Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc hóa học và hàm lượng của một số steroidal saponin từ loài lu lu đực (Solanum nigrum L.)

Mục đích của Luận văn nhằm nghiên cứu chiết xuất một số hợp chất steroidal saponin từ loài lu lu đực và đánh giá sơ bộ hàm lượng của chúng. Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất steroidal saponin đã phân lập được. Mời các bạn cùng tham khảo!

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ LY

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HÓA HỌC

VÀ HÀM LƯỢNG CỦA MỘT SỐ STEROIDAL SAPONIN

TỪ LOÀI LU LU ĐỰC (Solanum nigrum L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ LY

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HÓA HỌC

VÀ HÀM LƯỢNG CỦA MỘT SỐ STEROIDAL SAPONIN

TỪ LOÀI LU LU ĐỰC (Solanum nigrum L.)

Ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Hữu Tài

THÁI NGUYÊN - 2018

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS Bùi Hữu Tài - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn

và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình triển khai nghiên cứu thực hiện đề tài

Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cũng các thầy, cô, cán bộ kĩ thuật viên Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn em trong quá trình học tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè lớp Cao học Khóa 2016-2018 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm thực vật chi Solanum và loài S nigrum 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Solanum 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật loài S nigrum 5

1.2 Công dụng của lu lu đực trong các bài thuốc dân gian 6

1.3 Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học loài S nigrum 7

1.3.1 Nghiên cứu về tác dụng sinh học loài S nigrum 7

1.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học loài S nigrum 9

1.4 Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ 13

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng 13

1.4.2 Sắc ký cột 15

1.5 Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ 16

1.5.1 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 16

1.5.2 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 18

Chương 2 THỰC NGHIỆM 19

2.1 Nguyên liệu, hóa chất 19

2.2 Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất 19

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập 20

2.3 Thu thập và xử lý mẫu loài S nigrum 20

2.4 Chiết xuất, tạo phân đoạn giàu hợp chất saponin và phân lập một số hợp chất steroidal saponin từ loài S nigrum 21

Trang 5

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 23

3.1 Mẫu thực vật 23

3.2 Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài S nigrum 24

3.2.1 Hợp chất SN1: Dioscin 24

3.2.2 Hợp chất SN2: Asperin 24

3.2.3 Hợp chất SN3: Degalactotigonin 24

3.2.4 Hợp chất SN4: Soladulcoside A 24

3.3 Phân tích cấu trúc hóa học, đánh giá hàm lượng của steroidal saponin từ loài S nigrum 25

3.3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất SN1 25

3.3.5 Tổng hợp cấu trúc hóa học của một số hợp chất steroidal saponin phân lập được từ loài S nigrum và đánh giá sơ bộ hàm lượng 52

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt)

13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Polarisation Transfer

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass

HepG2 Human liver hepatocellular cell Tế bào ung thư phổ ở người

HMBC Heteronuclear mutiple Bond

Trang 7

IC 50 Half maximal inhibitory

concentration

Nồng độ gây ức chế 50% đối tượng thí nghiệm

LNCaP Human prostate adenocarcinoma

lung cancer cell

Tế bào ung thư phổi ở người theo chuẩn của viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ

PC-3 Human prostate adenocarcinoma

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của phần aglycone của hợp chất SN1 và

hợp chất tham khảo 27Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của phần đường của hợp chất SN1 và

hợp chất tham khảo 28Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của phần aglycone của hợp chất SN2 và

hợp chất tham khảo 49Bảng 3.9 Đánh giá sơ bộ về hàm lượng của các hợp chất saponin

trong mẫu lu lu đực 54

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Solanum 3

Hình 1.2 Cây lu lu đực [3]: 1)Cành (ảnh đen trắng và ảnh màu), 2)Hoa, 3)Đài hoa, 4)Tràng hoa, 5)Nhị hoa, 6)Nhụy hoa 6

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất SN1-SN4 từ loài S nigrum 22

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu thu thập về loài S nigrum 23

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SN1 25

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất SN1 29

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của hợp chất SN1 29

Hình 3.5 Phổ DEPT-135 của hợp chất SN1 30

Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất SN1 30

Hình 3.7 Phổ HMBC của hợp chất SN1 31

Hình 3.8 Phổ COSY của hợp chất SN1 31

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất SN2 32

Hình 3.10 Các tương tác HMBC chính của hợp chất SN2 33

Hình 3.13 Phổ DEPT của hợp chất SN2 37

Hình 3.14 Phổ HMQC của hợp chất SN2 37

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của hợp chất SN3 39

Hình 3.18 Tương tác HMBC chính của hợp chất SN3 40

Trang 10

Hình 3.25 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SN4 46

Hình 3.31 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất steroidal saponin (SN1-SN4) từ loài S Nigrum 53

Trang 11

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình đa dạng đã tạo nên nguồn tài nguyên sinh vật dồi dào, đặc biệt là hệ thực vật Việt Nam rất phong phú Theo ước tính số loài thực vật bậc cao ở nước ta

có thể lên tới 12000 loài, trong đó có 4000 loài được người dân sử dụng trong các bài thuốc dân tộc và là nguồn nguyên liệu kiến thức quý phục vụ cho quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới

Một vài thập kỷ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc đông y và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật để phòng và trị bệnh trở nên thịnh hành trên thế giới Tân dược hóa thuốc đông y đã và đang được phát triển mạnh ở nhiều nước có nền công nghiệp dược phẩm phát triển như Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, và đặc biệt là Trung Quốc Sự phát hiện

ra nhiều chất có cấu trúc hóa học mới, chất có hoạt tính sinh học cao từ thiên nhiên đã đóng góp rất lớn trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo Bên cạnh đó, các cây thuốc cũng là nguồn nguyên liệu phong phú cung cấp các hoạt chất quý hiếm để tạo ra các biệt dược và các chất dẫn đường để tổng hợp ra các loại thuốc mới Từ những chất phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao và ít tác dụng phụ

Lu lu đực (còn có các tên gọi khác như nụ áo, thù lù đực, long

quỳ ) có tên khoa học Solanum nigrum Linn thuộc họ cà (Solanaceae)

Theo kinh nghiệm dân gian, lu lu đực có vị đắng, hơi ngọt, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi niệu, tán ứ huyết, tiêu viêm, tiêu thũng Ngoài ra, lu lu đực còn được dùng để chữa cảm sốt, viêm phế quản, nhiễm khuẩn hô hấp, viêm họng, bệnh đường tiết niệu, viêm thận cấp, viêm tuyến tiền liệt, tiểu tiện khó khăn, lở loét ngoài da, mẩn ngứa, bỏng, vảy nến, Ở một số nước Châu Âu, lu lu đực được dùng làm thuốc giảm đau nhức, làm dịu, chống co thắt, an thần

Trang 12

Với mục đích phân tích, làm rõ cơ sở khoa học, và nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu lu lu đực, tôi đã lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc hóa

học và hàm lượng của một số steroidal saponin từ loài lu lu đực (Solanum

nigrum L.)”

