Khóa luận tốt nghiệp phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống hoàng tinh hoa trắng (disporopsis longifolia craib) bằng chỉ thị issr

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG HOÀNG TINH HOA TRẮNG (DISPOROPSIS LONGIFOLIA CRAIB) BẰNG CHỈ THỊ ISSR Sinh viên : Nguyễn Anh Bảo Nhi Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Trường Sơn HÀ NỘI – 2021   LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết luận văn tơi trực tiếp thực Các số liệu kết cơng bố luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Anh Bảo Nhi i    LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Trường Sơn – Bộ môn Sinh học thực vật- khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn cán thuộc môn Sinh học thực vật giúp tơi có định hướng xác để thực đề tài ln động viên tơi có đóng góp chun mơn q báu để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ, người thân gia đình bạn bè ln ủng hộ, khuyến khích để tơi vững vàng suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Anh Bảo Nhi ii    MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TÓM TẮT viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) 2.1.1 Phân loại học 2.1.2 Đặc điểm thực vật học 2.1.3 Phân bố đặc điểm sinh thái 2.1.4 Thành phần hóa học dược tính 2.1.5 Giá trị Hoàng tinh hoa trắng Việt Nam 2.2 Tình hình nghiên cứu Hoàng tinh hoa trắng Việt Nam 2.3 Một số nghiên cứu Hoàng tinh hoa trắng giới 2.4 Một số thị phân tử sử dụng nghiêm cứu phân tích đa dạng di truyền 2.4.1 Khái niệm thị phân tử 2.4.2 Một số kỹ thuật thị DNA 2.4.3 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản (InterSimple Sequence RepeatISSR) 13 2.5 Polymerase Chain Reacion (PCR) 14 2.5.1 Khái niệm nguyên lý 14 iii    2.5.2 Thành phần phản ứng PCR 15 2.5.3 Chu trình nhiệt 17 2.5.4 Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật PCR 18 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.1.1 Thời gian 19 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Đối tượng nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất phịng thí nghiệm 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 22 3.5.2 Phương pháp PCR 22 3.5.3 Điện di gel Agarose 23 3.5.4 Phương pháp đánh giá, xử lý số liệu 24 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 25 4.2 Phân tích đa dạng di truyền thị phân tử ISSR 26 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 36 iv    DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt   Tên đầy đủ µl Microlitre AFLP Ampilified Fragment Length Polymorphism DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediamine tetracetic acid PCR Polymerase Chain Reaction dNTPs Deoxynucleotide Solution Mix RAPD Random Amplified Polymorphism DNA ISSR Inter-Simple Sequence Repeats RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate SSR Simple sequence repeat CTAB Cetyl trimethylammonium bromide TAE Tris base, acetic acid and EDTA PIC Polymorphic Information Content Rp Resolving power   v    DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách ký hiệu mẫu 19 Bảng 3.2 Trang thiết bị dụng cụ hóa chất 20 Bảng 3.3 Danh sách mồi ISSR 21 Bảng 3.4 Thành phần chất dùng cho phản ứng PCR với mồi ISSR 23 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng 4.1 Nồng độ mức độ tinh mẫu DNA nghiên cứu 26 Bảng 4.2 Mức độ đa hình mẫu Hồng tinh hoa trắng phân tích chị thị ISSR 28 Bảng 4.3: Hệ số tương đồng di truyền dựa thị ISSR 30 vi    DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh Lá, thân, hoa, Hoàng tinh trắng Hình 2.