Phân tích cấu trúc một số hợp chất phân lập từ cây bọ mắm (pouzolzia zelylanica l ) ở cao bằng

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGƠ THỊ NHƯ Ý PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY BỌ MẮM POUZOLZIA ZEYLANICA L Ở CAO BẰNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH Trang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ NHƯ Ý

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY BỌ

MẮM (POUZOLZIA ZEYLANICA (L)) Ở CAO BẰNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH

THÁI NGUYÊN - 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ NHƯ Ý

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY BỌ

MẮM (POUZOLZIA ZEYLANICA (L)) Ở CAO BẰNG

Ngành: Hoá phân tích

Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS KHIẾU THỊ TÂM

2 TS VŨ THỊ THU LÊ

THÁI NGUYÊN - 2023

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được thực hiện và hoàn thành tại phòng thí nghiệm Khoa Hoá học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên Trong quá trình làm luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn

đề tài khoa học TS Khiếu Thị Tâm - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi tốt nhất, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn chân thành tới tất cả các thầy cô giáo, người đã đem lại cho tôi những kiến thức bổ trợ, vô cùng có ích trong những năm học vừa qua Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo trường Đại học khoa học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Hóa học và các cán bộ nhân viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi thực hiện đề tài khoa học này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều

1H -1H ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spectrometry

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

HR-MS High Resolution - Mass Spectrometry Phổ khối phân giải cao

s: singlet d: doublet t: triplet m: multiplet dd: doublet of

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN………i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

MỤC LỤC……….iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tình hình nghiên cứu về cây Bọ mắm 2

1.1.1 Tổng quan về chi Pouzolzia 2

1.1.2 Tổng quan về cây Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica L.) 4

1.2 Tổng quan về các phương pháp hoá lý hiện đại được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 9

1.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại 9

1.2.2 Phổ hấp thụ quang (UV-Vis) 11

1.2.3 Phổ khối (MS) 12

1.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 14

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Hoá chất và thiết bị 20

2.2.1 Hoá chất 20

2.2.2 Thiết bị 20

2.3 Phân lập các hợp chất từ cây Bọ mắm 21

2.3.1 Quy trình xử lý và chiết mẫu 21

2.3.2 Quy trình phân tách các hợp chất 21

2.4 Phân tích và xác định cấu trúc của hợp chất 1-3 bằng các phương pháp phổ 23

2.4.1 Phân tích cấu trúc các hợp chất bằng phổ IR 23

2.4.2 Phân tích cấu trúc của các hợp chất bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 23

2.4.3 Phân tích cấu trúc của các hợp chất bằng phương pháp phổ khối 24

2.4.4 Số liệu của các hợp chất phân lập được từ cây Bọ mắm 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Phân tích cấu trúc của hợp chất (20S)-20-hydroxydammar-24-en-3-one (BM1) 26

3.2 Phân tích cấu trúc của hợp chất kaempferol (BM2) 31

3.3 Phân tích cấu trúc của hợp chất 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid (BM3) 35

3.4 Phân tích cấu trúc của hợp chất Astilbin (BM4) 37

KẾT LUẬN 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Pouzolzia ở Việt Nam 2

Bảng 1.2 Các đỉnh hấp thụ đặc trưng của một số liên kết trong hợp chất hữu cơ 10

Bảng 3.1 Số liệu phổ BM1 29

Bảng 3.2 Số liệu phổ của BM2 và kaempferol 34

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất BM4 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh về loài P sanguinea 2

Hình 1.2 Hình ảnh về loài P Hasski 2

Hình 1.3 Một số cấu trúc của các hợp chất phân lập từ loài Pouzolzia occidentalis 4

Hình 1.4 Một số cấu trúc của các hợp chất phân lập từ loài Pouzolzia indica 4

Hình 1.5 Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ Pouzolzia sanguinea 4

Hình 1.6 Hình ảnh cây Bọ mắm 5

Hình 1.7 Cấu trúc của một số flavonoid được phân lập từ cây Bọ mắm 6

Hình 1.8 Cấu trúc của một số hợp chất triterpenoid được phân lập từ cây Bọ mắm 7

Hình 1.9 Cấu trúc của một số lignan được phân lập từ cây Bọ mắm 7

Hình 1.10 Cấu trúc của các hợp chất khác được xác định từ Bọ mắm 8

Hình 1.11 Phổ hồng ngoại của benzene 10

Hình 1.12 Phổ UV-Vis của các hợp chất naphthalene, anthracene và tetracene 11

Hình 1.13 Phổ MS của hợp chất ethanol 13

Hình 1.14 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất pouzolignan N 13

Hình 1.15 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của pouzolignan N 15

Hình 1.16 Phổ 1H-NMR giãn của pouzolignan N 16

Hình 1.17 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) của pouzolignan N 17

Hình 1.18 Phổ HSQC của pouzolignan N 18

Hình 1.19 Phổ HMBC của pouzolignan N 18

Hình 1.20 Phổ COSY của pouzolignan N 19

Hình 2.1 Hình ảnh: a) cây Bọ Mắm thu thập ở Cao Bằng, b) thân cây Bọ mắm khô 20

Hình 2.2 Quy trình chiết cây Bọ mắm 21

Hình 2.3 Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane 22

Hình 2.4 Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate 23

Hình 3.1 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ cây Bọ mắm ở Cao Bằng 26