Nhiệm vụ của đề tài là:

Xử lí mẫu tạo dịch chiết, các phân đoạn chiết của loài lu lu đực

Nghiên cứu chiết xuất một số hợp chất steroidal saponin từ loài lu lu đực và đánh giá sơ bộ hàm lượng của chúng

Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất steroidal saponin đã phân lập được

Trang 13

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật chi Solanum và loài S nigrum

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Solanum

Chi Solanum L (chi cà) là một chi lớn nhất trong họ Cà (Solanaceae) Các loài thuộc chi Solanum phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt

đới và ôn đới ấm Vùng nhiệt đới Trung và Nam Mỹ là nơi có số lượng loài

thuộc chi Solanum nhiều nhất, đa dạng nhất, sau đó đến châu Úc, châu Phi và

châu Á nhiệt đới

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Solanum

Trang 14

Ở Việt Nam, chi Solanum được phát hiện có khoảng 28 loài, phân bố từ

Bắc vào Nam, các loài thuộc chi Solanum có giá trị thực tiễn như: làm thuốc,

làm rau ăn và làm cảnh Bên cạnh các loài có tác dụng làm thuốc, một số loài thuộc chi Solanum được sử dụng rất phổ biến làm rau ăn và đem lại giá trị kinh tế không nhỏ Trong đó phải kể đến một số loài đem lại lợi ích rất to lớn

cho con người như: Khoai tây (S tuberosum), Cà chua (S lycopersicum), Cà tím (S melongena), cà pháo (S macrocarpon)

Đặc điểm hình thái của của chi Solanum do Carl Linnaeus mô tả đầu

tiên vào năm 1753 Chúng là cây thảo, cây bụi, cây leo, cây gỗ nhỏ, đôi khi có gai; có lông che chở, lông phân nhánh hoặc hình sao, đôi khi có lông tiết Lá đơn mọc cách hoặc mọc thành từng cặp không đều Lá có mép nguyên, có răng, có thuỳ hoặc xẻ thuỳ sâu, và phần lớn có cuống lá Cụm hoa có thể mọc

ở nách lá, ngoài nách, đối diện với lá, hoặc ở đỉnh cành Chúng thường mọc thành dạng xim bọ cạp, xim bọ cạp ghép cặp, xim hai ngả kép của xim bọ cạp,

có hiện tượng lôi cuốn, dạng chùm, dạng chùm phân nhánh, dạng tán hay chỉ

là hoa mọc đơn độc Hoa thường lưỡng tính hoặc cặp hoa đơn tính cùng gốc,

thường mẫu 5, rất hiếm khi mẫu 4 (S procumbens) Đài xẻ thuỳ, có tai cao, có

lông ở mặt ngoài Tràng hình bánh xe hay hình chuông, tràng hoa dạng ống ngắn, xẻ thành 5 hoặc 10 cánh

Nhị có chỉ nhị rất ngắn, đính trên tràng, bao phấn thuôn, nhọn đầu, bao phấn chụm lại hoặc nối thành vòng tròn quanh vòi nhuỵ, mở lỗ ở đỉnh hay gần đỉnh, mở theo đường nứt dọc Vòi nhụy ngắn và nhỏ; bầu trên, thường 2 ô (có thể hơn do vách giả), với giá noãn rộng, noãn nhiều; núm nhuỵ nhỏ

Quả mọng phần lớn mọng nước Đài ở quả thỉnh thoảng phát triển bao quanh quả mọng Quả chứa nhiều hạt, dẹt dạng đĩa hoặc thấu kính lồi; phôi hướng ngoài Đặc biệt giải phẫu có vòng libe quanh tủy ở cuống và gân lá Biểu bì mang lông che chở và lông tiết Hạt phấn hình cầu có 3 u lồi, 3 lỗ rãnh, đường kính 7-28 µm, 12 nhiễm sắc thể

Trang 15

1.1.2 Đặc điểm thực vật loài S nigrum

Theo khóa phân loại thực vật, loài S nigrum có vị trí phân loại như sau: + Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta

Lu lu đực có tên khoa học là Solanum nigrum L (tên đồng nghĩa: S

americanum Mill., S schultesii Opiz, và S photeinocarpum Nakamura &

Odashima), thuộc họ Cà (Solanaceae) [1, 2] Cây này còn có tên khác là Nụ

áo, Nút áo, Gia cầu, Cà trái dự, Thù lù đực, Cà đen, Long quỳ Lu lu đực thuộc loại cây thảo, sống hàng năm hoặc lâu năm, cao khoảng 30-100 cm Thân cành có màu lục, nhẵn hoặc hơi có lông, có cạnh và nhiều cành Lá hình bầu dục, gốc lá thuôn hay tròn, đầu nhọn, mép lượn sóng, có răng cưa to và nông, màu lục sẫm, gân lá kết mạng rõ ở dưới Hoa mọc thành chùm dạng tán

ở kẽ lá Hoa nhỏ, màu trắng, đài hình phễu Tràng hoa màu trắng hoặc hồng hay tim tím, rộng 1.0-1.2 cm, cuống hoa dài 1.0-2.0 mm Quả mọng hình cầu đường kính 5.0-8.0 mm, khi chín có màu đen bóng, nhiều hạt dẹt và nhẵn