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 18 Hình 4.1 Kết điện di ADN tổng số 25 Hình 4.2 Hình ảnh kết điện di sản phẩm PCR mồi ISSR-T3 29 Hình 4.3 Sơ đồ tương đồng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng dựa vào thị ISSR 32 Hình 4.4 Phân tích thành phần (PCA) mối liên hệ di truyền 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng 33   vii    TĨM TẮT Đã thực phân tích đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng 17 thị phân tử ISSR Có tổng số 111 locus phát với 1150 sản phẩm PCR Chỉ số đa hình PIC trung bình 17 mồi ISSR 0,34 dao động từ 0,2 - 0,45 Hệ số tương đồng di truyền 21 mẫu giống dao động khoảng 0,452 – 0,910 chứng tỏ đa dạng vật liệu nguồn gen 21 mẫu giống   viii   Phần I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong sống đại người ta quan tâm nhiều đến sức khỏe Việc tìm hiểu sửa dụng nguồn dược liệu thiên nhiên trọng Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) loài dược liệu quý đưa vào Dược điển Việt Nam tập 2, 3: vị thuốc ghi “Danh y biệt lục” với nhiều công tác dụng chữa bệnh tốt hữu ích Hồng tinh trắng có tác dụng: bổ âm, bổ phế, bổ huyết, sinh tân dịch, bồi dưỡng thể, đắp chữa sưng tấy, đụng dập, trĩ kết hợp với vị thuốc để chữa nhiều bệnh khác (Đỗ Tất Lợi, 2004) Hiện có cơng trình nghiên cứu bảo tồn phát triển nguồn gen loài thuốc địa quý Ở nước ta cơng tác bảo tồn lồi dược liệu nói chung Hồng tinh trắng nói riêng chưa thực gắn liền với phát triển Lồi có nhiều dịng/ giống khác tự nhiên việc đem vào sản xuất chưa mang giá trị số lượng chất lượng Chính cần có nghiên cứu đa dạng nguồn gen loài để phục vụ cho bảo tồn nguồn giống phục vụ cho biện pháp nhân giống khác Sự phát triển thị phân tử giải phóng nhà chọn giống khỏi khối lượng lớn công việc phải chọn lọc, phát lượng cá thể quan tâm tổng số cá thể khác nhờ việc xác định có mặt hay vắng mặt thị phân tử liên kết với alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình Một số thị phân tử sử dụng nghiên cứu gen di truyền phổ biến SSR, RFLP, AFLP, RAPD, ISSR… ISSR lựa chọn phân tích đa dạng di truyền ưu điểm kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đắt, đơn giản, khơng cần thơng tin trình tự, u cầu lượng ADN nhỏ, có tính đa hình cao 1    chứng tỏ DNA có bị đứt gãy Tuy nhiên, lượng DNA bị đứt gãy nhiều so với băng DNA kích thước lớn Kết cho phép chúng tơi kết luận kích thước đoạn ADN tách chiết đáp ứng cho phản ứng ISSR-PCR Tiếp tục kiểm tra mức độ tinh nồng độ DNA Kết kiểm tra DNA tổng số sau tách chiết thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Nồng độ mức độ tinh mẫu DNA nghiên cứu STT OD260/280 Nồng độ (ng/µl) STT OD260/280 