Luận văn nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng (vernonia amygdalina

Lời cảm ơn Luận văn tốt nghiệp cao học hồn thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Hoàng Lê Tuấn Anh trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt giúp đỡ với dẫn khoa học q giá suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể phịng Ứng dụng Triển khai Cơng nghệ - Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, đặc biệt TS Lê Cảnh Việt Cường, trực tiếp hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Việt Cường, chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu phát triển dược liệu Vernonia amygdalina Delile (cây đắng) tỉnh Thừa Thiên Huế định hướng ứng dụng” hỗ trợ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo thầy cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức khoa học chuyên ngành cho năm tháng qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè, người động viên, chia sẻ, ủng hộ suốt thời gian qua./ Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Lê Thị Liên Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Viết tắt H-NMR 13 C-NMR Tiếng Anh Diễn giải Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 ABTS 2,2'-Azino-bis (axit 3ethylbenzthiazoline-6sulfonic) A-549 Human lung carcinoma cell line Tế bào ung thư phổi người A2780 Human ovarian carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô buồng trứng người Bel-7402 Human endocervical adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô tuyến nội tiết người CC Column chromatography Sắc ký cột DPPH 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT ED50 Median effective dose Liều lượng ảnh hưởng đến 50% đối tượng thử nghiệm G6Pase Glucose 6-phosphatase HL-60 Human promyelocytic Tế bào ung thư máu cấp leukemia cell line người HeLa HeLa cell Tế bào ung thư cổ tử cung HepG2 Hepatocellilar carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô gan HMBC Heteronuclear multiple bond coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều tương tác HSQC Heteronuclear single quantum coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu L-1210 l-1210 cell line Tế bào ung thư bạch cầu NCI-661 Large cell lung carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô tế bào phổi lớn OD Optical density Mật độ quang học TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng HR-ESI-MS High resolution electronspray ionization mass spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử KB Human epidemoid carcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô người L-NMMA N-methylarginine T-47D Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú GM-CSF Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Yếu tố kích thích đại thực bào bạch cầu SMMC-7721 Human papillomavirusrelated endocervical adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô tuyến nội tiết liên quan đến papillomavirus người DLD-1 Colorectal adenocarcinoma cell line Tế bào ung thư biểu mô tuyến HSC4 Human oral squamous carcinoma cell line Tế bào ung thư vòm họng người Danh mục bảng Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất VA1 hợp chất tham khảo 30 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất VA2 hợp chất tham khảo 33 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR hợp chất VA3 hợp chất tham khảo (VA2) 40 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR hợp chất VA4 hợp chất tham khảo 43 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất VA5 hợp chất tham khảo 45 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR hợp chất VA6 hợp chất tham khảo 48 Bảng 3.11 Các hợp chất phân lập từ loài đắng 49 Bảng 3.12 Kết sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-amylase enzyme αglucosidase hợp chất 51 Bảng 3.13 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase αglucosidase theo nồng độ hợp chất phân lập 51 * Acarbose dùng làm chất đối chứng dương 52 Danh mục hình vẽ Hình 1.1 Hình ảnh số loài thuộc chi Vernonia “Nguồn: Thư viện điện tử Wikipedia ” Hình 2.1 Cây đắng (V amygdalina) 22 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ lồi V amygdalina 26 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất VA1 29 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất VA2 32 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất VA3 hợp chất tham khảo (VA2) 34 Hình 3.4 Phổ HR-ESI-MS hợp chất VA3 35 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR hợp chất VA3 35 Hình 3.6 Phổ 13C-NMR hợp chất VA3 36 Hình 3.7 Phổ HSQC hợp chất VA3 37 Hình 3.9 Phổ HMBC hợp chất VA3 38 Hình 3.10 Phổ NOESY hợp chất VA3 39 Hình 3.11 HPLC VA3 sau acid hóa 42 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất VA4 42 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất VA5 44 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất VA6 47 Phổ 1H-NMR hợp chất VA1 64 Phổ 13C-NMR hợp chất VA1 64 Phổ HMBC hợp chất VA1 65 Phổ HSQC hợp chất VA1 65 Phổ 1H-NMR hợp chất VA2 67 Phổ 13C-NMR hợp chất VA2 67 Phổ HSQC hợp chất VA2 68 Phổ HMBC hợp chất VA2 68 Phổ 13C-NMR hợp chất VA4 70 Phổ HMBC hợp chất VA4 71 Phổ 1H-NMR hợp chất VA5 73 Phổ 13C-NMR hợp chất VA5 73 Phổ HSQC hợp chất VA5 74 Phổ HMBC hợp chất VA5 74 Phổ 1H-NMR hợp chất VA6 76 Phổ 13C-NMR hợp