Lu lu đực phân bố rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới ẩm trên toàn thế giới, ở Việt Nam cây mọc hoang ở hầu hết các tỉnh từ vùng núi cao 1500 m đến các vùng thấp ở đồng bằng, mọc hoang ở vườn, ruộng, hai bên đường hay bãi hoang Lu lu đực là loại cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc hơi chịu bóng, thường mọc tập trung lẫn trọng ruộng ngô đậu, vườn và trên các bãi hoang quanh làng bản Cây ra hoa quả nhiều Hạt tồn tại trong đất qua mùa đông và sẽ nảy mầm vào tháng 3-4 năm sau Do mức độ phân bố rộng, mọc hoang, lu lu đực được coi là một loài cỏ dại ảnh hưởng đến cây trồng Cành và lá được sử dụng làm thức ăn cho gia súc và làm phân xanh trong nông nghiệp

Trang 16

Hình 1.2 Cây lu lu đực [3]: 1) Cành (ảnh đen trắng và ảnh màu),

2) Hoa, 3) Đài hoa, 4) Tràng hoa, 5) Nhị hoa, 6) Nhụy hoa.

1.2 Công dụng của lu lu đực trong các bài thuốc dân gian

Trong các bài thuốc đông y, lu lu đực có vị đắng, hơi ngọt, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, lợi niệu, tan ứ huyết, tiêu viêm, tiêu thũng nhưng có độc

ở liều lượng cao Y học cổ truyền phương đông dùng lu lu đực làm thuốc chữa cảm sốt, viêm phế quản, nhiễm khuẩn hô hấp, viêm họng, viêm đường tiết niệu, viêm thận cấp, viêm tuyến tuyền liệt, tiểu tiện khó khăn, vảy nến, lở loét ngoài da, bỏng, vết sưng tấy, chín mé, áp xe Liều dùng: 10.0-15.0 g dạng thuốc sắc Mặc dù toàn cây có chứa chất độc nhưng ở nhiều nơi ngọn non vẫn được dùng làm rau ăn

Dược điển Pháp năm 1965 xếp lu lu đực là loại thuốc độc bảng C với tác dụng gây ngủ, làm dịu thần kinh Tuy vậy thử nghiệm độc tính với liều

1000 mg dược liệu khô (dịch chiết cồn 50%) trên 1.0 kg chuột cho thấy thuốc dung nạp tốt và không thấy biểu hiện độc Ở châu Âu, lu lu đực được dùng làm thuốc giảm đau nhức, làm dịu, chống co thắt, dễ ngủ, an thần, chữa chóng mặt, kiết lỵ, tiêu chảy, hay dùng ngoài da trị ngứa ở các vết thương

Trang 17

Một số bài thuốc dân gian có sử dụng lu lu đực như sau:

+ Chữa viêm phế quản cấp, viêm họng: Lu lu đực 30.0 g, cát cánh 10.0

g, cam thảo 4.0 g Sắc uống

+ Chữa tiểu tiện không thông, phù thũng, gan to: Lu lu đực 40.0 g, mộc thông 20.0 g, rau mùi 20.0 g Sắc uống Có thể dùng toàn cây rửa sạch, giã nát, ép lấy nước uống; hoặc ngọn non 50-100 g luộc ăn trong ngày

+ Chữa sốt: Bột rễ lu lu đực 100 g, bột rễ ké hoa vàng 100 g, hạt tiêu đen 2.5 g Làm thuốc bột Mỗi lần uống 3.0-5.0 g

+ Chữa bệnh ngoài da (mẩn ngứa, lở loét, bỏng, vảy nến): Ngọn non hoặc lá, rửa sạch, giã nát, ép lấy nước bôi Hoặc dùng toàn cây, nấu lấy nước,

cô thành cao mềm (cao Long quỳ) để bôi chữa vảy nến hay trĩ

+ Chữa vết thương do va đập bị dập, sưng tấy, ứ máu, đau nhức: Giã nát 80-100g cây tươi, thêm ít giấm, ép lấy nước nước để uống, bã đắp chỗ đau

1.3 Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học loài S nigrum

Theo cơ sở dữ liệu Scinfinder, tính đến năm 2018 các nhà khoa học

trên thế giới đã có trên 2000 công bố liên quan đến loài lu lu đực (Solanum

nigrum) Từ những năm 1950, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu phân

lập các hợp chất alkaloid từ loài S nigrum Tuy nhiên, cho đến sau năm 1980

số lượng các nghiên cứu công bố về hóa học và hoạt tính sinh học của loài S

nigrum mới bắt đầu tăng mạnh Trong vòng 5 năm gần đây (2012-2017),

trung bình mỗi năm có trên 200 công bố liên quan đến loài này [4] Một vài

các công bố điển hình về loài S nigrum có thể được tóm lược như sau:

1.3.1 Nghiên cứu về tác dụng sinh học loài S nigrum

Nhằm làm sáng tỏ công dụng của loài S nigrum trong các bài thuốc dân tộc ở khắp nơi trên thế giới, dịch chiết của S nigrum đã được sàng lọc và

nhận thấy thể hiện một số hoạt tính tiêu biểu như kháng tế bào ung thư, chống oxi hóa, bảo vệ gan, kháng viêm, giảm sốt, và chống co giật Dịch chiết từ

quả hay cả cây loài S nigrum đều được thông báo thể hiện hoạt tính kháng

một số dòng tế bào ung thư ở người như HepG2 (ung thư gan), HT29 và

Trang 18

HCT116 (ung thư ruột kết), MCF-7 (ung thư vú), U14 and HeLa (ung thư cổ

tử cung) [5-7] Cơ chế kháng tế bào ung thư của dịch chiết S nigrum sau đó

được nghiên cứu và cho thấy nó thể hiện qua khả năng thúc đẩy các tế bào ung thư chết theo quá trình apoptosis, hoạt hóa tế bào CD-4 nhằm tăng cường khả năng miễn dịch, hay ức chế enzyme PKCα (protein kinase C alpha), iNO (inducible nitric oxide) và ức chế nhân tố phiên mã NF-κB Tác dụng chống

oxi hóa của S nigrum được nghiên cứu qua khả năng thu dọn gốc tự do

DPPH, hydroxyl, superoxide anion, và quá trình oxi hóa 2-deoxy-ribose Trong đó, dịch chiết methanol thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do DPPH mạnh hơn so với dịch chiết nước [8] Khi nghiên cứu tác dụng kháng viêm trên ở các thí nghiệm trên chuột, Zakaria và cộng sự cho thấy dịch chiết

