào macrophage truyền tin hiệu bảo vệ tế bào ở các vùng ngoại biên và hệ thống bổ thể của protein truyền tín hiệu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh dưới dạng dịch nằm giữa khoảng không của mô

và máu Quá trình nhận dạng bằng hệ thống miễn dịch sẽ loại bỏ các mầm bệnh xâm nhập thông qua vô số cơ chế hiệu quả khác nhau Hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể xem như có vai trò quan trọng nhất trong quá trình viêm nhiễm

4.1 Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs)

Thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR, pathogen recognition receptor) được chia làm

ba nhóm chính bắt nguồn từ vị trí trong tế bào đó là: thụ thể huyết thanh hoặc phần dịch của mô; màng tế bào hay cytoplasm; hay nằm trên màng hoặc trong dịch tế bào được xem là thụ thể nhận dạng mầm bệnh [19] Mỗi nhóm thụ thể PRR có các phối tử đặc hiệu của chính mình để có thể nhận dạng một loại vi sinh vật nhất định [19] Các thụ thể này có thể nhận dạng mầm bệnh một cách trực tiếp (không thông qua opsonin) hoặc gián

tiếp (thông qua oposonin) [19] Đối với In vivo, nhiều thụ thể có thể tham gia để nhận

dạng vi khuẩn thông qua đa phản ứng ở đa vị trí Các phần có nguồn gốc từ nấm hay mấm lớn được nhận bằng PRR giống như thụ thể TLR, thụ thể mannose, bổ thể 3 (CR3),

và dectin-1 [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của PRR kích thích quá trình sản xuất cytokine và chemokine dẫn tới quá trình hoạt động và sinh ra các tế bào khác tham gia tới vị trí đang trong quá trình bị viêm nhiễm Từ đây, dẫn tới những phản ứng của miễn dịch đáp ứng [12]

Fungi TLR2 TLR6

Mannose receptor

Dectin-1

CD11b CD18

CR3 Fungi Fungi

Hình 1: Các thụ thể RRP đối với nấm có thể nhận dạng ra phần cacsbon Thụ thể Mannose nhận dạng thành phần mannan; TLR2 và TLR6, CR3, dectin-1 nhận

dạng β-glucans

4.2 Thụ thể Toll- like (TLR)

Thụ thể Toll- like (TLR) là một protein màng mà nhận dạng ra các phân tử có sẵn

ở trên mầm bệnh (PAMP) [20] Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm ít nhất

10 loại khác nhau Chúng có một vai trò cơ bản tới nhận dạng các phối tử có nguồn gốc

từ mầm bệnh [20] TLR2 có thể nhận dạng lipoproteins các gốc đường có gắn (lipoarabinomannan) từ thành tế bào của vi khuẩn và nấm [13] TLR4 nhận dạng lipopolysaccharide (LPS) từ thành tế bào của vi khuẩn gram âm [15] TLR9 có thể nhận dạng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG) có trong deoxyribonucleic acid (DNA) của vi khuẩn [13] Một vi sinh vật có thể được nhận bởi rất nhiều TLR Thực tế,

lipid-tổ hợp của TLR có thể tham gia vào các đáp ứng viêm do macrophage hoặc tế bào dendritic sinh ra trong quá trình cơ thể bị nhiễm mầm bệnh [20] TLR bao gồm một đoạn nằm bên trong tế bào được gọi là thụ thể Toll/IL-1 (TIR) Đoạn này sẽ tường với các đoạn TIR khác Những đoạn TIR có chứa các phân tử tiếp nối giống như giống như yếu tố phân chia tế bào 88 (MyD88), protein nối tiếp có đoạn TIR (TIRAP), mộ đoạn TIR có chứa phần interferon-β (TRIF), và phân tử tiếp nối với TRIF (TRAM) [20] Quá trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động nhân tế bào là NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), và sản xuất ra các cytokine tiền viêm như tumor necrosis factor, TNF-α thông qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88, nhưng quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt động của NF-κB thông qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiễn mã của interferon (IFN) giống như quá trình sản xuất IFN kiểu 1 [27]