chất VA6 76 Phổ HSQC hợp chất VA6 77 Phổ HMBC hợp chất VA6 77 MỤC LỤC MỤC LỤC 10 MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Vernonia 1.1.1 Phân loại chi Vernonia Việt Nam 1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Vernonia 1.2 Những nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học đắng (Vernonia amygdalina) 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 22 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 23 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase αglucosidase 24 2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 24 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase 25 2.3 Phân lập chất 25 2.3.1 Phân lập hợp chất từ mẫu dược liệu 25 2.3.2 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất 26 2.3.2.1 Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5αstigmastane 26 2.3.2.2 Hợp chất VA2: vernoniacum B 27 2.3.2.3 Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) 27 2.3.2.4 Hợp chất VA4: vernonioside B1 27 2.3.2.5 Hợp chất VA5: vernonioside B2 27 2.3.2.6 Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 29 3.1.1 Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5αstigmastane 29 3.1.2 Hợp chất VA2: vernoniacum B 32 3.1.3 Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) 34 3.1.4 Hợp chất VA4: vernonioside B1 42 3.1.5 Hợp chất VA5: vernonioside B2 44 3.1.6 Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone 47 CTPT: 50 M: 470 50 3.2 Hoạt tính sinh học chất phân lập 50 3.2.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase hợp chất phân lập từ đắng 50 3.2.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase theo nồng độ hợp chất phân lập 51 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.1.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 53 4.1.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 53 4.2 Kiến nghị 53 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sinh trưởng phát triển lồi thực vật Điều thấy rõ qua đa dạng số lượng chủng loại loài thực vật khác Theo thống kê Viện Dược liệu, nước ta có 5.000 lồi thực vật sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh Đây nguồn tài nguyên lớn việc nghiên cứu phát triển thuốc phục vụ cho việc chữa nhiều bệnh mà người phải đối mặt tim mạch, ung thư, tiểu đường, gout, alzheimer, … Do đó, hướng nghiên cứu, sàng lọc loại thảo dược có cơng dụng chữa bệnh nhằm tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao nhận quan tâm lớn từ nhà khoa học nước quốc tế Bệnh tiểu đường bệnh mãn tính thường gây nhiều biến chứng nguy hiểm người bệnh Là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối, mù lòa… Đái tháo đường xem nguyên nhân gây tử vong hàng đầu làm giảm tuổi thọ trung bình người từ đến 10 năm Theo Hiệp hội đái tháo đường giới (IDF), năm 2017, trung bình giây lại có người chết biến chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường 30 giây lại có bệnh nhân đái tháo đường có biến chứng bàn chân bị cắt cụt chi [1] Hiện nay, số lượng bệnh nhân đái tháo đường gia tiếp tục tăng nhanh tồn giới Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường nhà khoa học quan tâm Cây đắng (Vernonia amygdalina), gọi với tên khác khổ diệp thụ hay cúc ban cưu, loại thường sử dụng theo kinh nghiệm để chữa số bệnh cao huyết áp, táo bón, viêm dày, viêm gan… Tại Việt Nam, V amygdalina số bệnh nhân bệnh đái tháo đường sử dụng đạt số kết định Tuy nhiên, việc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường chủ yếu dựa theo kinh nghiệm truyền miệng, chưa có nghiên cứu tiến hành để 63 PHỤ LỤC HỢP CHẤT VA1 Công thức phân tử: C30H46O7 Khối lượng phân tử: 518 Phổ 1H-NMR Phổ 13C- NMR Phổ HMBC Phổ HSQC 64 Phổ 1H-NMR hợp chất VA1 Phổ 13C-NMR hợp chất VA1 65 Phổ HMBC hợp chất VA1 Phổ HSQC hợp chất VA1 66 PHỤ LỤC HỢP CHẤT VA2 Công thức phân tử: C38H58O13 Khối lượng phân tử: 722 Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HMBC Phổ HSQC 67 Phổ 1H-NMR hợp chất VA2 Phổ 13C-NMR hợp chất VA2 68 Phổ HSQC hợp chất VA2 Phổ HMBC hợp chất VA2 69 PHỤ LỤC HỢP CHẤT VA4 Công thức phân tử: C35H52O10 Khối lượng phân tử: 632 Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HMBC Phổ HSQC 70 Phổ 1H-NMR hợp chất VA4 Phổ 13C-NMR hợp chất VA4 71 Phổ HSQC hợp chất VA4 Phổ HMBC hợp chất VA4 72 PHỤ LỤC HỢP CHẤT VA5 Công thức phân tử: C36H52O12 Khối lượng phân tử: 676 Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HMBC Phổ HSQC 73 Phổ 1H-NMR hợp chất VA5 Phổ 13C-NMR hợp chất VA5 74 Phổ HSQC hợp chất VA5 Phổ HMBC hợp chất VA5 75 PHỤ LỤC HỢP CHẤT VA6 Công thức phân tử: C29H42O5 Khối lượng phân tử: 470 Phổ 1H-NMR Phổ 13C-NMR Phổ HMBC Phổ HSQC 76 Phổ 1H-NMR hợp chất VA6 Phổ 13C-NMR hợp chất VA6 77 Phổ HSQC hợp chất VA6 Phổ HMBC hợp chất VA6 ... αamylase α-glucosidase V amygdalina sinh trưởng Việt Nam Từ sở chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất steroid từ đắng (Vernonia amygdalina)” 5 CHƯƠNG... HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina) Cho đến nay, giới có số cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi V amygdalina (cây đắng) Các kết nghiên. .. (Mitsubishi Chem Ind Co., Ltd.) 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học hợp chất kết hợp xác định thông số vật lý với phương pháp phổ đại