chloroform của loài S nigrum thể hiện tốt khả năng kháng viêm trên mô hình

thí nghiệm chuột bị kích thích gây viêm bằng carrageenan [9] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Cai và cộng sự [10] cũng cho các hợp chất phenolic phân lập

từ dịch chiết ethanol loài S nigrum có thể là các tác nhân kháng viêm tiềm

năng bởi khả năng ức chế leukotrienes Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ

gan của dịch chiết nước loài S nigrum được thử nghiệm trên chuột bị gây tổn

thương gan bởi carbon tetrachloride (CCl4) Khi cho chuột thực nghiệm uống dịch chiết với liều lượng 0.2 g/kg trọng lượng cơ thể trong sáu tuần nhận thấy các tổn thương gan có dấu hiệu hồi phục thông qua sự tăng nồng độ các enzyme ở gan như glutamate oxaloacetate aminotransferase, glutamate pyruvate amino-transferase, alkaline phosphatase Tiếp đó, ở thí nghiệm với liều lượng cao hơn (0.5 g và 1.0 g dịch chiết/kg trọng lượng cơ thể) đã nhận thấy có sự tăng nồng độ glutathione và enzyme superoxide dismutase, qua đó cho phép kết luận có sự hồi phục của gan bị gây tổn thương bởi CCl4 [11-13]

Thêm vào đó, dịch chiết S nigrum cũng làm giảm mức độ tích lỹ collagen,

plasma alanine aminotransferase, và bilirubin tổng số về mức độ bình thường

ở các thí nghiệm trên chuột gây xơ gan bằng thioacetamide Qua đó khẳng

định thêm về tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết S nigrum

Trang 19

1.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học loài S nigrum

Mặc dù có rất nhiều công bố liên quan đến loài S nigrum, tuy nhiên

mới chỉ có khoảng 10 công bố về thành phần hóa học của loài này Các

nghiên cứu về thành phần hóa học loài S nigrum cho thấy loài này có chứa

nhiều các steroidal saponin, ngoài ra còn có riboflavin, acid nicotinic, acid citric, acid ascobic; 5.9% protein, 1.0% chất béo, 2.1% chất khoáng, 8.9% các

hợp chất carbohydrat, các hợp chất polyphenol Nghiên cứu về hóa học loài S

nigrum được bắt đầu từ năm 1950 bởi hai nhà khoa học người Anh, Krayer và

Briggs Trong công trình này, các tác giả đã phát hiện được hai hợp chất steroidal alkaloid là dihydrosolasodine và tetrahydrosolasodine [14]

Năm 1984, Cooper và Johnson đã công bố phân lập được hợp chất solanine

(1), một steroidal alkaloid glycoside tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của cây

Hàm lượng solanine được phát hiện cao nhất là ở trong quả chưa chín [15]

Trang 20

Năm 1997, Eltayeb và cộng sự đã phân lập được một steroidal alkaloid

khác solasodine (2) và chứng minh chất này có hàm lượng cao nhất ở trong lá

[3] Tiếp đó, năm 1999, Hu và cộng sự đã phân lập ba steroidal glycoside

gồm: solamargine (3), β2-solamargine (4), và degalactotigonin (5) Đồng

thời, tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư (ung thư ruột kết: HT-29 và HCT-15, ung thư tuyết tiền liệt: LNCaP và PC-3, ung thư vú: T47D và MDA-MB-231) của các hợp chất này cũng được đánh giá [16]

Năm 2006, Zhou và cộng sự tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa

học loài S nigrum Thông qua phân tích các số liệu phổ tác giả đã xác định

được cấu trúc của một hợp chất đã biết (degalactotigonin, 5) và sáu hợp chất steroidal saponin mới, đặt tên là solanigrosides C-F, H, G (6‒11) Các hợp

chất này cũng được đánh giá hoạt tính kháng các tế bào ung thư ở người gồm HepG2, NCI-H460, MCF-7 và SF-268 Kết quả cho thấy hợp chất

degalactotigonin (5) thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị IC50 trong khoảng 0,25‒4.49 µM [17]

Trang 21

Trong một nghiên cứu khác về loài S nigrum, Ikeda và cộng sự công

bố phân lập được 4 hợp chất steroidal saponin trong đó có 2 hợp chất mới là

nigrumin I-II (12 và 13) và 2 hợp chất đã biết degalactotigonin (5) và

tigogenin

3-O-β-D-glucopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-D-glucopyranosyl-(14)]- β-D-galactopyranoside (14) [18]

Dịch chiết ethanol, nước, và n-butanol từ loài S nigrum cũng được các

nhà khoa học Trung Quốc phát hiện có tác dụng kháng tế bào ung thư dạ dày (MGC-803) Sau đó, các dịch chiết tiếp tục được phân lập và phát hiện sự có

mặt của sáu steroidal alkaloid saponin gồm 3, 4, solasonine (15), solasonine (16), γ-solamargine (17), và solanigroside P (18).

Trang 22

β1-Các hợp chất này được nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thư dạ dày

(MGC-803) và nhận thấy hợp chất 3, 15, 16, và 18 thể hiện hoạt tính với giá trị

IC50 lần lượt là 25.2, 26.5, 8.77, 20.1 µg/mL Các thử nghiệm về cơ chế đã cho thấy các hợp chất này diệt các tế bào ung thư MGC-803 theo con đường apoptosis [19] Các hợp chất steroidal saponin có khung aglycone dạng

spirostanol và furostanol cũng được tìm thấy khá phổ biến trong loài S nigrum

Nghiên cứu hóa học loài S nigrum mọc hoang ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã

phát hiện ba hợp chất steroidal saponin mới là uttronin A (19), untroside A và

B (20 và 21) có khung aglycone dạng spirostanol và furostanol [20]

Năm 2007, bốn hợp chất steroidal saponin với aglycone có dạng khung

pregnane (22-25) cũng được thông báo phân lập từ S nigrum Trong đó hai

hợp chất solanigroside A và B (22 và 23) là các hợp chất mới

Trang 23

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về hóa học cũng chỉ ra loài S nigrum

còn có sự có mặt của các hợp chất flavonoid, polyphenol, là những hoạt chất

giải thích phần nào đó công dụng chống oxi hóa, kháng viêm của loài S

nigrum [10, 21]

