Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyphenol glycoside từ cây fissistigma

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGƠ THỊ THANH THÚY PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP Trang 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGƠ THỊ THANH THÚY

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ THANH THÚY

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP

CHẤT POLYPHENOL-GLYCOSIDE TỪ CÂY FISSISTIGMA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ THANH THÚY

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP

CHẤT POLYPHENOL-GLYCOSIDE TỪ CÂY FISSISTIGMA

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm

Thế Chính, PGS.TS Phạm Thị Thắm đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình học tập và chỉ bảo, truyền đam mê nghiên cứu cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, hai thầy cô đã tận tình hướng dẫn để

em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của đề tài nafosted mã số 104.01-2019.22 do PGS.TS Phạm Thị Thắm làm chủ nhiệm đề tài

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn của mình tới gia đình, người thân và bạn bè của em đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận văn

Ngô Thị Thanh Thúy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Các phương pháp phổ hiện đại xác định cấu trúc 3

1.1.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 3

1.1.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 8

1.2 Chi Fissistigma 10

1.3 Định hướng nghiên cứu 13

Chương 2 THỰC NGHIỆM 14

2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị 14

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất và dung môi 14

2.1.3 Khảo sát điều kiện tách chất bằng sắc ký lớp mỏng 15

2.1.4 Xác nhận cấu trúc 15

2.2 Chuẩn bị mẫu các hợp chất thiên nhiên 16

2.2.1 Tách chiết các lớp chất thiên nhiên 16

2.2.2 Tách các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký 17

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Mục tiêu của luận văn 23

3.2 Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu 23

3.3.1 Chiết các lớp chất theo độ phân cực tăng dần của dung môi………20

3.2.2 Kết quả chuẩn bị mẫu FTS 17B, PT21C, DI10a và CCA32A………21

3.3 Kết quả phân tích cấu trúc của các hợp chất………22

3.3.1 Kết quả phân tích cấu trúc của hợp chất FTS 17B………23

3.3.2 Kết quả phân tích cấu trúc của hợp chất PT21C………29

3.3.3 Kết quả phân tích cấu trúc của hợp chất DI10a……… ……36

CI Phương pháp ion hóa hóa học

FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh

GC Phương pháp sắc ký khí

HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

SKLM Sắc kí lớp mỏng

TMS Chất chuẩn

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình phân tách các lớp chất thiên nhiên từ cây Fissistigma

balansae……… 15

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập mẫu FTS17B………16

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập mẫu PT21C……… 17

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ phân lập mẫu BI10a và CCA32B………18

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tính chất của hạt nhân trong từ trường ngoài 4

Hình 1.2 Mô tả sự hình thành hằng số chắn 5

Hình 1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR của paracetamol 5

Hình 1.4 Hằng số tương tác spin-spin J 6

Hình 1.5 Cách xác định hằng số tương tác spin-spin (J) 6

Hình 1.6 Hằng số J ứng dụng phân tích cấu hình của axit betulinic 7

Hình 1.7 Phổ khối lượng của 3,4-dimethoxyacetophenone 8

Hình 3.1 Phổ 1H- NMR của hợp chất FTS17B 23

Hình 3.2 Phổ 1H- NMR giãn của FTS17B 24

Hình 3.3 Phổ 13C-NMR của FTS17B 26

Hình 3.4 Hình 3.4 Phổ HSQC của FTS17B 27

Hình 3.5 Phổ giãn 13C-NMR của PT21C 30

Hình 3.6 Phổ giãn HMBC của hợp chất PT21C 30

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của hợp chất PT21C 32

Hình 3.8 Phổ HMBC của hợp chất PT21C 34

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của hợp chất DI10a……… 37

Hình 3.10 Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất DI10a……… 37

Hình 3.11 Phổ 13C của hợp chất DI10a……… 38

Hình 3.12 Phổ HMBC của hợp chất DI10a……… 39

Hình 3.13 Phổ 1H-NMR của hợp chất CCA32B……… … 41

Hình 3.14 Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất CCA32B……… 42

Hình 3.15 Phổ 13C của hợp chất CCA32B……… …42

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Bảng dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân của FTS17B 28