4.3.Thụ thể Dectin- 1

Quá trình nhiễm nấm đã kích hoạt quá trình hoạt động ban đầu của các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh trong động vật có vú thông qua các cơ quan cảm ứng đối với quá trình nhiễm trùng [16] Chất β-glucan là một thành phần quan trọng trong vỏ của tế bào của nấm Tế bào có thể nhận ra được thành phần này khi xâm nhập đó là nhờ vao sự

hoạt động của thụ thể Dectin-1 Thụ thể này nằm trên màng tế bào có một đoạn kiểu C lectin gắn với loại màng kiểu II và có một đoạn bên trong cytoplasma của tế bào cùng với một phần hoạt động dựa vào thụ thể miễn dịch tyrosine [8]

Dectin-1 được biểu hiện trên các dòng tế bào myeloid, monocyte, đại thực bào, tế bào trung tính và tế bào tua [16] Cho đến nay thụ thể Dectin-1 đã được hiểu rất rõ là một thụ thể biểu hiện mạnh nhất trên đại thực bào trong quá trình thực bào của nấm Đặc biệt thụ thể này có thể nhận dạng đặc hiệu đối với β-glucan hoặc zymosan (một chất có chứa một hàm lượng lớn β-glucan và được tách chiết từ Sacchomyces) Các đáp ứng thực bào đối với quá trình nhận dạng vi sinh vật sẽ sản xuất ra các cytokine, chemokine, quá trình thực bào hóa, giết mầm bệnh bằng sản xuất ra các peptide kháng vi sinh vật, phản ứng oxy hóa (ROS) và RNS [16]

4.4 Thụ thể Dectin-1 hoạt động cùng với TLR2 để nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ vi sinh vật

Zymosan là một hợp chất mà lượng β-glucan trong thành tế bào của

Saccharomyces cerevisiae chiếm phần chính [8,16] Thành phần của zymosan có

β-glucan, mannan, và chitin Thành phần này được nhận dạng bằng một số thụ thể chẳng hạn như TLR2, TLR6, Dectin-1, thụ thể mannose, và CR3 [16] Chất này đã được chứng

minh là kích thích quá trình đại thực bào và quá trình viêm cả ở in vivo và in vitro [16]

Dectin-1 hoạt động cùng với một số TLR để nhận dạng ra nấm [16] Thụ thể này

cùng với TLR2, Dectin-1 nhận dạng ra zymosan hoặc nấm Candida albicans truyền tín

hiệu điều hòa hoạt động của yếu tố nhân kích hoạt tế bào T (NFAT) và quá trình sản

xuất interleukin (IL)-2, IL-10, và IL-12 p70 trong tế bào dendritic [16, 26] Dectin-1

cũng tham gia vào quá trình thực bào, hoạt động của yếu tố tự phân bào (ERK)1/2 (extracellular signal-regulated kinase), và quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm cùng

với TLR2 để nhận dạng ra Mycobacterium abscessus [16] Hơn nữa, Dectin-1 tham gia cùng với TLR2 và TLR4 trong đáp ứng miễn dịch bẩm sinh tới nhận Mycobacterium

ulcerans để kích thích sinh ra gốc oxy hóa (ROS) và sản xuất ra chemokines và IL-37

trong kerainocyte của người Do vậy, Dectin-1 thực hiện một vai trò hoạt động giống

như một thụ thể chính nhận dạng ra quá trình nhiễm nấm và mycobacterium [16]

Dectin-1 nhận dạng ra nấm để sinh ra quá trình enzyme kinsase của tyrosine ở lách (Syk) và một đoạn protein caspase 9 (CARD)9 CARD9 tác động cùng với B-cell lymphoma-10 (Bcl-10) và vùng phiên mã gen 1 của lympho (MALT1) để kích thích tạo ra ROS và quá trình hoạt động của NF-κB Quá trình biểu hiện của Dectin-1 expression tăng cường quá trình sản xuất cytokine trong sự có mặt của TLR2 và TLR6