1.4 Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng Cơ sở của phương pháp sắc ký dựa trên sự khác nhau về bản chất hấp phụ và phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh và pha động Tùy theo bản chất của pha tĩnh hoặc pha động hay dựa trên cách thức triển khai sắc

ký mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký điện di, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký cột trọng lực, sắc ký cột trung áp, sắc ký cột cao áp Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp Thông thường để phân lập một hợp chất cần có sự kết hợp của các phương pháp sắc ký khác nhau và thường thấy là sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột trọng lực Trong khi đó, để phân tích định tính hay định lượng của một hợp chất trong thuốc, dược liệu thì cần đến phương pháp sắc ký hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), HPLC gắn khối phổ

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ của chất phân tích lên chất hấp phụ SKLM thường được sử dụng trong phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột Trong SKLM pha động sử dụng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ (thường gặp là: silica gel hay nhôm oxit) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng và tấm kính/nhôm tráng chất hấp phụ gọi là bản mỏng

Trang 24

Chất phân tích được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi và đưa lên bản mỏng thành một điểm gọn nhờ một mao quản (capillary) và sấy đuổi dung môi Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lượng chất phân tích đưa lên bản mỏng là khác nhau

SKLM được triển khai trong một bình sắc ký bằng thủy tinh, hình dạng

đa dạng, có nắp đậy và bão hòa pha động Pha động di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng, và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó Tùy theo khả năng hấp phụ-giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản mỏng là hệ số di chuyển Rf Hệ số này được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động trên bản mỏng Do vậy Rf sẽ có giá trị từ 0 đến 1 và mỗi hợp chất sẽ có một giá trị Rfxác định đối với một hệ dung môi

Dấu vết của các chất phân tích trên bản mỏng sau khi triển khai có thể được quan sát bằng mắt thường (dựa trên màu sắc của chất phân tích) hay hiện hình nhờ tia tử ngoại (thông thường sử dụng tia tử ngoại với bước sóng

254 và/hoặc 365 nm), hay bằng các phản ứng hóa học bằng cách phun các dung dịch thuốc thử khác nhau tùy theo bản chất của chất phân tích Chẳng hạn ninhydrin phát hiện amino acid hay amin; 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay ketone, Dragendorff phát hiện các hợp chất alkaloid… Với các hợp chất hữu cơ thông thường có thể dùng dung dịch acid H2SO4 loãng (khoảng 10%) và hơ nóng để phát hiện các vết chất trên bản mỏng

SKLM có một số ưu điểm như chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, thực hiện dễ dàng cho kết quả nhanh với độ chính xác cao, có thể phân tích đồng thời mẫu phân tích và chất chuẩn đối chứng Tuy nhiên, SKLM chỉ hiệu quả trong việc phân tích, định tính các hợp chất khó có tính khả thi trong phân lập lượng lớn các hợp chất Và do đó, người ta sử dụng SKLM chủ yếu cho mục đích phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để phân lập các hợp chất hữu cơ

Trang 25

1.4.2 Sắc ký cột

Sắc kí cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản, và hay sử dụng nhất trong phân lập các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên Trong sắc ký cột, pha tĩnh được nạp trên các cột thủy tinh, pha động đi qua cột ở điều kiện áp suất khí quyển nhờ lực hút của Trái đất do đó còn được gọi là sắc ký cột trọng lực, sắc ký cột hở Đồng thời pha tĩnh phải là các hạt có kích thước đủ lớn để pha động có thể đi qua dễ dàng nhờ trọng lực Thông thường kích thước hạt trung bình từ 50-150 µM Với chất hấp phụ silica gel, kích thước

cỡ hạt trung bình (40-63 µM) thường được sử dụng để phân lập các hợp chất

tự nhiên Pha tĩnh được nạp lên cột sắc ký theo hai phương pháp khác nhau

là nạp ướt và nạp khô

Trong phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa riêng lẻ, từ từ lên cột, gõ nhẹ cho chất hấp phụ phân bố đều lên cột và ổn định cột bằng pha động trước khi triển khai

Ở phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được tẩm ướt hoàn toàn trong pha động Hỗn dịch gồm pha động và pha tĩnh sau đó được đưa lên cột sắc ký

và liên tục cho pha động chảy qua cột để ổn định cột sắc ký

Hỗn hợp chất cần phân lập được đưa lên đầu cột, phía trên pha tĩnh Thông thường, trước khi đưa hỗn hợp chất phân tích lên cột sắc ký, hỗn hợp này được trộn đều với chất hấp phụ theo phương pháp tẩm ướt (với chất hấp phụ là silica gel) hay đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan hoàn toàn trong thể tích tối thiểu pha động (với chất hấp phụ là pha đảo)

Hợp chất cần phân lập sau đó được rửa giải từ từ ra khỏi cột sắc ký bằng pha động Quá trình các hợp chất rửa giải ra khỏi cột sắc ký được theo dõi bằng phân tích SKLM

Quá trình sắc ký cột có thể được tiến hành lặp lại với các pha động khác nhau, hay kết hợp vơi các phương pháp khác đến khi thu được hợp chất

có độ tinh khiết mong muốn

Trang 26

1.5 Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ có thể được xác định nhờ vào các tính chất lý hóa đặc trưng của chúng Cách xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ hiện nay phổ biến là phân tích kết hợp một hay nhiều phương pháp phổ như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng, nhiễu xạ tia X (X-Ray), …, hay tiến hành các chuyển hóa hóa học Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người

ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì càng yêu cầu phân tích kết hợp nhiều các phương pháp phân tích khác nhau Với các hợp chất có hấp thụ UV, phân tích phổ UV cho phép dự đoán về sự xuất hiện của các nhóm mang màu, khung carbon của hợp chất phân tích Trong khi đó phổ