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM1 27

Hình 3.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM1 28

Hình 3.4 Phổ DEPT của hợp chất BM1 28

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học và tương tác chính HMBC (HC) 29

Hình 3.6 Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất BM2 31

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM2 32

Hình 3.8 Phổ DEPT của hợp chất BM2 32

Hình 3.9 Phổ HMBC của hợp chất BM2 33

Hình 3.10 Các tương tác chính trên phổ HMBC của BM2 33

Hình 3.11 Cấu trúc của hợp chất kaempferol 34

Hình 3.12 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM3 35

Hình 3.13 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM3 36

Hình 3.14 Phổ DEPT của hợp chất BM3 36

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của BM3 37

Hình 3.16 Phổ 1H-NMR của BM4 37

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của BM4 38

Hình 3.18 Phổ DEPT của BM4 38

Hình 3.19 Cấu trúc của hợp chất BM4 39

Hình 3.20 Phổ HSQC của hợp chất BM4 39

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa mưa điển hình ở miền Nam và thời tiết ôn hoà hơn ở miền Bắc với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi nên hệ thực vật rất đa dạng với hơn 19.357 loài trong đó có khoảng

4000 loài được sử dụng làm thuốc Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu và được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm do chúng an toàn với sức khoẻ, thân thiện môi trường Do đó, việc tách và phân tích cấu trúc của các hợp chất từ thực vật là một công việc bước đầu và vô cùng quan trọng cho các bước nghiên cứu tiếp theo Việc phân tích

và xác định cấu trúc là một quá trình phức tạp bằng cách sử dụng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ hấp thụ quang, cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối cho thông tin về các nhóm chức trong hợp chất cũng như cấu trúc của các hợp chất chưa biết

Chi Pouzolzia thuộc họ Gai (Urticaceae), có 37 loài, được phân bố nhiều ở vùng

nhiệt đới của các nước Đông Nam, Nam Á của Châu Á và những vùng nước ấm trên thế

giới Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica (L)) thuộc chi Pouzolzia được dân gian sử dụng để

điều trị các bệnh như cảm ho, hoặc ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi, viêm ruột Trên thế giới, nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid, lignan, terpenoid và steroid đã được phân lập từ cây Bọ mắm thể hiện hoạt tính sinh học đa dạng Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại Tuy nhiên, đến nay chưa có nghiên cứu nào công

bố về phân tích cấu trúc thành phần hóa học của cây Bọ mắm ở Việt Nam Do đó đề

tài “Phân tích cấu trúc một số hợp chất phân lập từ cây Bọ mắm (Pouzolzia zelylanica L.) ở Cao Bằng” có ý nghĩa khoa học và thực tiễn nhằm khẳng định cấu

trúc của các hợp chất cũng như đưa ra các phương pháp định lượng các hợp chất đồng thời làm sáng tỏ các cơ sở khoa học của cây thuốc để ứng dụng

Mục tiêu của đề tài:

 Phân tích cấu trúc của các hợp chất phân tách được từ cây Bọ mắm bằng các phương pháp hoá lý hiện đại

Nội dung nghiên cứu:

 Chiết và phân lập các hợp chất từ cây Bọ mắm

 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu về cây Bọ mắm

1.1.1 Tổng quan về chi Pouzolzia

Chi Pouzolzia (P.) thuộc họ Gai (Urticaceae), có 37 loài, thường phân bố ở vùng

nhiệt đới các nước Nam Á, Đông Nam châu Á và những vùng nước ấm trên thế giới

Theo thống kê của Phạm Hoàng Hộ, chi Pouzolzia có tới 6 loài ở Việt Nam (bảng 1.1) [1] Hình 1.1 và hình 1.2 lần lượt là hình ảnh về loài P sanguinea (Blume) Merr và P

hirta Hasski

Hình 1.1 Hình ảnh về loài P sanguinea Hình 1.2 Hình ảnh về loài P Hasski

Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Pouzolzia ở Việt Nam

1 P zeylancia L Benn Bọ mắm

2 P auriculata Wight Thuốc vòi tai

3 P elegans Thuốc vòi thanh

4 P sanguinea (Blume) Merr Bọ mắm rừng, Nhớt nháo

5 P hirta Hassk Thuốc vòi lông

6 P pentandra Benn Thuốc vòi ngũ hùng

Cho đến nay, có nhiều công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của

các loài thuộc chi Pouzolzia Đối tượng nghiên cứu về thành phần hoá học bao gồm

thân, lá, rễ, quả và hạt của các loài thuộc chi này Cấu trúc của các hợp chất phân lập

được từ các loài thuộc chi Pouzolzia rất đa dạng và phong phú gồm các lớp như các

hợp chất thuộc nhóm flavonoid, triterpenoid, steroid, lignan, rotenoid… Trong đó, các

hợp chất flavonoid, lignan và triterpenoid được phân lập nhiều nhất Năm 2010, Mohammed và các cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc của ba norlignan mới là 2-hydroxy-4-[4-hydroxyphenyl-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-3-(3,5-

dihydroxyphenyl) tetrahydrofuran (pouzolignan A) (1) và

1,4-dihyroxy-3-[4-hydroxyphenyl-(4-hydroxy-3methoxybenzyl)]-2-(3,5-dihydroxyphenyl)butane