4.5 Glucocorticoid

Glucocorticoid đã đƣợc sử dụng nhƣ một chất chống viêm cùng với rất nhiều cơ chế trong quá trình hoạt động của nó [17] Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh glucocorticoid có thể điều hòa đƣợc chức năng của các tế bào viêm, đặc biệt là quá trình phiên mã của các gen sinh cytokine [11] Hơn nữa, glucocorticoid có thể ức chế quá trình sản xuất các cytokine tiền viêm nhƣ TNF-α, IL-6, IL-1, và làm giảm quá trình tiết gốc nito và quá trình hoạt hóa các yếu tố mô trong tế bào macrophage [22] Do vậy, glucocorticoid đã đƣợc sử dụng trong điều trị một số bệnh viêm nhiễm và các bệnh mẫn

Hình 2: Tín hiệu Dectin-1 hợp tác cùng TLR để nhận dạng nấm

cảm miễn dịch Nhưng hơn nữa, chúng có tiềm năng vô cùng to lớn trong hoạt động kháng viêm và giảm quá trình miễn dịch không có lợi cho cơ thể [9,17, 21]

Nhìn chung, quá trình viêm hệ thống mất kiểm soát được xem như là các đặc trưng của nhiễm trùng, của triệu chứng viêm cấp tính đường hô hấp Một chất được biết

đó Hydrocortisone, là một glucocorticoid, có thể làm giảm đi đáng kể mức plasma của protein C, phospholipase A2, và loại bỏ bớt các tế bào neutrophil trong các bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng [22] Những nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra chất này có thể điều hòa hầu hết các cytokine tiền viêm [11], bao gồm ức chế các cytokine có vai trò quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh và nhiễm trùng [22] Hiệu quả của glucocorticoid đã được chứng minh trong các bệnh nhiễm trùng nặng như nhiễm vi

khuẩn meningitis, pneumocystis pneumonia, typhoid fever, và những trường hợp nhiễm

H5N1 [11]

4.6 ROS và p47phox

4.6.1.Gốc oxy hóa ROS

ROS (reactive oxygen species) là một đại diện nhỏ của phản ứng oxy hóa, bao gồm superoxide (O2-) anion, hydrogen peroxide (H2O2), peroxyl (ROO-) radical, acid (HOCl), ozone (O3)[14] ROS được tạo ra thông qua một loạt các phản ứng mà bắt đầu bằng quá trình tạo ra superoxide [14] Quá trình tạo ra ROS trong sinh lý được xem như

sản phẩm phụ xảy ra trong mitochondria, cytochrome P-450, và các yếu tố tế bào khác

[23] ROS có thể tương tác cùng với vô số phân tử, bao gồm những phân tử hữu cơ nhỏ, protein, lipid, carbohydrate và nucleic acid [14] Thông qua những tương tác, ROS có thể gây ra thảm họa hoặc làm thay đổi chức năng của phân tử đích [14] Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases (Nox) cũng tạo ra ROS Thực ra, ROS tham gia trong các cơ chế truyền tín hiệu kích thích liên quan tới khả năng miễn dịch và quá trình viêm [14] ROS kích thích hoạt động của NF-κB Ví dụ, quá trình sản xuất của TNF-α được điều hòa bằng con đường NF-kB được kích hoạt bởi ROS trong tế bào Kuffer, macrophage ở trong gan [25] Hơn nưa, ROS có thể điều hòa hoạt động activator protein-1 (AP-1) (một yếu tố tham gia trong quá trình viêm) thông qua nhiều

cơ chế khác nhau [28]