IR lại cho các tín hiệu dao động của các nhóm chức, từ đó cho phép xác định

sự có mặt của các nhóm chức này trong cấu trúc hóa học của hợp chất phân tích Với các hợp chất có cấu trúc hóa học mới hoặc khó xác định được công thức phân tử thì phổ khối lượng (đặc biệt là phổ khối lượng phân giải cao) và phương pháp phân tích nguyên tố là những phương pháp cần thiết ban đầu cho phép xác định chính xác công thức phân tử của hợp chất cần phân tích Trong trường hợp các hợp chất có cấu trúc lập thể bất đối xứng thì nhiều trường hợp cần thiết phải phân tích phổ X-Ray hay phổ lưỡng sắc tròn (CD)

để xác định chính xác cấu trúc tuyệt đối, phân bố trong không gian của các hợp chất này Trong các phép phân tích phổ để xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất hữu cơ thì phổ NMR được sử dụng phổ biến và là một trong những phép phân tích đòi hỏi cho việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Các kỹ thuật phân tích NMR được chia thành hai loại chính là phân tích NMR một chiều và hai chiều

1.5.1 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phân tích NMR một chiều hay gặp bao gồm phân tích cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR),

và các kỹ thuật phân tích DEPT như DEPT-45, DEPT-90, DEPT-135

Trang 27

- Phổ 1 H-NMR: cho biết tín hiệu cộng hưởng của các proton có trong

phân tử hợp chất cần phân tích Dựa vào bản chất liên kết giữa proton với nguyên tử khác hay ảnh hưởng bởi các nguyên tử, nhóm nguyên tử gần cạnh

mà các proton cho các tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học và sự phân tách hình dạng tín hiệu khác nhau Độ chuyển dịch hóa học của các proton được so với hợp chất chuẩn nội TMS và thường nằm trong khoảng thang chia 0-14 ppm Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu cộng hưởng của một proton được phân tách theo quy tắc N+1 trong đó N là số lượng các proton tương đương về tính chất

từ ở gần cạnh nó Mỗi dạng phân tách cho một tên gọi của tín hiệu khác nhau như singlet (s, tín hiệu đơn), douplet (d, tín hiệu đôi, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:1), triplet (t, tín hiệu ba, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:2:1), quartet (q, tín hiệu bốn, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:3:3:1), multiplet (m, tín hiệu đa) Trong khi đó, tỉ lệ diện tích các tín hiệu cho biết tương quan về tỉ lệ số proton tương ứng với tín hiệu đó

- Phổ 13 C-NMR: cho biết số nguyên tử carbon trong phân tử của chất

phân tích Tương tự như phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR nhận được các tín hiệu cộng hưởng của carbon với các giá trị độ chuyển dịch hóa học khác nhau nhưng với biên độ rộng hơn Thông thường các tín hiệu của carbon xuất hiện trong thang chia từ 0 tới 230 ppm Số lượng tín hiệu nhận được trên phổ carbon sẽ tương ứng với số lượng nguyên tử carbon không tương đương về tính chất từ có trong phân tử chất phân tích

- Phổ DEPT: cho phép phân loại các tín hiệu trên phổ carbon thành các

nhóm carbon khác nhau bao gồm: carbon không liên kết trực tiếp với hydro, nhóm CH, nhóm CH2, và nhóm CH3 Để phân loại được các tín hiệu này cần

sử dụng kết hợp một số kỹ thuật phân tích DEPT khác nhau, tối thiểu là kết hợp giữa DEPT-90 với DEPT-135 và 13C-NMR Trên phổ DEPT135 sẽ vắng mặt tín hiệu của carbon không liên kết trực tiếp với hydro, các tín hiệu của CH2 có hướng về phía dưới và các tín hiệu của CH cùng với CH3 có hướng lên trên Trong khi đó phổ DEPT90 chỉ nhận được các tín hiệu của CH Từ đó cho phép phân loại được các dạng tín hiệu carbon khác nhau

Trang 28

1.5.2 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Kỹ thuật phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều cho phép xác định mối liên hệ giữa các proton với proton (phổ hai chiều tương tác đồng hạt nhân), proton với carbon (phổ hai chiều tương tác dị hạt nhân) trong phân tử hợp chất phân tích Các kỹ thuật phân tích phổ hai chiều thường gặp là COSY (tương tác đồng hạt nhân proton theo mạch liên kết), NOESY (tương tác đồng hạt nhân theo phân bố trong không gian), HSQC (tương tác dị hạt nhân qua một liên kết), HMBC (tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): cho biết các

tương tác trực tiếp H-C Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, trục còn lại là

13C-NMR Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ nối giữa hai trục là tín hiệu 1H và 13C-NMR

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ

biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần cấu trúc của phân tử cũng như toàn phân tử được xây dựng và gép nối với nhau

- Phổ 1 H- 1 H COSY ( 1 H- 1 H Corelation Spectroscopy): phổ này biểu diễn

tương tác H-H theo mạch liên kết, chủ yếu là các proton đính trên cùng một nguyên tử carbon hoặc với nguyên tử cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các khung cơ sở/mảnh cấu trúc cơ sở của chất phân tích có thể được thiết lập

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu

diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử Ngoài ra, người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE một chiều để xác định cấu trúc không gian của phân tử Các proton có cùng phía cũng như gần nhau

về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiểu phổ với cường độ mạnh hơn bằng vệc đưa chúng vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định

Trang 29

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nguyên liệu, hóa chất

+ Mẫu dược liệu: cả cây loài S nigrum đã sấy khô, nghiền nhỏ

+ Dung môi hữu cơ thông thường: n-hexane, chloroform (có thể thay

thế bằng dichloromethane), EtOAc, methanol là dung môi công nghiệp được chưng cất lại trước khi sử dụng

+ Dung môi đo NMR: CD3OD, DMSO-d 6

+ Bản mỏng silica gel/pha đảo

+ Bột sắc ký Silica gel/pha đảo

+ Chất hấp phụ khác: sephadex LH-20, diaion HP-20

+ Các loại cột sắc ký: thủy tinh

2.2 Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất

+ Sử dụng phương pháp chiết:

- Mẫu dược liệu được chiết bằng cách ngâm trong dung môi methanol với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm (Elma S300H, Đức)

- Các phân đoạn chiết được thực hiện theo phương pháp chiết lỏng-lỏng

để phân đoạn sơ bộ các hợp chất dựa theo độ phân cực của chúng và tính không trộn lẫn của các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau

+ Sắc ký lớp mỏng (SKLM): SKLM được thực hiện trên bản mỏng

tráng sẵn là silica gel DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), hay pha đảo

RP18 F254S (Merck) Các vệt chất được phát hiện bằng soi dưới đèn UV ( ở hai bước sóng 254 và 365 nm), hiện màu với FeCl3 5%, hoặc dung dịch H2SO410% và hơ nóng

+ Sắc ký lớp mỏng điều chế: SKLM điều chế được thực hiện trên bản

mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 đế kính (Merck, ký hiệu 105875) Quan sát vùng chất di chuyển trên bản bằng đèn UV (254 nm) và cắt dìa bản mỏng rồi hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng để xác định vùng bản mỏng chứa chất phân lập Tách phần silica gel chứa chất phân lập ra khỏi đế kính và

giải hấp bằng methanol

Trang 30

+ Sắc ký cột: sắc ký cột được tiến hành theo phương pháp cột hở (sắc

ký cột trọng lực) với các chất hấp phụ là silica gel, pha đảo, sephadex LH-20, hoặc diaion HP-20 Silica gel có cỡ hạt là 40-63 µm (240-430 mesh) Pha đảo

sử dụng loại silica gel C-18 (RP-18) có cỡ hạt 75 - 150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Sắc ký cột được triển khai trên các cột sắc ký thủy tinh, ở áp suất khí quyển Dung môi rửa giải được hứng tự động trên máy hứng phân đoạn Eyela DC-1200 Fraction collector Quá trình phân tách các hợp chất trên cột sắc ký được theo dõi bằng SKLM

+ Dung môi được cất loại hoặc thu hồi trên hệ thông máy cấy quay chân không

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập

+ Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter

+ Phổ cộng hưởng từ nhân một chiều (1D) 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, hai chiều (2D) HMQC, HMBC được đo trên máy Jeol 600 MHz (Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân 600 MHz, Jeol, Trường Đại học Quốc gia Chungnam Hàn Quốc) và Bruker 500 MHz Spectrometer (Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân

500 MHz, Bruker, Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Các hợp chất được pha trong dung môi đo NMR thích hợp (hòa tan được chất phân tích, tương tự với tài liệu tham khảo, cho các pic phổ ít bị chồng lấp )

2.3 Thu thập và xử lý mẫu loài S nigrum

Mẫu nghiên cứu được thu thập và xử lý theo phương pháp thường quy

sử dụng trong phân lập các hợp chất tự nhiên từ nguồn dược liệu thực vật

- Mẫu thực vật được thu thập và giám định tên khoa học và làm tiêu bản bởi các nhà thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Mẫu thực vật sau khi thu thập được rửa sạch, để ráo nước, cắt thành các đoạn nhỏ 3-5 cm sau đó được sấy khô ở 500C Mẫu khô tiếp tục đem nghiền nhỏ dưới dạng bột và bảo quản trong phòng lưu mẫu đến khi nghiên cứu

Trang 31

2.4 Chiết xuất, tạo phân đoạn giàu hợp chất saponin và phân lập một số hợp chất steroidal saponin từ loài S nigrum

Mẫu nghiên cứu (dạng bột khô, 5.0 kg) được chiết với 10L methanol ở 40°C trong bể siêu âm (30 phút) rồi lọc lấy dịch methanol Quá trình chiết được thực hiện lặp lại 3 lần, các dịch methanol được gộp lại và cất thu hồi dung môi trên máy cất quay chân không thu được cặn chiết methanol (450 g) Cặn chiết methanol được tạo huyền phù với 3L nước cất sau đó tiến hành chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan, dichloromethane, EtOAC, n-butanol Cất thu hồi dung môi trên máy cất quay chân không lần lượt thu được các cặn chiết tương ứng n-hexan (34 g), dichloromethane (37 g), EtOAc (59 g), và n-butanol (217 g) Phân đoạn giàu hợp chất saponin (phân đoạn butanol, SNB) được tẩm đều với silica gel và tiến hành chạy sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ silica gel, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane-methanol tăng dần thể tích methanol (0-100% methanol) thu được 6 phân đoạn, ký hiệu SNB1-SNB6 Phân đoạn SNB1 tiếp tục được tinh chế trên cột sắc ký sửa dụng chất hấp phụ silical gel, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (4/1/0,1, v/v/v) thu được bốn

phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu SNB1A- SNB1D Hợp chất SN4 (110 mg) được

phân lập từ phân đoạn SNB1A sau khi tiến hành sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ pha đảo RP-18 rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (2/1, v/v) Phân đoạn SNB4 được đưa lên cột sắc ký với pha tĩnh là silica gel và pha động là

hệ dung môi acetone/ dichloromethane/ nước (3/1/0.1, v/v/v) thu được ba phân đoạn ký hiệu SNB3A- SNB3C Tinh chế phân đoạn SNB3A trên cột sắc ký pha đảo RP-18 và rửa giải với hệ dung môi acetone/nước (1/1, v/v)

thu được hợp chất SN1 (36 mg)

Trang 32

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất SN1-SN4 từ loài S nigrum

Từ phân đoạn SNB4C, tiến hành sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ pha đảo RP-18 và rửa giải với hệ dung môi acetone/nước (2/3, v/v) thu được

hợp chất SN2 (23 mg) Tiếp đó, phân đoạn SNB6 cũng được đưa lên cột

sắc ký với chất hấp phụ silica gel và rửa giải với hệ dung môi ethyl acetate/ methanol/ nước (5/1/0.1, v/v/v) nhận được hai phân đoạn SNB6A và SNB6B Phân đoạn SNB6B tiếp tục được tinh chế trên cột sắc ký với chất hấp phụ pha đảo RP-18 và rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (1/1,

v/v) để thu được hợp chất SN3 (62 mg) Các hợp chất SN1-SN4 sau khi

phân lập được tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân để phân tích cấu trúc hóa học của chúng

Trang 33

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1 Mẫu thực vật

Mẫu dược liệu được thu thập tại Thái Bình vào tháng 3 năm 2017

Tên khoa học, Solanum nigrum L., được xác định bởi TS Nguyễn Thế

Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản (ký hiệu NCCT-P51) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Loài này thường được người dân gọi với một số tên như lu lu đực, thù lù đực, long quỳ