Bảng 3.2 Dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân của PT21C 35

Bảng 3.3 Dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân của DI10a 40

Bảng 3.4 Dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất CCA32B 43

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Do các hợp chất thiên nhiên có nhiều ứng dụng trong mọi lĩnh vực của đời sống xã hội, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược, thực phẩm và thực phẩm chức năng Phần lớn các hợp chất thuốc và các thực phẩm chức năng hiện nay đều có nguồn từ thiên nhiên Ngoài ra, các hợp chất thiên nhiên thường có ít độc tính và nguồn nguyên liệu lại dễ kiếm, dễ tái sinh

sử dụng, có khả năng phát triển thành các ngành công nghiệp bền vững Tuy nhiên, các hợp chất thiên nhiên thường có cấu trúc phức tạp, với nhiều mảng cấu trúc, nhiều trung tâm lập thể phức tạp với cấu hình không gian đa dạng, nên việc phân tích cấu trúc các hợp chất thiên nhiên cần nhiều kết hợp nhiều công cụ phân tích cấu trúc khác nhau Nhiệm vụ phân tích cấu trúc này là dữ liệu đầu vào quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng sau này của các hợp chất thiên nhiên

Hiện nay, có nhiều phương pháp hóa lý khác nhau để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Kết quả phân tích thường tổ hợp của nhiều phương pháp cho biết các thông tin về nhóm chức như phổ IR, về công thức phân tử như phổ MS, về khung cấu trúc như NMR, về không gian cấu trúc như các phổ 2 chiều Các dữ liệu này sẽ tổ hợp lại bổ sung các thông tin cho nhau để cuối cùng nhà khoa học

có thể quy gán chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất

Chi Fissistigma có nhiều loài làm dược liệu quý có trong nhiều bài

thuốc dân gian của các dân tộc sinh sống ở Đông Nam Á, Trung Quốc và Ấn

độ để điều trị nhiều loại bệnh thông thường Các công trình nghiên cứu về

hoạt tính sinh học gần đây cho thấy, chi Fissistigma có nhiều hoạt tính sinh

học lý thú như kháng khuẩn, nấm, chống oxy hóa, đặc biệt là kháng viêm và chống ung thư Do đó, chi này là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nghiên

2

cứu phát triển thuốc Luận văn thạc sỹ này tập trung vào phân tích cấu trúc

hóa học của các hợp chất thiên nhiên polyphenol-glycoside từ cây Fissistigma

balansae bằng các phương pháp phổ hiện đại như NMR, MS nhằm khẳng

định cấu trúc không gian phức tạp của các hợp chất này để có những dữ liệu

đầu cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa dược

3

TỔNG QUAN 1.1 Các phương pháp phổ hiện đại xác định cấu trúc

nhân khi được đặt trong từ trường ngoài Chỉ có hạt nhân có spin hạt nhân là

số lẻ (đồng vị lẻ) mới bị cộng hưởng bởi từ trường bên ngoài Các hạt nhân khác của các nguyên tố khác nhau thì cộng hưởng ở các từ trường khác nhau Các hạt nhân của cùng một nguyên tố nhưng có mật độ điện tử khác nhau (tham gia vào các nhóm liên kết khác nhau) thì cộng hưởng ở các từ trường khác nhau Cường độ của tín hiệu thể hiện số lượng các nguyên tố tương đương về lớp electron hay tương đương về mật độ điện tích Sự tách tinh vi của các đỉnh tín hiệu thể hiện sự tương tác khác nhau hay thể hiện không gian phức tạp của các nhóm nguyên tố tham gia cộng hưởng Kết quả của phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho chúng ta các dữ liệu chính để xây dựng khung cấu trúc của các hợp chất cần nghiên cứu [1-4]

Ví dụ sau đây sẽ mô tả nguyên lý của phương pháp này, ở điều kiện bình thường hạt nhân có điện tích và tích điện dương, hạt nhân luôn luôn chuyển động xung quanh trục của nó nghĩa là điện tích này chuyển động xung