(pouzolignan B) (2) và

4-hydroxy-4-[4-hydroxyphenyl-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)]-3-(3,5-dihydroxyphenyl)-2 methoxy tetrahydrofuran (3) từ phân

đoạn ethyl acetate của loài Pouzolzia occidentalis [2] Năm 2013, Chanyapat

Sangsuwon và cộng sự đã phân lập được hợp chất lanceolone và hợp chất friedelin (4), 28-hydroxy-3-fridelanone (5), 7-methoxy coumarin (6), 6,7-dimethoxy coumarin (7), scopoletin (8), methyl caffeate (9), sitosteryl glucoside (10) được phân lập từ loài

Pouzolzia indica [3] Từ loài Pouzolzia sanguinea, nhóm nghiên cứu đã phân lập được

các lignan và norlignan là pouzolignan N (11), pouzolignan O (12) pouzolignan F (13), pouzolignan G (14), pouzolignan H (15), pouzolignan L (16), pouzolignan D

(17), pouzolignan K (18), gnetifolin F (19) tetramethoxy-7′,9-epoxylignan-9′-ol-7-one (20), (7α,8α)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-β-D-glucopyranoside (21), (7α,8α)-dihydrodehydro-diconiferyl alcohol 9′-O-β-D-glucopyranoside (22), icariside E3 (23), icariside E5 (24) và các hợp chất

(7′S,8′R,8S)-4,4′-dihydroxy-3,3′,5,5′-khác gồm pouzobistilbene A (25), threo-guaicylglycerol--O-4’-coniferyl alcohol

(26), threo-guaicylglycerol--O-4’-dihyroconiferyl alcohol (27),

erythro-guaicylglycerol--O-4’-coniferyl alcohol (28) và erythro-guaicylglycerol-

-O-4’-dihyroconiferyl alcohol (29) [4-6] Một hợp chất isoflavon mới là hydroxy-2”,2”-dimethoxypyrano (3”, 4”,7,8) isoflavon (30) được phân lập bởi nhóm

5-methoxy-4’-nghiên cứu người Bangladesh phân lập được từ Pouzolzia indica [7] Từ loài

Pouzolzia zeylancia, có nhiều công bố về thành phần hoá học của các nhà nghiên cứu

trong và ngoài nước Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cấu trúc

của một số hợp chất được phân lập từ một số loài thuộc chi Pouzolzia được thể hiện ở

hình 1.3-1.5 Những kết quả trên đây cho thấy tiềm năng về các hợp chất hữu cơ được

phân lập từ các loài thuộc chi Pouzolzia L là rất lớn đặc biệt là loài Pouzolzia

zeylancia

Hình 1.3 Một số cấu trúc của các hợp chất phân lập từ loài Pouzolzia occidentalis

Hình 1.4 Một số cấu trúc của các hợp chất phân lập từ loài Pouzolzia indica

Hình 1.5 Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ Pouzolzia sanguinea

1.1.2 Tổng quan về cây Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica L.)

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Bọ mắm có tên khoa học là Pouzolzia zeylanica L Bọ mắm có tên gọi khác là

cây dòi ho, cỏ dòi, đại kích biển hay thuốc dòi vì được dân gian sử dụng để diệt dòi bọ trong mắm Trên thế giới, Bọ mắm phân bố ở vùng nhiệt đới, các nước Nam Á, Đông Nam Á và những vùng nước ấm Ở Việt Nam, cây Bọ mắm (hình 1.6) mọc hoang ở khắp mọi nơi ở nước ta, khắp các vùng từ Đồng Bằng tới trung du miền núi, từ miền Nam ra miền Bắc Cây mọc nhiều nhất ở ven rừng, đồng ruộng, ven đường và trong sân nhà Theo y học dân gian, Bọ mắm được sử dụng để chữa các bệnh như ho, viêm

họng, bệnh về phổi, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, bí tiểu tiện, đau răng, nấm và các bệnh về da Ngoài ra, Bọ mắm cũng được dùng để chữa rắn cắn, thông tiểu và thông sữa

Bọ mắm thuộc loại cây thân thảo, mọc sát nền đất Thân cây có lông bao phủ, chia làm nhiều nhánh Lá có màu xanh lục, hình trứng, phía đầu lá thon nhỏ, thường mọc kiểu

so le Hoa nhỏ, mọc thành chùm, nở quanh năm Quả hình trứng, có khía dọc thân quả

Hình 1.6 Hình ảnh cây Bọ mắm 1.1.2.2 Thành phần hoá học

Các kết quả về cấu trúc của các hợp chất phân lập từ cây Bọ mắm được phân tích bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ một chiều và hai chiều, phổ khối và phổ hấp thụ quang cho thấy các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, lignan, triterpenoid, steroid và rotenoid có trong cây Bọ mắm trong đó có nhiều hợp chất có cấu trúc mới được xác định

a Hợp chất flavonoid

Có rất nhiều hợp chất flavonoid mới bao gồm các phenylpropanoid được phân lập từ cây Bọ mắm Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Fu đã phân lập và phân tích, xác định được 14 hợp chất từ cây Bọ trong đó có các hợp chất thuộc nhóm flavonoid là

scopolin (31), scutellarein-7-O-α-L-rhamnoside (32), scopoletin (8), quercetin (33),

quercetin-3-O--D-glucoside (34), apigenin (35) và epicatechin (36) [8] Năm 2014,

Luo và các cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất là quercetin-3-O-