Nồng độ (ng/µl) 1,81 242 12 1,80 191 1,69 341 13 1,77 250 1,57 234 14 1,65 134 1,66 223 15 1,89 138 1,78 110 16 1,66 12 1,76 74 17 1,94 85 1,74 144 18 1,88 76 1,80 229 19 1,93 127 1,71 213 20 1,74 754 10 1,69 49 21 1,90 253 11 1,65 227 Từ bảng cho thấy độ tinh nồng độ ADN cao Chất lượng ADN đảm bảo để sử dụng phản ứng PCR Như vậy, DNA tổng số tách chiết đáp ứng tốt tiêu chuẩn tính nguyên vẹn, tinh nồng độ ADN sau pha lỗng tới nồng độ ng/µl bảo quản -20°C 4.2 Phân tích đa dạng di truyền thị phân tử ISSR Nghiên cứu sử dụng 22 mồi ISSR để đánh giá đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng Kết chạy điện di cho thấy số 22   26   mồi khảo sát có 17 mồi ISSR cho băng DNA rõ ràng Do đó, chúng tơi trình bày kết 17 mồi ISSR 17 mồi ISSR nhân tổng số 111 locus, trung bình 6.53 locus/mồi (dao động từ - 10 locus) Chỉ thị UBC-824 nhân số locus lớn (10 locus), thị UBC-857 ISSR-T3 nhân locus Chỉ thị UBC-813, UBC-873 UBC-889 cho kết nhân số locus (4 băng) Số locus nhân trung bình mẫu giống giao động từ 1.62 đến 4.48 (locus/giống), mồi UBC-857 cho số lượng băng đa hình cao trồng (94 băng), mồi UBC-873 cho số lượng băng đa hình thấp trồng (34 băng) Các mồi phát tổng số 1150 sản phẩm PCR, trung bình 67,65 sản phẩm PCR/mồi 54,76 sản phẩm PCR/mẫu giống Trong thị UBC-857 nhân số sản phẩm PCR cao đạt 94 sản phẩm thị UBC-873 nhân 34 sản phẩm Chỉ số đa hình PIC trung bình/mồi đạt 0,34 Kết chứng tỏ khả phát đa hình mồi 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng cao Trong đó, mồi có số PIC cao UBC-834 0,45 mồi có số PIC thấp UBC-808 0,2 Chỉ số sai khác cặp mồi (Rp) số tương quan kiểu gen với thị phân tử DNA, số Rp cao chứng tỏ thị phân tử hữu hiệu việc phân nhóm kiểu gen Ta thấy số trung bình 6,44 (dao động từ 3,24 đến 8,95) Chỉ số Rp cao thuộc mồi UBC-857 8,95 số Rp thấp thuộc mồi UBC-873 3,24   27   Bảng 4.2 Mức độ đa hình mẫu Hồng tinh hoa trắng phân tích chị thị ISSR TT mồi 10 11 12 13 14 15 16 17 Tên mồi Trình tự mồi Tm ISSR-T3 ACACACACACACCG 44 UBC-808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 52,4 UBC-813 CTCTCTCTCTCTCTCTT 50 UBC-814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 50 UBC-815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 52,4 UBC-824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 52,4 UBC-827 ACACACACACACACACG 52,4 UBC-834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 51,6 UBC-841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 53,9 UBC-848 CACACACACACACACARG 53,9 UBC-852 CTCTCTCTCTCTCTCTRA 51,6 UBC-856 ACACACACACACACACYA 51,6 UBC-857 ACACACACACACACACYG 53,9 UBC-858 TGTGTGTGTGTGTGTGRT 51,6 UBC-860 TGTGTGTGTGTGTGTGRA 51,6 UBC-873 GACAGACAGACAGACA 48,2 UBC-889 DBDACACACACACACAC 47,6 Tổng số Trung bình/mồi Giá trị trung bình /mẫu giống Số locus nhân 5 10 7 7 4 111 6,53 5,29 28   Tỷ lệ locus đa hình (%) 88.89 60 75 80 100 100 100 100 100 100 85.71 95.24 100 100 100 100 50 1535 90,28 73,09 Tổng số băng nhân 93 54 61 65 62 80 69 66 68 62 64 88 94 76 57 34 57 1150 67,65 54,76 Số băng/ mẫu giống 4,43 2,57 2,9 3,1 2,95 3,81 3,29 3,14 3,24 2,95 