4

quanh trục và tạo thành một trường riêng (µ⃗ ) của hạt nhân Tiếp tục, đặt hạt nhân này vào vào một từ trường ngoài (𝐵⃗ ) thì sinh ra một lực làm lệch hướng momen từ của hạt nhân [4] Nếu cố định tần số của từ trường ngoài (𝐵⃗ ) thì các nguyên tố khác nhau sẽ có giá trị cộng hưởng này khác nhau

Hình 0.1 Mô tả tính chất từ của hạt nhân

Như mô tả ở trên, thì đại lượng đặc trưng cho khả năng cộng hưởng của

một nguyên tố hoặc một nhóm nguyên tố tương đương được gọi là độ chuyển

dịch hóa học  (ppm): Nguyên nhân xuất hiện giá trị này là các hạt nhân khác

nhau có mật độ điện tử hay lớp vỏ electron khác nhau, nói cách khác là hằng

số che chắn (σ) khác nhau, vì thực tế từ trường ngoài B0 tới được hạt nhân đã

bị hao hụt chỉ còn B’vì tương tác với từ trường của các electron (Be), do vậy các nguyên tố khác nhau sẽ cộng hưởng ở các từ trường khác nhau Trong trường hợp cùng một nguyên tố thì chúng tham gia vào các nhóm chức khác nhau, nhóm liên kết khác nhau thì mật độ điện tử hay hằng số che chắn (σ) cũng sẽ khác nhau nên giá trị cộng hưởng là khác nhau [1-4]

5

Hình 0.2 Mô tả sự hình thành hằng số chắn

Trong các hợp chất hữu cơ thì tetramethylsilan (TMS) có hằng số chắn lớn, do mật độ điện tử lớn, người ta thường quy ước độ dịch chuyển hóa học của proton cũng như carbon trong TMS là mốc số 0 Như vậy để xác định

được giá trị độ dịch chuyển dịch hóa học (δ ppm) của một nguyên tố X bất kỳ

là so sánh độ chênh lệch với giá trị ở mốc là độ dịch chuyển hóa học của TMS Độ dịch chuyển hóa học, không phụ thuộc vào cường độ từ trường bên ngoài Độ dịch chuyển hóa học không có thứ nguyên, được hiểu là phần triệu (10-6) ký hiệu là ppm [3]

ppm a

6

Hình 1.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của paracetamol

Nguyên tử 1H, 13C ở các vị trí khác nhau trong khung cấu trúc hóa học

sẽ có mật độ điện tử khác nhau nên có giá trị hằng số chắn σ khác nhau nghĩa

là độ dịch chuyển hóa học sẽ khác nhau Do TMS là chất có hằng số chắn rất lớn, nên hầu hết các hợp chất hữu cơ đều có hằng số chắn nhỏ hơn TMS nên proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3] Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát

Hình 1.4: Hằng số tương tác spin-spin J:

7

Do hạt nhân của các proton luôn có từ trường riêng, nên từ trường này tương tác với các proton bên cạnh, sự tương tác này làm các đỉnh phổ tách ra

khỏi nhau, người ta gọi tương tác này là tương tác spin-spin Hằng số tương

tác được xác định bằng khoảng cách giữa các đỉnh tín hiệu bị tách Thứ

nguyên của hằng số tương tác J là Hz[2]

Hình 1.5: Cách xác định hằng số tương tác spin-spin (J)

Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J cho ta thông tin về vị trí trương

đối của các hạt nhân, hoặc tương quan cấu trúc của các nhóm nguyên tử hay nhóm chức với nhau

8

Hình 1.6: Hằng số J ứng dụng phân tích cấu hình của axit betulinic

1.1.2 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là: Các hợp chất hữu cơ (mẫu phân tích) bị bắn phá bởi dòng electron (hoặc điện tích, laser…)

có năng lượng cao (70eV), làm các điện tử ở orbital phân tử ngoài cùng bị bứt

ra tạo thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e, các ion này không bền và phân mảnh nhờ sự đứt gãy liên kết tạo thành các ion mảnh nhỏ hơn Quá trình phân mảnh ion tuân theo nguyên tắc bảo toàn khối lượng