4.6.2 Vai trò của p47phox trong quá trình sinh ROS

Nox sản xuất ROS thông qua rất nhiều tiểu đơn vị của nó bao gồm các thành phần điều hòa cytoplasma là Rac, p67phox, p47phox, p40phox và các protein màng

flavocytochrome b558, bao gồm tiểu đơn vị gp91phox (Nox2) và p22 phox [28] p47phox

có vai trò cơ bản đối với hoạt động của Nox [28] Ở trạng thái bất hoạt, p47phox chuyển động tới các tiểu đơn vị trong cytoplasma khác là p67phox và p40phox Ở trạng thái hoạt động, các tiểu đơn vị này sẽ kết hợp lại và chuyển electron ra ngoài màng tế bào đƣợc biết nhƣ các gốc oxy hóa (O2-) [10] Nhiều công bố đã chỉ ra p47phox có một vai trò quan trọng đối với quá trình tạo nên ROS Nó đƣợc biểu hiện trong các tế myeloid, các đoạn mô nhƣ ở bên trong tai, ở nơron thần kinh, các tế bao gan, phổi [14]

O 2 -

Hình 3: Quá trình liên kết để tạo ra ROS (gốc oxy hóa)

Ở trạng thái bất hoạt của tế bào, các prtotein thuộc cytoplasma bao gồm phức hệ p40phox, p47phox, và p67phox, và guanosine diphosphate (GDP), không liên kết với dạng cytochrome

b 558 bao gồm gp91phox (Nox2) và protein p22phox Khi ở trạng thái hoạt động, có sự thay đổi của GDP đối với guanosine-5'-triphosphate (GTP) trên Ras được xem như là độc tố C3 botulinum dẫn tới kích hoạt Lúc này, p47phox được phospho hóa và truyền tín hiệu tới và làm cho phức hệ p67phox, p40phox được chuyển tới trên màng tế bào plasma Quá trình phospho hóa của p47phox sẽ làm thay đổi cấu trúc dẫn tới tương tác với p22phox Quá trình chuyển tới màng của phức hệ p67phox, p40phox sẽ làm cho p67phox tương tác với Nox2 Cuối cùng enzym GTP trên Rac tương tác cùng với Nox2 Phức hệ được hoạt động và tạo ra superoxide (O2 -

) bằng chuyển electron từ NADPH trong cytoplasma thành oxy hóa ra ngoài tế bào [14]

4.7 Vai trò của đại thực bào trong đáp ứng viêm

Đại thực bào (macrophage) là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống Vai trò chính của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của

tế bào và các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các tế bào trình diện kháng nguyên khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể Do đóng vai trò quan trọng trong quá trình thực bào của cơ thể, đại thực bào có liên quan đến m ột số tình trạng bệnh lý do miễn dịch Ví dụ các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokine gây viêm mạnh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh lý của các hội chứng này Các cytokine chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố họai tử khối u TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, nitric oxide (NO) vàc các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm Như vâ ̣y, viê ̣c kiểm soát sản xuất các chất này có thể làm giảm khả năng viêm Macrophage là tế bào có kích thước tương đối lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm ta ̣o ra bởi LPS Ngoài ra, các TLR ở macrophage được biểu hiện m ạnh hơn so với các tế bào ba ̣ch cầu khác (Hình 4) nên nó thường được lựa cho ̣n trong các mô hình sàng lo ̣c và nghiên cứu

cơ chế kháng viêm in vitro

Hình 4: Biểu hiê ̣n của các thụ thể ở các tế bào bạch cầu

5 Mô hình nghiên cứu viêm thực nghiê ̣m in vivo sử du ̣ng LPS

Macrophage Granulocyte

Khả năng kháng viêm của một chất nghiên cứu , đặc biê ̣t là sau bước sàng lo ̣c in vitro,