3,05 4,19 4,48 3,62 2,71 1,62 2,71 54,76 3,22 2,61 PIC Rp=∑Ib 0.34 0.2 0,33 0,25 0,4 0,36 0,42 0,45 0,4 0,32 0,33 0,34 0,41 0,44 0,41 0,24 0,22 8,86 5,14 5,81 6,19 5,9 7,62 6,75 6,29 6,48 5,9 6,1 8,38 8,95 7,24 5,43 3,24 5,43 0,34 6,44   Hình 4.2 Hình ảnh kết điện di sản phẩm PCR mồi ISSR-T3   29   Bảng 4.3: Hệ số tương đồng di truyền dựa thị ISSR Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây 11 10 Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây Cây 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cây 1.000 Cây 0.721 1.000 Cây 0.667 0.739 1.000 Cây 0.631 0.604 0.631 1.000 Cây 0.676 0.613 0.604 0.712 1.000 Cây 0.640 0.613 0.631 0.712 0.802 1.000 Cây 0.613 0.604 0.649 0.712 0.739 0.739 1.000 Cây 0.622 0.667 0.640 0.667 0.586 0.622 0.667 1.000 Cây 0.568 0.685 0.712 0.631 0.604 0.622 0.613 0.730 1.000 Cây 10 0.667 0.658 0.613 0.586 0.703 0.631 0.694 0.559 0.631 1.000 Cây 11 0.685 0.640 0.577 0.568 0.667 0.595 0.640 0.541 0.613 0.910 1.000 Cây 12 0.568 0.568 0.631 0.577 0.595 0.586 0.586 0.577 0.559 0.604 0.640 1.000 Cây 13 0.613 0.676 0.649 0.631 0.649 0.595 0.694 0.577 0.703 0.676 0.640 0.604 1.000 Cây 14 0.658 0.721 0.640 0.631 0.712 0.640 0.721 0.604 0.568 0.721 0.685 0.667 0.667 1.000 Cây 15 0.613 0.622 0.622 0.595 0.559 0.613 0.640 0.595 0.505 0.514 0.550 0.631 0.532 0.703 1.000 Cây 16 0.613 0.586 0.577 0.568 0.559 0.541 0.640 0.613 0.505 0.604 0.604 0.586 0.604 0.667 0.658 1.000 Cây 17 0.631 0.586 0.550 0.577 0.559 0.523 0.604 0.595 0.505 0.586 0.568 0.613 0.604 0.685 0.640 0.748 1.000 Cây 18 0.613 0.622 0.514 0.541 0.541 0.559 0.550 0.559 0.523 0.586 0.586 0.613 0.604 0.685 0.658 0.676 0.784 1.000 Cây 19 0.604 0.577 0.541 0.495 0.586 0.514 0.577 0.532 0.514 0.631 0.613 0.586 0.577 0.658 0.649 0.631 0.631 0.703 1.000 Cây 20 0.559 0.568 0.495 0.505 0.577 0.541 0.550 0.486 0.468 0.640 0.640 0.559 0.514 0.631 0.568 0.658 0.640 0.622 0.649 1.000 Cây 21 0.519 0.500 0.490 0.471 0.538 0.510 0.529 0.452 0.452 0.644 0.644 0.577 0.519 0.625 0.596 0.635 0.567 0.644 0.673 0.750   30   1.000   Hệ số tương đồng di truyền thể mối quan hệ di truyền mẫu, hệ số tương đồng di truyền cao chứng tỏ hai mẫu gần mặt di truyền ngược lại, hai mẫu có hệ số tương đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Từ Bảng 4.3 ta thấy hệ số tương đồng di truyền 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng dao động khoảng 0,452 – 0,910 Hệ số tương đồng di truyền cao 0,910 mẫu số 10 11, hệ số tương đồng di truyền thấp 0,452 mẫu 21 Như vậy, mẫu giống 10 11 có mối quan hệ gần gũi mặt di truyền hai mẫu 21 có mối quan hệ di truyền xa  Hiện chưa có cơng trình cơng bố đa dạng di truyền hoàng tinh hoa trắng Việt Nam giới Huỳnh Trường Huê (2020) phân tích dạng di truyền 16 mẫu giống nghệ đen (Curcuma zedoaria Rosc.) thị phân tử ISSR Kết cho thấy mối quan hệ di truyền giống khoảng từ 0,63 đến Nghiên cứu Hoàng Đặng Hiếu el al (2016) đánh giá quan hệ di truyền quần thể Ba Kích (Morinda officinalis F C How) kết luận hệ số tương đồng di truyền dao động khoảng 0,31 đến 0,88 Từ số liệu thu thập phân tích tìm hiểu