9

các ion này theo số khối thì ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối lượng này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [1,4]

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc

bị phá vỡ thành các ion và các gốc

Hình 0.7 Phổ khối lượng của 3,4-dimethoxyacetophenone [4]

Các ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ

số m/e được gọi là số khối z Bằng cách tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng sau đó vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng [1-4]

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

10

1.2 Chi Fissistigma

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật rất

đa dạng và phong phú Đây là nguồn dược liệu quí giá phục vụ sức khỏe và

cuộc sống con người Chi Fissistigma thuộc họ Na (Annonaceae) và được các

nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm Việt Nam có khoảng 23 loài thuộc

chi Fissistigma Các loài này vẫn chưa được nghiên cứu nhiều về hóa học và hoạt tính sinh học Đồng bào người Thái tại Nghệ An dùng thân của loài F

bicolor (Lãnh công có lông) làm thuốc chữa trị bệnh đau dạ dày; đồng bào

Mường (Hòa Bình) dùng loài F petelotii (Phát lãnh công) làm thuốc chữa sốt rét Người dân một số tính ở miền Bắc đã dùng loài F polyanthoides (Cánh

thư đa hùng) làm thuốc chữa tiêu chảy và thuốc bổ [5]

1.2.1 Thành phần hóa học của các cây Fissistigma

Gần đây, có nhiều công trình khoa học công bố về thành phần hóa học

cũng như hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Fissistigma Các nghiên cứu bước đầu về các loài thuộc chi Fissistigma cho thấy chúng có thành phần

hóa học đa dạng như alkaloid, flavonoid và các lớp chất thiên nhiên khác …

đặc biệt, các hợp chất thiên nhiên trong các loài Fissistigma thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào, kháng u, ức chế sự phân bào, kháng ngưng kết tiểu cầu, chống

tụ tiểu cầu … Từ vỏ thân loài Fissistigma Oldhamii người ta đã phân lập

được 5 alkaloid như hình sau[6]

11

Năm 1993, nhóm nghiên cứu của Trung Quốc đã phân lập được 5 hợp

chất alkaloid 4-7 từ loài Fissistigma oldhamii [7] Tiếp theo, cũng từ loài này

Wu đã phân lập được một hợp chất alkaloid mới fissoldhimine (8) Tương tự

các hợp chất 8-10 cũng lần lượt được phát hiện từ loài này

Ở Việt Nam, năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Anh

và cộng sự cũng đã phân lập được hai hợp chất α-benzoylamino-phenylpropanoate (14) và kaempferol 3,7-di-α-L-

α-acetylamino-phenylpropyl-rhamnopyranoside (12) Từ loài Fissistigma pallens, Trịnh Thị Thủy và cộng

sự đã phân lập được hợp chất afzelin (5) và 1 dẫn xuất sesquiterpen glycoside

là fissispallin (12)

12

Đặc biệt các hợp chất polyphenol cũng đã được nhóm của Trần Thị

Thanh Thủy và cộng sự đã phân lập: kaempferol 3-O-β-D-glucoside (5), quercetin-3-O-β-D-glucoside (15) và 1 hợp chất flavan, epicatechin (14) từ cặn chiết ethylacetate của loài F polyanthoides [12]

Các hợp chất catechin cũng đã được phân lập từ chi này [15]

1.2.2 Hoạt tính sinh học

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Thanh Thủy đã thử nghiệm

hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ chi Fissistigma cho thấy 2

hợp chất aporphine alkaloid mới có hoạt tính gây độc tế bào trung bình trên 4 dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, MCF-7 và LU và có khả năng ức các loài

13

vi khuẩn Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecium, Staphylococcus

aureus và Bacillus subtillis [15] Sau đó, nhóm nghiên cứu của Trần Đình

Thắng, các nhóm nghiên cứu của Nguyễn Xuân Nhiệm, Phan Văn Kiệm, Phạm Thế Chính và Phạm Thị Thắm đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ chi này [17,22-26]