chỉ được khẳng định khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật thực nghiệm Đối với chất kháng viêm , các nghiên cứu thường sử du ̣ng chuô ̣t vì hê ̣ gen chuô ̣t và nguời có mức đô ̣ tương đồng khá cao (85%) [18] Ngoài ra , sử du ̣ng chuô ̣t sẽ ít tốn kém và dễ thực hiê ̣n hơn so với các đô ̣ng vâ ̣t thực nghiê ̣m khác Các nghiên cứu trước đây thường

sử dụng trực tiếp các mô hình gây viêm thực nghiệm in vivo để sàng lọc và nghiên cứu

cơ chế kháng viêm của chất cần nghiên cứu Các mô hình này thường là : i) sử du ̣ng carrageenan, một polysaccharide tách từ tảo đỏ , để gây viêm ở chân chuột (caageenan-induced hind paw edema ) trong điều kiện có mă ̣t và vắng mă ̣t của chất cần nghiên cứu

và sau đó so sánh thể tích bàn chân viêm với đối chứng [33]; ii) gây viêm xoang bu ̣ng (peritroneal inflammation ) bằng cách t iêm carrageenan vào bu ̣ng chuô ̣t trong điều kiê ̣n

có mặt và vắng mặt của chất nghiên cứu Lươ ̣ng di ̣ch viêm tiết trong xoang bu ̣ng chuô ̣t

sẽ được thu lại và so sánh với đối chứng về thể tích cũng như lượng bạch cầu và protein trong dịch [15]; iii) gây viêm ma ̣n tính (chronic inflammation ) bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuô ̣t trong điều kiê ̣n có mă ̣t và vắng mă ̣t của chất nghiên cứu

để tạo khối u Sau đó khối u được lấy ra để đo tro ̣ng lương khô so vớ i mẫu đối chứng [29] Hiện nay, mô hình gây viêm thực nghiê ̣m sử du ̣ng ta ̣i nhiều phòng thí nghiê ̣m trên thế giới go ̣i là shock nô ̣i đô ̣c tố (endotoxin shock model ) thường sử du ̣ng zymosan của nấm (một tác nhân gây viêm ma ̣nh ) để gây v iêm cấp và viêm đă ̣c hiê ̣u với thu ̣ thể Dectin-1 cần nghiên cứ u Ở mô hình này , chuô ̣t sau khi đươ ̣c gây viêm sẽ đư ợc tiêm chất nghiên cứu Hàm lượng các chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham g iá vào các con đường tín hiệu viêm được theo dõi và đánh giá ,

ví dụ như cytokine, chemokine tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm(IL-10),

interferon, quá trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase (MAPKs), hay phản ứng ôxy hóa Từ đó tác du ̣ng của chất nghiên cứu đươ ̣c khẳng đi ̣nh Với mô hình

in vivo này, việc đánh giá tác du ̣ng của chất kháng viêm sẽ có hê ̣ thống , chính xác và chi tiết hơn ở mức phân tử

6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

6.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính gồm:

6.1.1 Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)

Đại diê ̣n cho nhóm này là aspirin , ibuprofen và naproxen Cơ chế kháng viêm của NSAID đươ ̣c phát hiê ̣n là do chúng ức chế sự tổng hợp PG Đích tác du ̣ng được biết rõ nhất của các chất này là cyclooxygenase (COX), là enzym có vai trò chuyển hóa axit arachidonic thành prostaglandins (PG) và thromboxane (TX) Mô ̣t số NSAID la ̣i có khả năng ức chế enzym liên quan đến sự bào mòn màng nhày da ̣ dày Nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh các chất NSAID này có tác du ̣ng ức chế sự hình thành PG ở màng nhày

dạ dày Tuy nhiên, salysilate, mô ̣t chất kháng viêm thuô ̣c nhóm này cũng có tác du ̣ng ức chế sự sinh tổng hợp của PG nhưng la ̣i không làm bào mòn màng nhày da ̣ dày như

aspirin Lý do tại sao lại có sự khác nhau về cơ chế tác dụng giữa aspirin và salisylate là vấn đề chưa giải thích được [31]