-D-rutinoside-7-O-α-L-rhamnoside (37), kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside (38), kaempferol (39) và

apigenin (35) [9] Năm 2015, Lujun Wang và các cộng sự cũng đã phân tích xác định cấu trúc của một flavonoid là kaempferol (39) 3,4-dihydro-5,7-dihydroxy-4-(4- hydroxyphenyl)coumarin (40) và quercetin (33) [10] Năm 2017, bốn flavonoid

glycoside được phân lập từ phân đoạn ethanol 60 % và được xác định cấu trúc bằng

các phương pháp phổ hiện đại là apigenin-6-C-β-L-arabinoside-8-C-β-D-glucoside

(41), apigenin-8-C-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside (42), robinin (43) và kaempferol-3, 7-O-α-L-dirhamnopyranoside (44) bởi nhóm nghiên cứu của Li

[11] Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Wang đã phân lập được 2 flavonoid từ loài này

là quercetin (33) và kaempferol (39) [12] Hình 1.7 thể hiện cấu trúc của một số

flavonoid được phân lập từ cây Bọ mắm

Hình 1.7 Cấu trúc của một số flavonoid được phân lập từ cây Bọ mắm

b Các hợp chất triterpenoid và steroid

Từ dịch chiết methanol của cây Bọ mắm, nhóm nghiên cứu của Brazendranath

Sarkar đã phân lập được 1 terpenoid là friedelin (4) [10] Năm 2012, Fu và các cộng sự

đã xác định được các triterpenoid gồm daucosterol (45), oleanolic acid (46), α -amyrin, 2α, 3α, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic (47), 2α-hydroxyursolic acid (48) [8] Năm

2015, Lujun Wang và các cộng sự cũng đã phân lập được stigmast-4-en-3-one (49), 

-sitosterol (50) [10] Hình 1.8 thể hiện cấu trúc của các hợp chất triterpenoid được phân

Hình 1.9 Cấu trúc của một số lignan được phân lập từ cây Bọ mắm

Năm 2015, 5 hợp chất lignan mới là pouzolignan F (13), pouzolignan G (14) , pouzolignan H (15), pouzolignan I (51) và pouzolignan J (52) được phân lập từ cây Bọ

mắm và được xác định cấu trúc bởi nhóm nghiên cứu của Chen [13] Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Wang Lujun đã phân lập được một hợp chất lignan trong cây Bọ mắm

(P zeylanica) là syringaresinol (53) [10] Ngoài ra, Zhong và các cộng sự đã phân lập

được hai norlignan mới là pouzolignan L (16) và pouzolignan M (54), pouzolignan D (17) và pouzolignan K (18) [8] Từ phân đoạn ethyl acetate, nhóm nghiên cứu của MO

đã phân lập và xác định được cấu trúc của 10 hợp chất gồm 1 lignan mới là

isopouzolignan K (55) và pouzolignan K (18) [14] Năm 2023, một lignan mới là

pouzolignan P (56) cùng với 14 hợp chất gồm 4 lignan isopouzolignan K (55), gnemontanins E (57), gnetuhainin I (58) và styraxligolide D (59) được phân lập từ rễ

của cây Bọ mắm [15]

d Các hợp chất khác

Ngoài các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, triterpenoid, lignan thì nhiều hợp chất khác gồm các dẫn xuất của phenol, các hợp chất chứa nitơ cũng được phân lập, xác định cấu trúc Hình 1.10 thể hiện cấu trúc của một số hợp chất khác được phân lập từ cây này

Hình 1.10 Cấu trúc của các hợp chất khác được xác định từ Bọ mắm

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy cây Bọ mắm có thể tiếp tục được khai

thác về thành phần hoá học và nghiên cứu về cấu trúc của chúng Các hợp chất là

N-[2-(3-hydroxy-4- methoxyphenyl)-2

hydroxyethyl]-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide (60), sinapaldehyde (61), 14,16-hentriacontanedione (62) dipentylphthalate (63), undecyl ferulate (64) được phân lập và xác định cấu trúc bởi nhóm nghiên cứu

của Wang Lujun [10] Năm 2014, Luo và các cộng sự đã phân lập được (6R, oxo-α-ionol-9-O-β-D-glucopyranoside (65), grasshopper ketone (66), benzyl-O-β-D- glucopyranoside (67), 3,4,5-trimethylphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside (68) và 1,2-

9R)-1-benzenedicarbonic acid (69) [9] Năm 2015, indolyl-3-carboxylic acid (70) và uracil (71) là hai hợp chất được phân lập từ cây Bọ mắm bởi nhóm nghiên cứu của Chen