Như vậy, có thể thấy chi Fissistigma có một tiềm năng lớn về các hoạt

chất có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư và kháng viêm Có một

số nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cua các loài thuộc chi này Do đó, tập trung nghiên cứu hệ thống về tiềm năng hoạt chất sinh học của chi này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

1.3 Định hướng nghiên cứu

Như vậy, qua phân tích tổng quan trên, các hợp chất thiên nhiên phân lập được từ cây lãnh công thường có cấu trúc phức tạp việc phân tích cấu trúc

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sử dụng các phương pháp chiết tách theo độ phân cực tăng dần của dung môi để phân tách các lớp chất thiên nhiên trong mẫu thực vật, các hợp chất thiên nhiên được phân lập bằng các phương pháp sắc ký, cấu trúc các hợp chất được phân tích cấu trúc tại Phòng thí nghiệm Phân tích cấu trúc, Viện Hóa sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và phòng thí nghiệm Hóa dược – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Hóa chất sử dụng trong các phép đo phân tích cấu trúc được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ

15

Dung môi sử dụng để tách các hợp chất thiên nhiên là các dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ), dung môi sử dụng cho quá trình tách bằng HPLC các dung môi dùng riêng cho HPLC

Silica gel cho sắc ký cột là loại 40 - 63 µm (Merck) hoặc chất hấp phụ ODS (150 µm), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng sẵn Art 5554

DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck)

2.1.3 Khảo sát điều kiện tách chất bằng sắc ký lớp mỏng

Trước khi thực hiện quá trình phân tách trên cột sắc ký silica gel, thì điều kiện phân tách được khảo sát trước bằng các phương pháp sắc ký lớp mỏng, với các điều kiện UV hoặc thuốc thử hiện màu nhận biết các chất Nguyên tắc chung của các phương pháp sắc ký lớp mỏng cũng tương tự như các phương pháp sắc ký thông thường khác là dựa theo quá trình hấp phụ và giải hấp phụ của các chất trên bề mặt chất hấp phụ dưới tác dụng của pha động là các dung môi hữu cơ Các chất khác nhau sẽ có tính chất vật lý khác nhau trên thể hiện trên sắc ký lớp mỏng, các chất khác nhau sẽ có giá trị Rf

khác nhau đồng thời có sự phát quang khác nhau Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra

xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

2.1.4 Xác nhận cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên được phân tích bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều 1D và 2 chiều 2D Phổ

1H-NMR (500MHz), 13C-NMR (125MHz), HSQC và HMBC của các hợp chất thiên nhiên polyphenol-glycoside được đo trên máy Bruker AVANCE III tần số 500 MHz với các dung môi phù hợp và chất chuẩn nội TMS, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Các bước chuẩn hóa quy trình đo được thực hiện thông

16

thường theo các quy chuẩn của quốc tế của phương pháp này

2.2 Chuẩn bị mẫu các hợp chất thiên nhiên

2.2.1 Tách chiết các lớp chất thiên nhiên

Ngâm 4.4 kg bột lá cây Fissistigma balansae vào trong bình chiết siêu

âm có chứa 10 lit MeOH trong thời gian 12h, sau đó lọc thu được dịch chiết MeOH, thực hiện quá trình chiết này 3 lần với thể tích MeOH như nhau Kết thúc quá trình ngâm chiết, dịch chiết MeOH được loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được dung được 380 g cặn chiết thô (cặn MeOH) Cặn chiết này được phân tán lại trong nước 6 lít, sau đó được chiết phân lớp theo độ phân

cực tăng dần của dung môi chiết Đầu tiên, được chiết bằng dung môi hexane, thực hiện liên tiếp 3 lần mỗi lần 3 lit n-hexane, dịch chiết n-hexane