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu thu thập về loài S nigrum

Trang 34

3.2 Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài S nigrum

Trang 35

3.3 Phân tích cấu trúc hóa học, đánh giá hàm lượng của steroidal saponin

từ loài S nigrum

3.3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất SN1

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SN1

Hợp chất SN1 phân lập được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình

màu trắng Phân tích phổ 1H-NMR cùng với phổ HMQC của SN1 nhận thấy

xuất hiện các tín hiệu bao gồm: một proton olefin tại δH 5.37 (1H, br s); tín hiệu của ba proton anome tại δH 5.18 (1H, br s), 4.82 (1H, br s), và 4.48 (1H, d, J =

7.8 Hz); bốn nhóm methyl bậc 2 tại δH 1.24 (3H, d, 6.0 Hz), 1.22 (3H, d, 6.0 Hz),

0.94 (3H, d, J = 7.2 Hz), và 0.77 (3H, d, J = 6.6 Hz); hai nhóm methyl bậc 3 tại

δH 1.03 (3H, s) và 0.79 (3H, s) Phổ 13C-NMR và DEPT của SN1 cho biết sự có

mặt của 45 carbon bao gồm bốn carbon không liên kết với hydro, 24 nhóm methine, 11 nhóm methylene, và sáu nhóm methyl Các tín hiệu phổ 1H-và 13C-

NMR này gợi ý cho cấu trúc hóa học của hợp chất SN1 là một sterol glycoside

Mặt khác sự sự xuất hiện của tín hiệu carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 110.6 (C) là một dấu hiệu cho biết cấu trúc hóa học của là một sterol khung spirostane Cặp tín hiệu carbon olefin tại δC 141.9 (C) và 122.6 (CH) đặc trưng cho sự có mặt của một liên kết đôi tại C-5/C-6 của khung sterol Bên cạnh tín hiệu của 27 carbon thuộc khung sterol, 18 tín hiệu carbon còn lại cho thấy sự

có mặt của 3 phân tử đường hexose Mặt khác hai tín hiệu proton anome dạng broad singlet và 2 tín hiệu của nhóm methyl bậc 2 thuộc các phân tử đường đã

chỉ ra 2 trong số 3 phân tử đường của SN1 có thể là rhamnose, một dạng đường

Trang 36

deoxy thường gặp trong tự nhiên Tiếp đó, cấu trúc hóa học của SN1 được khẳng

định lại bằng phân tích phổ hai chiều HMQC, HMBC, và COSY Tương tác HMBC giữa H-19 (δH 1.03) với carbon C-1 (δC 38.6)/C-5 (δC 141.9)/C-9 (δC51.7)/C-10 (δC 38.0) cho phép xác định vị trí nhóm methyl tại C-10 Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 0.79) với carbon C-12 (δC 40.9)/C-13 (δC 41.4)/C-14 (δC 57.8)/C-17 (δC 63.7), giữa H-21 (δH 0.94) với carbon C-17 (δC 63.7)/C-20 (δC42.9)/C-22 (δC 110.6) cho phép xác định vị trí của hai nhóm methyl khác lần lượt tại C-13 và C-20 Vị trí nhóm methyl còn lại ở C-25 trên khung aglycone cũng được chỉ ra bởi tương tác HMBC giữa giữa H-27 (δH 0.77) với carbon C-24 (δC 29.9)/C-25 (δC 31.4)/C-26 (δC 67.8) Đồng thời độ chuyển dịch hóa học của C-26 (δC 67.8) và tương tác HMBC giữa H-26 và C-22 đã khẳng định sự đóng vòng spiro giữa C-22 và C-26 qua nguyên tử oxy Cấu hình tại C-25 được xác định là 25R bởi giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-23 (δC 32.4), C-24 (29.9), C-25 (31.4), C-26 (67.8), C-27 (17.5) so sánh với các hợp chất tương tự có cấu hình 25R [C-23 (δC 31.7), C-24 (29.2), C-25 (30.5), C-26 (66.8), C-27 (17.2)] trong hợp chất diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosyl- (1→4)-α-L-rhamnopyranosyl -(1→4) - β-D-glucopyranosyl - (1→4) - [α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside [22] và 25S [C-23 (δC 26.3), C-24 (26.1), C-25 (27.5), C-26 (65.0), C-27 (16.3)] trong hợp chất yamogenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-

glucopyranoside [23] Chuỗi đường liên kết với aglycone tại C-3 cũng được xác nhận bởi tương tác giữa proton anome Glc H-1′ (δH 4.48) với carbon C-3 (δC79.3) Đồng thời, dạng tín hiệu của Glc H-4′ [δH 3.50 (dd, J = 9.0, 9.0 Hz)] cùng

với các tương tác HMBC bao gồm RhaI H-1″ (δH 5.18)/ Glc C-2′ (δC 79.3), RhaII H-1‴ (δH 4.82)/Glc C-4′ (δC 79.9), Glc H-4′ (δH 3.50)/ Glc C-6′ (δC 61.9) cũng gợi ý cho sự có mặt của đường glucose và các liên kết glycoside giữa Rha C-1″ và Glc C-2′, giữa Rha C-1‴ và Glc C-4′ Từ những dẫn chứng trên cho

phép xác định cấu trúc hóa học của SN1 là dioscin Các số liệu phổ 1H- và 13

C-NMR của SN1 cũng hoàn toàn phù hợp với các số liệu phổ đã công bố của hợp

chất dioscin [22]

Trang 37

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của phần aglycone của hợp chất SN1

a)Đo trong CD3OD, b150 MHz, c600 MHz, #δ C của hợp chất dioscin đo trong

pyridine-d 5 [22]; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp

Trang 38

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của phần đường của hợp chất SN1

a)Đo trong CD3OD, b150 MHz, c600 MHz, #δ C của hợp chất dioscin đo trong

pyridine-d 5 [22]; mult: độ bội tín hiệu, *)Tín hiệu bị chồng lấp

Trang 39

Hình 3.3 Phổ 1 H-NMR của hợp chất SN1

Trang 40

Hình 3.5 Phổ DEPT-135 của hợp chất SN1

Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất SN1

Định dạng
Số trang	94
Dung lượng	9,46 MB