[13] Năm 2017, Li và các cộng sự đã xác định được cấu trúc của hợp chất 6,

7-dimethyl-1-(2, 3, 4, 5-tetrahydroxypentyl)-1, 4-dihydroquinoxaline-2, 3-dione (72) từ

cây Bọ mắm [11] Từ phân đoạn ethyl acetate, nhóm nghiên cứu của MO đã phân lập

và xác định được cấu trúc của saropeptide (73), dehydrocuciferol (74),

p-hydroxybenzoic acid (75), isovanetic acid (76), protocatechuic acid (77), syringic acid (78), protocatechuic aldehyde (79) và ethyl protocatechuate (80) [14] Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Wang đã xác định được cấu trúc của hợp chất N-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-2-hydroxyethyl]-3-(4-methoxyphenyl)

prop-2-enamide (81) bằng cách phân tích phổ hồng ngoại và cộng hưởng từ [12] 1.2 Tổng quan về các phương pháp hoá lý hiện đại được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Ngày nay, có hàng nghìn hợp chất mới trong hàng triệu các hợp chất hữu cơ được tổng hợp và phân lập từ thiên nhiên Cấu trúc của chúng được phân tích và xác định bằng các phương pháp phổ hoá lý hiện đại bao gồm phổ hấp thụ quang, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều, phổ khối,…Cơ sở của phương pháp phổ là sự tương tác của các bức xạ điện tử với các phân tử vật chất dẫn đến phân tử hấp thu hay bức xạ năng lượng do sự kích thích các điện tử hay các liên kết hoặc các hạt nhân nguyên tử trong phân tử [16] Mỗi phương pháp phổ cung cấp thông tin cần thiết để phân tích cấu trúc của các hợp chất Dựa vào kết quả phân tích các dữ liệu của các loại phổ giúp cho các nhà khoa học xác định một cách chính xác cấu trúc của các hợp chất hữu cơ cần xác định

1.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại (IR) là công cụ hữu ích, đơn giản để xác định sự có mặt của các nhóm chức, các liên kết có mặt trong các hợp chất hữu cơ, vô cơ và vật liệu Các nhóm chức khác nhau sẽ tạo ra sự hấp thụ liên kết ở các bước sóng và cường độ khác nhau trên phổ hồng ngoại do đó phổ hồng ngoại được sử dụng để phân tích các liên kết đặc trưng đồng thời xác định sự có mặt của các nhóm chức trong mẫu đo [16, 17] Nhận biết vị trí xảy ra hiện tượng hấp thụ do các nhóm chức chung tạo ra sẽ giúp chúng ta giải thích phổ hồng ngoại

Nguyên tắc của phương pháp phổ hồng ngoại (IR) là dựa trên hiện tượng các phân tử của các hợp chất được chiếu bởi bức xạ hồng ngoại sẽ bị kích thích từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn [16] Khi phân tử bị kích thích sẽ

xuất hiện 2 loại dao động gồm dao động hoá trị, ký hiệu là  và dao động biến dạng,

ký hiệu là  [16] Sự hấp thụ này là đặc trưng cho bản chất của các liên kết hóa học trong phân tử Máy quang phổ hồng ngoại thông thường dùng để ghi phổ trong vùng

từ 4000 đến 400 cm-1 Bảng 1.2 liệt kê các vị trí và cường độ của các chất hấp thụ được tạo ra bởi các nhóm chức năng điển hình Hình 1.11 là phổ hồng ngoại của benzene

Hình 1.11 Phổ hồng ngoại của benzene

Các đỉnh hấp thụ nằm trong vùng nhóm chức có số sóng từ 4000 – 1600 cm-1

đặc trưng cho dao động của các liên kết O-H, N-H, C=O, C=N, C=C Vùng phổ có số sóng từ 1500 đến 400 cm-1 đặc trưng cho nhiều dao động nên khá phức tạp để xác định đỉnh hấp thụ đặc trưng cho liên kết nào trong vùng này nên vùng này được gọi là vùng vân tay và thường dùng để nhận dạng toàn phân tử

Bảng 1.2 Các đỉnh hấp thụ đặc trưng của một số liên kết trong hợp chất hữu cơ

7 N-H 3300-3350 Trung bình

Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) có độ nhạy cao, nhờ kỹ thuật biến đổi Fourier, các tín hiệu rất yếu được tách ra khỏi các tín hiệu nhiễu của môi trường [16]