n-được làm khan và loại bỏ dung môi thu n-được 59,1 g cặn chiết FB1 Tiếp theo, dịch nước lại được chiết tiếp 3 lần bằng dung môi dichlomethane, mỗi lần 2 lit dung môi, dịch chiết thu được được làm khan và loại bỏ dichlomethane và thu được 19,1 g FB2 Dịch nước tiếp theo lại được chiết tiếp bằng ethyl acetate 3 lần, mỗi lần 2 lit, dịch chiết thu được tiếp tục được làm khan và loại

bỏ dung môi thu được 26,0 g cặn chiết FB3 Dịch nước còn lại được cô đuổi hết nước thu được 275 g ký hiệu là phân đoạn FB4 Phân đoạn FB4 được tách tiếp trên cột Dianion HP-20 với hệ dung môi là MeOH trong nước gradient từ 25%, 50%, 75% và 100% nước thu được 4 phân đoạn ký hiệu là FB4A-FB4D Sơ đồ của quá trình tách này được tóm tắt như sơ đồ 2.1

17

Sơ đồ 2.1 Quy trình phân tách các lớp chất thiên nhiên từ cây Fissistigma

balansae

2.2.2 Tách các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký

a, Quy trình phân lập mẫu FTS 17B

30 gam phân đoạn FB4 được đưa lên cột tách silica gel, pha động là hệ dung môi gradient của dichlomethane/MeOH lần lượt là 10/1; 5/1; 2.5/1 và 2/1 (v/v) thu được 4 phân đoạn ký hiệu là FB4A1-FB4A4 Tiếp theo đưa 3,2 gam phân đoạn FB4A3 lên cột tách silica gel, hệ dung môi rửa giải là dichlomethane/MeOH/H2O: 3/1/0.15 (v/v/v) nhận được 4 phân đoạn nhỏ tiếp theo ký hiệu là FB4A3A- FB4A3D 175 mg phân đoạn FB4A3C tiếp tục được phân tách trên cột LH-20 với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1, v/v) nhận được

ba phân đoạn nhỏ ký hiệu là FB4A3C1- FB4A3C3 Phân đoạn FB4A3C2 được làm sạch trên HPLC với đường kính cột tách là 20 mm, chiều dài 250

mm, hệ dung môi rửa giải là CAN trong nước (18%), nhận được hợp chất tinh

khiết là FTS17B với khối lượng là 14,6 mg Như vậy, hiệu suất tương đối so

18

với khối lượng cặn chiết nước là 0,0053% Sơ đồ phân tách được tóm lược

như sau:

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập mẫu FTS17B

b, Quy trình phân lập mẫu nghiên cứu PT21C

25 g phân đoạn FB4C được đưa lên cột tách silica gel với hệ dung môi

rửa giải gradient của dichlomethan/MeOH 10/1; 5/1 và 2.5/1 (v/v) nhận được

4 phân đoạn nhỏ ký hiệu là FB4C1- FB4C4 Đưa 3,1 gam phân đoạn FB4C2

lên cột tách silica gel với pha động là dichlomethane/acetone, 1,5/1 (v/v) nhận

được 3 phân đoạn nhỏ tiếp theo là FB4C2A- FB4C2C 312 mg của phân đoạn

FB4C2C được đưa lên cột tách LH-20 với hệ dung môi tách là MeOH/H2O

(1/1, v/v) nhận được 2 phân đoạn là FB4C2C1- FB4C2C2 Phân đoạn

FB4C2C1 được làm sạch bằng HPLC điều chế, với hệ dung môi rửa giải là

CAN/H2O (30/70, v/v), với điều kiện cột tách như tách với PTS 17B nhận

được một hợp chất tinh khiết ký hiệu là PT21C, với khối lượng là 8,3 mg,

19

hiệu suất 0,003% so với cặn chiết nước Sơ đồ phân tách được thể hiện như sau:

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập mẫu PT21C

c, Quy trình phân lập chất DI10a và CCA32A

Đưa toàn bộ 100 mg phân đoạn FB4C3 lên cột tách silica gel với hệ dung môi dichlomethane/acetone/H2O với tỷ lệ 1/1,5/0,8 (v/v/v), nhận được 4 phân đoạn ký hiệu là FB4C3A- FB4C3D Phân đoạn FB4C3B được làm sạch bằng HPLC với hệ dung môi rửa giải là CAN/H2O (30/70, v/v) nhận được

một hợp chất tinh khiết là BI10a, 5,0 mg, 0,0018% Phân đoạn FB4C3C được

làm sạch bằng HPLC với hệ dung môi rửa giải là CAN/H2O (25/75, v/v) nhận

được một hợp chất tinh khiết CCA32B, 14,6 mg, 0,0053%

20

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ phân lập mẫu BI10a và CCA32B 2.3 Phân tích cấu trúc của FTS17B, PT21C, BI10a và CCA32B bằng

phương pháp phổ NMR

Cân lần lượt 5 mg của các mẫu FTS17B, PT21C, BI10a và CCA32B ở

trên được cho vào lần lượt 5 ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3

mm, rộng 5 mm, sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất [18] Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Chất FTS17B

1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 3.15 (1H, br s, H-1), 4.74 (1H,

d, J = 4.0 Hz, H-2), 3.89 (1H, m, Ha-4), 4.26 (1H, m, Hb-4), 3.15 (1H, br s, 5), 4.78 (1H, m, H-6), 3.89 (1H, m, Ha-8), 4.26 (1H, m, Hb-8), 7.05 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2ʹ), 7.17 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5ʹ), 6.83 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H-6ʹ), 3.89 (3H, s, 3ʹ-OMe), 6.97 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2ʹʹ), 6.79 (1H, d, J = 8.5

H-21

Hz, H-5ʹʹ), 6.94 (1H, dd, , J = 1.5, 8.5 Hz, H-6ʹʹ), 3.88 (3H, s, H-3ʹʹ), Glc: 4.90

(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹʹʹ), 3.50 (1H, dd, J = 7.5, 9.0 Hz, H-2ʹʹʹ), 3.47 (1H, t, J

= 9.0 Hz, H-3ʹʹʹ), 3.41 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-4ʹʹʹ), 3.41 (1H, m, H-5ʹʹʹ), 3.70 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, Ha-6ʹʹʹ), 3.87 (1H, dd, J = 2.5, 12.0 Hz, Hb-6ʹʹʹ)

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 55.4 (C-1), 87.5 (C-2), 72.7 (C-4), 55.5 (C-5), 87.1 (C-6), 72.7 (C-8), 137.5 (C-1ʹ), 111.7 (C-2ʹ), 151.0 (C-3ʹ), 147.4 (C-4ʹ), 118.1 (C-5ʹ), 120.1 (C-6ʹ), 56.8 (3ʹ-OMe), 133.8 (C-1ʹʹ), 111.0 (C-2ʹʹ), 149.2 (C-3ʹʹ), 147.5 (C-4ʹʹ), 116.1 (C-5ʹʹ), 119.8 (C-6ʹʹ), 56.5

3,57 (1H, dd, J = 5,6, 10,0 Hz, Hb-6′′), 5,20 (1H, br s, H-1′′′), 0,91 (1H, d, J =

6,2 Hz, H-6′′′)

13 C-NMR (125Hz, CD3OD): 158,3 (C-2), 134,4 (C-3), 179,3 (C-4), 163,2 (C-5), 99,8 (C-6), 165,7 (C-7), 94,6 (C-8), 158,4 (C-9), 106,4 (C-10), 123,4 (C-1′), 116,0 (C-2′), 148,4 (C-3′), 150,6 (C-4′), 114,6 (C-5′), 123,6 (C-6′), 100,3 (C-1′′), 75,7 (C-2′′), 78,9 (C-3′′), 71,9 (C-4′′), 78,4 (C-5′′), 68,5 (C-6′′), 102,8 (C-1′′′), 72,4 (C-2′′′), 72,4 (C-3′′′), 74,0 (C-4′′′), 69,9 (C-5′′′), 17,4 (C-6′′′)

22

2.4 Phân tích FTS17B, PT21C, BI10a và CCA32B bằng phổ 2D (HSQC,

HMBC)

5 mg các mẫu ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR

của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất [18] Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian đo với HSQC là 6h và HMBC là 8h