6.1.2.Các chất kháng viêm có bản chất steroid

Steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc mang một vòng 4 cycloalkane Thuộc về nhóm chất này có các chất corticoid Chúng tác dụ ng thông qua ứ c chế enzyme phospholipases A 2, là enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa phospholipase A 2 thành axit arachidonic Như vâ ̣y, cuối cùng thì corticoid cũng ức chế s ự sinh tổng hợp của PG, TX và LT Các chất kháng viêm có bản chất sterod ức chế phospholipase A 2

mô ̣t cách gián tiếp thông qua viê ̣c giải phóng các chất ức chế protein có tên go ̣i là

macrocortin, lipomodulin hay renocortin có khối lươ ̣ng phân tử đa ̣t khoảng 15, 30 và 40 kDa Đại diê ̣n nhó m chất này là lipocortin đã được tinh sa ̣ch , thương ma ̣i và được xem

là một trong những chất kháng viêm ma ̣nh [31] Các chất có bản chất steroid thường là phối tử của thu ̣ thể glucocorticoid

6.1.3 Các chất khác

Thuộc về nhóm này có vàng và colchicine Trong trường hợp của colchichine , chất này ức chế sự hình thành tinh thể urate trong khớp của bệnh nhân gout thông qua việc làm giảm sự tiết các chất chemotaxis của bạch cầu đa nhân và giải ph óng enzyme lysosom Colchicine có tác du ̣ng ức chế đă ̣c hiê ̣u sự giải phóng mô ̣t glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da Đây là mô ̣t chất chemotaxis của ba ̣ch cầu đa nhân đối với các bạch cầu trung tính và monocytes có khả n ăng thực bào các thể urate [31]

6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm nên khả năng mắc các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn do viêm là rất cao Cho đến nay, viêm nặng và

choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt Các trường hợp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng khắp cả trên thế giới và Việt Nam Trong nhiều trườ ng hơ ̣p, quá trình bị viêm kéo dài mà không đươ ̣c điều tri ̣ ki ̣p thời còn dẫn đến những bê ̣nh mãn tính nguy hiểm như tim ma ̣ch , tiểu đường, thấp khớp…

Việt Nam cũng là nước có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt về thực vật Theo thống kê của Viện Dược liệu thì tính đến năm 2000, nước ta có gần 4000 loài thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau, đó là chưa kể đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể được dùng làm thuốc[2] Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc để tìm ra nh ững chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất chống viêm mới có hiệu quả cao mà không gây

ra các phản ứng phụ Tuy vậy, có thể nói các nghiên cứu khoa học một cách có hệ thống

và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nước để phát triển thành các sản phẩm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng còn rất hạn chế

Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm, có thể nói rằng chúng ta chưa có các nghiên cứu sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất chống viêm Đây chính là cơ sở để phát triển các sản phẩm thuốc có thể thương mại được trên thị trường Việt Nam và quốc

tế Các nghiên cứu về viêm được thực hiện chủ yếu ở Viện Dược liệu Trung ương, các trường Đại học Dược, trường Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân y 103 Các nghiên cứu ở những cơ sở này mới chỉ dừng ở mức tạo được mô hình gây viêm thực nghiệm in

vivo cổ điển như đã trình bày ở trên Cụ thể là các thí nghiệm được thực hiện trên chu ột thông qua sử dụng chất gây viêm carrageenan để tạo mô hình viêm cấp dưới hình thức gây phù bàn chân chuột và gây viêm màng bụng chuột sau khi tiêm chất gây viêm này Việc gây viêm mãn tính sử dụng chất amiant để tạo u hạt trong cơ thể chuột Việc đánh giá tác dụng kháng viêm được thực hiện bằng cách đo thể tích bàn chân, đo thể tích dịch viêm ổ bụng, đo trọng lượng khối u hạt tách ra, đếm số lượng bạch cầu so với mẫu đối chứng, từ đó đánh giá tác dụng kháng viêm của các chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đánh