1.2.2 Phổ hấp thụ quang (UV-Vis)

Trong vùng quang phổ tử ngoại và khả kiến, sự hấp thụ của các phân tử phụ thuộc vào cấu trúc electron của chúng Khi đó, các electron bị kích thích sẽ nhảy từ orbital có mức năng lượng thấp lên các orbital có mức năng lượng cao hơn gây ra sự hấp thụ năng lượng và được lượng tử [16] Cực đại hấp thụ (max) và cường độ hấp thụ

max là hai đại lượng đặc trưng được ghi nhận trên phổ UV-Vis của các hợp chất hữu

cơ Hình 1.12 là phổ UV-Vis của các hợp chất naphthalene, anthracene và tetracene

Hình 1.12 Phổ UV-Vis của các hợp chất naphthalene, anthracene và tetracene

Hầu hết các hợp chất hữu cơ đều trong suốt với bức xạ năng lượng tương đối cao, tạo thành phần tử ngoại (200 - 400 nm) và khả kiến (400 - 700 nm) của phổ điện

tử do đó hầu hết các chất hữu cơ xuất hiện không màu trong dung dịch Điều này là do các electron trong các liên kết  của các phân tử hữu cơ đòi hỏi các bước sóng có năng lượng cao hơn để kích thích chúng lên mức năng lượng cao hơn tiếp theo Tuy nhiên, các electron trong liên kết  có thể được nâng lên mức năng lượng cao hơn bằng tia cực tím cung cấp thông tin cấu trúc hữu ích cho các phân tử có liên kết  Các hợp chất hữu cơ có chứa các hệ liên hợp ảnh hưởng lẫn nhau và cho phổ UV-Vis với max lớn

hơn nhiều so với các hợp chất hữu cơ có hệ liên hợp đứng riêng biệt Các hợp chất hữu

cơ có các hệ liên hợp diene, polyene và hợp chất carbonyl liên hợp luôn hấp thụ với cường độ mạnh trong vùng UV-Vis trong khi đó các hợp chất thơm hấp thụ với cường

độ từ trung bình đến mạnh bức xạ điện tử trong vùng UV-Vis [16] Phổ UV-Vis của một phân tử hữu cơ bị ảnh hưởng đáng kể bởi hệ liên hợp Khi số lượng liên kết  liên hợp tăng lên, phổ UV-Vis cho thấy sự hấp thụ ánh sáng ở nhiều bước sóng khác nhau hơn tức là quang phổ xuất hiện nhiều đỉnh hấp thụ hơn và ánh sáng có bước sóng dài hơn được hấp thụ Dựa vào cực đại hấp thụ max trên phổ UV-Vis có thể biết được các loại liên kết trong phân tử các hợp chất hữu cơ Nếu max < 150 nm thì phân tử hợp chất hữu cơ chỉ có loại liên kết σ của hợp chất no, nếu max > 150 nm thì phân

tử đó có liên kết bội, trong khi max = 200 – 260 nm thì phân tử đó có thể có vòng benzene còn nếu max >280 nm thì hợp chất hữu cơ đó có hệ liên hợp và max càng lớn thì hệ liên hợp càng dài Do dó, phổ UV-Vis mang lại nhiều thông tin cho các phân tử có liên kết  liên hợp

1.2.3 Phổ khối (MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ khối là ở áp suất và nhiệt độ thích hợp, các hợp chất hữu cơ bay hơi và chuyển thành thể khí, sau đó ion hoá các phân tử khí đó, cuối cùng là phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích Các ion hình thành có khối lượng m, điện tích z, tỷ số m/z được gọi là số khối [17] Các ion được phát hiện bởi một cơ chế có khả năng phát hiện các hạt tích điện và kết quả được hiển thị dưới dạng phổ khối Từ khối lượng và độ phong phú của các đỉnh trong phổ khối, các nhà khoa học có thể xác định chính xác khối lượng của phân

tử đang được phân tích và thu được manh mối về cấu trúc phân tử Hình 1.13 là phổ khối của hợp chất ethanol

Quá trình ion hoá là quá trình bắn phá các phân tử trung hoà thành các ion phân

tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và gốc Cấu trúc của hợp chất, năng lượng bắn phá và phương pháp bắn phá quyết đinh đến sự phã vỡ này Có nhiều phương pháp khác nhau để ion hoá như phương pháp va chạm điện tử (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp ion hóa phun điện (ESI) [17] Dựa vào kết quả phổ khối kết hợp với dữ liệu thu được từ phổ 1H- và 13C-NMR cho phép dự đoán được công thức phân tử của các hợp chất hữu cơ

Hình 1.13 Phổ MS của hợp chất ethanol

Phổ khối phân giải cao (HR-MS) cho biết chính xác khối lượng của phân tử từ

đó có thể xác định được công thức phân tử hợp chất nghiên cứu do phổ này ghi nhận giá trị m/z đến 4 số lẻ Hình 1.14 là phổ HR-ESI-MS của hợp chất pouzolignan N

được phân lập từ loài Pouzolzia sanguinea

Hình 1.14 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất pouzolignan N

Công thức phân tử của hợp chất pouzolignan N là C28H32O9 được xác định bằng phân tích HR-ESI-MS, cho thấy peak ion giả phân tử ở m/z 547.1748 [M+Cl]-

1.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là hiện tượng một nguyên tử hạt nhân nằm trong vùng từ trường hấp thu hoặc phát xạ một bức xạ điện từ Cơ sở của phương pháp dựa trên sự tương tác của từ trường riêng của các hạt nhân có từ tính như 1H, 13C, 19F,

31P với từ trường bên ngoài trên nguyên tắc các hạt nhân của cùng nguyên tố có mật độ điện tích khác nhau sẽ cộng hưởng ở các vùng từ trường khác nhau [16, 17] Dung môi

sử dụng để ghi phổ NMR phải chứa những hạt nhân không có từ tính như CD3Cl3,

CD3OD, DMSO,… Phổ NMR là phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại, hữu hiệu và được ứng dụng rộng rãi để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên Việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều (1D)

và hai chiều (2D), phổ MS, IR cho thông tin chính cho việc xây dựng khung và xác định chính xác cấu trúc của các phân tử Độ chuyển dịch hóa học (δ) và hằng số tác

spin – spin (J) là hai thông số đặc trưng của phổ NMR được sử dụng để phân tích cấu

trúc các hợp chất hữu cơ [18]

Độ chuyển dịch hoá học là đại lượng đặc trưng cho khả năng cộng hưởng so với

từ trường ngoài của một nguyên tố hoặc một nhóm nguyên tố tương đương [18, 19] Mỗi hạt nhân trong phân tử có một vị trí khác nhau nên độ chuyển dịch hoá học của mỗi hạt nhân sẽ khác nhau Độ dịch chuyển hoá học 1H và 13C lần lượt nằm trong thang 0-12 ppm và 0-250 ppm [18]

Hằng số tương tác spin-spin: Các hạt nhân của các proton có từ tính ở cạnh nhau tương tác với nhau thông qua các electron liên kết Sự tương tác này làm tín hiệu cộng hưởng của proton bị tách thành nhiều tín hiệu Sự tách tín hiệu cộng hưởng đó

gọi là tương tác spin – spin [16, 17] Hằng số tương tác J phụ thuộc vào bản chất của hai hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất của liên kết giữa hai hạt nhân Hằng số J giảm khi số liên kết giữa hai hạt nhân tăng Hằng số J được xác định dựa vào khoảng

cách giữa các tín hiệu bị tách, với đơn vị là Hz

1.1.4.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Cơ sở của phương pháp phổ 1H-NMR là dựa trên sự cộng hưởng của hạt nhân nguyên tử hydrogen trong từ trường khi hấp thụ sóng radio Phổ 1H-NMR là một trong những công cụ hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ Phổ 1H-NMR cho biết số lượng H và sự có mặt của các nhóm nguyên tử có trong phân tử Ngoài ra,

dựa vào giá trị δ cho biết H liên kết với C no, không no, thơm hay dị tố, dựa vào cường độ tín hiệu cho biết số lượng nguyên tử H gây ra tín hiệu, dựa vào hình dạng

của tín hiệu bao gồm số lượng, cường độ tín hiệu và giá trị J cho biết vị trí tương đối

của các nhóm nguyên tử mang H [20] Hình 1.15 và 1.16 lần lượt là phổ 1H-NMR và phổ 1H-NMR giãn của pouzolignan N

Hình 1.15 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) của pouzolignan N

Phổ 1H-NMR của hợp chất pouzolignan N gồm 1 tín hiệu singlet của nhóm methyl tại H 1.87 (3H, s, CH3CO), 3 nhóm methoxy tại H 3.92 (3H, s, 3’-OCH3), 3.79(3H, s, 3”-OCH3), 3.76 (3H, s, 4”-OCH3) và nhóm phenyl thế 1, 3, 4 tại H 7.04

(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.83 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5’), 6.96 (1H, dd, J = 2.0 & 8.0

Hz, H-6’), 6.89 (1H, brs, J = 2.0 Hz, H-2”), 6.81 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-5” và H-6”)

Hình 1.16 Phổ 1 H-NMR giãn của pouzolignan N 1.1.4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)

Trong tự nhiên, nguyên tử 13C chỉ chiếm tỉ lệ 1.1% nhưng hạt nhân đồng vị 13C

có từ tính nên được sử dụng để ghi phổ NMR Hơn nữa, tất cả các hợp chất hữu cơ đều chứa nguyên tử carbon nên phổ 13C-NMR có ý nghĩa quan trọng trong xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phổ 13C-NMR cho biết số lượng carbon có trong phân tử đồng thời dựa vào độ chuyển dịch hoá học để quy kết loại carbon có trong phân tử từ

đó dự đoán các mảnh cấu trúc có thể có trong phân tử [19] Hình 1.17 là phổ 13C-NMR của pouzolignan N Phổ 13C-NMR của pouzolignan N gồm các tín hiệu tương ứng với

28 carbon Trong đó, 1 carbon carbonyl và 1 nhóm methyl (C 172.7 và 20.8) chỉ ra sự

có mặt của một nhóm acetyl 18 nguyên tử carbon thơm (C 102.1 đến 159.2) cho thấy

sự có mặt của 3 vòng thơm

Hình 1.177 Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) của pouzolignan N

1.1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều là một trong những công cụ hiệu quả, cho phép xây dựng khung cấu trúc một cách chính xác, bổ sung các dữ liệu và khẳng định các quy kết trong phổ 1D-NMR đã được thực hiện ở các bước trước đó Các phổ 2D-NMR gồm phổ HSQC, HMBC, COSY, NOESY, …[21] Phổ HSQC cho biết proton liên kết trực tiếp với carbon nào Phổ HMBC thể hiện tương tác xa (hai đến ba liên kết) giữa proton và carbon từ đó có thể xác định được vị trí liên kết của các nguyên tử hay nhóm nguyên tử trong phân tử Phổ COSY cho biết thông tin về các tương tác giữa các proton với nhau, các proton này liên kết với cùng một carbon hoặc với carbon liền kề từ đó có thể ghép nối lại giữa các phần của phân tử với nhau Phổ NOESY thể hiện các tương tác không gian của các proton có khoảng cách không gian nhỏ hơn 4 Å,

từ đó có thể dự đoán cấu trúc không gian của phân tử Hình 1.18, 1.19 và 1.20 là phổ HSQC, HMBC và COSY của hợp chất pouzolignan N

Hình 1.188 Phổ HSQC của pouzolignan N

Hình 1.19 Phổ HMBC của pouzolignan N

Hình 1.20 Phổ COSY của pouzolignan N

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica L.) thuộc chi Pouzolzia, ký hiệu

BM20220811 được thu thập ở huyện Hoà An, tỉnh Cao Bằng vào tháng 8 năm 2022 (hình 2.1) Tên Khoa học do PGS.TS Trần Huy Thái, Phòng Tài nguyên thực vật,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật xác định Cây bọ mắm (cây thuốc dòi) là loại cỏ

có cành mềm, thân có lông Lá mọc so le, có khi mọc đối có lá kèm, hình mác, hẹp, trên gân và 2 mặt đều có lông nhất là ở mặt dưới, lá dài 4-9cm, rộng 1,5-2,5cm Có 3 gân xuất phát từ cuống Cuống dài 5mm có lông trắng Cụm hoa đơn tính mọc thành xim co, ở kẽ lá có các hoa không cuống Quả hình trứng nhọn, có bao hoa có lông

Hình 19 Hình ảnh: a) cây Bọ Mắm thu thập ở Cao Bằng, b) thân cây Bọ mắm khô

2.2 Hoá chất và thiết bị

2.2.1 Hoá chất

Các dung môi hữu cơ dùng để chiết mẫu, khảo sát sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột

như dichloromethane, n-hexane, methanol, ethyl acetate, chloroform, ethanol phải được

cất lại trước khi sử dụng Sắc ký bản mỏng là bản nhôm tráng sẵn silica gel 60F254 độ dày 0,2 mm của hãng Merck Silica gel loại 60G dùng để chạy cột sắc ký có kích thước hạt 0.043-0.063 mm của hãng Merck

2.2.2 Thiết bị

Phổ hồng ngoại được đo trên máy Perkim Elmer UATR Two của Khoa Hoá học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz của viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ khối ESI-MS được ghi trên thiết bị Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy cất quay chân không với bộ làm lạnh R-100 của Hãng Buchi, Thụy Sĩ của Khoa Hoá học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên

2.3 Phân lập các hợp chất từ cây Bọ mắm

2.3.1 Quy trình xử lý và chiết mẫu

Mẫu cây Bọ mắm được rửa bằng nước cất 2 lần, hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 - 60 oC tới khi khô Quy trình chiết được thể hiện ở hình 2.2

Hình 20 Quy trình chiết cây Bọ mắm

1 kg mẫu thân và lá cây Bọ mắm khô được nghiền nhỏ rồi chiết 3 lần trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng Dịch chiết thu được sau khi lọc được loại bỏ dung môi bằng phương pháp cất quay chân không thu được cặn tổng (120 g) Cặn

chiết tổng này phân bố trong nước và được chiết lần lượt với các loại dung môi hexane, ethyl acetate thu được các cặn tương ứng là n-hexane (40 g), cặn chiết ethyl

n-acetate (24 g) và cặn chiết methanol (55 g)

2.3.2 Quy trình phân tách các hợp chất

Các hợp chất hữu cơ sau khi được phân tách từ các loài bằng các phương pháp sắc ký cột silica gel, sephadex, phương pháp kết tinh lại…được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Quá trình chạy sắc ký được thực hiện bằng các hệ

dung môi thích hợp

Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane được thể hiện ở hình 2.3

Hình 213 Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane

35 g cặn chiết n-hexane được tách gradient bằng sắc ký cột silica gel, hệ dung môi rửa giải là n-hexane: EtOAc (0-100% EtOAc) thu được 9 phân đoạn ký hiệu là

BMH1-BMH9 Phân đoạn BMH4 (250 mg) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel

với hệ dung môi ban đầu là n-hexane : EtOAc (9:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ

(BMH4.1-BMH4.5) Phân đoạn BMH4.3 tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột silica

gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexane : CH2Cl2 (5:1, v/v) thu được hợp chất sạch

(20S)- 20-hydroxydammar-24-en-3-one (7.5 mg, BM1), dạng bột màu trắng, nhiệt độ

nóng chảy 187–188 °C, có Rf = 0.35 (hệ dung môi n-hexane: EtOAc, 2:1, v/v) Phân đoạn BMH3 được phân tách trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n-

hexane : EtOAc (7: 1, v/v) thu được hợp chất kaempferol (9 mg, BM2), dạng bột màu

vàng, nhiệt độ nóng chảy 277-278 oC, có Rf = 0.35 (hệ dung môi n n-hexane: EtOAc

7:1, v/v)

Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate được thể hiện trên