kết nghiên cứu trước rút kết luận: loài dược liệu Việt Nam qua nghiên cứu có khác biệt mặt di truyền   31   Hình 4.3 Sơ đồ tương đồng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng dựa vào thị ISSR Từ hệ số tương đồng, sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, ta vẽ sơ đồ thể mối quan hệ di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh thể Hình 4.3 Ở hệ số tương đồng di truyền trung bình 0,61, 21 mẫu giống hồng tinh hoa trắng chia thành nhóm nhóm I có 13 mẫu giống, nhóm II có mẫu giống 12 nhóm III có mẫu giống Như vậy, thấy 21 mẫu giống hồng tinh hoa trắng có đa dạng di truyền cao Để có góc nhìn khác mối quan hệ di truyền 21 cá thể hoàng tinh hoa trắng, chúng tơi tiến hành phân tích thành phần (Principal Component Analysis) Đây kỹ thuật làm giảm số chiều liệu có giúp người đọc nhận biết cách trực quan Kết biểu thị Hình 4.4   32   Observations (axes F1 and F2: 49.35 %) 0.5 Cây  10  0.4 Cây  11 0.3 Cây 5  F2 (15.45 %) 0.2 Cây 21 0.1 Cây 7  Cây 13 Cây 20 Cây 14 Cây  1 Cây 6  Cây 19 Cây 9 Cây 2 ‐0.1 Cây 12 Cây 4  Cây 3 Cây 18 Cây 16  ‐0.2 Cây 17  Cây 8 Cây 15 ‐0.3 ‐0.4 ‐0.5 ‐0.4 ‐0.3 ‐0.2 ‐0.1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 F1 (33.90 %) Hình 4.4 Phân tích thành phần (PCA) mối liên hệ di truyền 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng Kết hình 4.4 cho thấy, tương tự kết phân tích thể sơ đồ quan hệ di truyền 21 mẫu Hồng tinh hoa trắng, phân tích PCA nhóm với cá thể giống phân tích phương pháp UPGMA sơ đồ hình 4.3 Mặc dù vậy, phân tích PCA cho thấy mẫu giống hồng tinh hoa trắng phân tán tương đối xa góc phần tư trục tọa độ Kết lần khẳng định đa dạng di truyền mẫu giống hoàng tinh hoa trắng cao     33   Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã thực phân tích đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng 17 thị phân tử ISSR Có tổng số 111 locus phát với 1150 sản phẩm PCR Chỉ số đa hình PIC trung bình 17 mồi ISSR 0,34 dao động từ 0,2 - 0,45 Hệ số tương đồng di truyền 21 mẫu giống dao động khoảng 0,452 – 0,910 chứng tỏ đa dạng vật liệu nguồn gen 21 mẫu giống 5.2 Kiến nghị Có thể kết hợp với chị thị khác chị thị RAPD, AFLP… phân tích đa dạng nguồn gen Hoàng tinh hoa trắng   34   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Khoa Học Công Nghệ (2007) Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 937 - 938 Nguyễn Thị Phương Dung (2002), “Góp phần nghiên cứu chế biến vị thuốc Hồng tinh”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Trần Ngọc Hải (2014), Khai thác phát triển nguồn gen hai loài thuốc Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib 1912) Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu.1940) số tỉnh vùng miền núi phía bắc, Báo cáo dự án cấp Quốc gia, Trường ĐH Lâm nghiệp Huỳnh Trường Huê (2020) Khảo sát đa dạng di truyền 16 mẫu giống nghệ đen (Curcuma zedoaria Rosc.) thị phân tử ISSR Tạp chí khoa học Quốc tế AGU ISSN 0866 – 8086 Đỗ Tất Lợi (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB y học Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí sinh học: 36(3): 265- 294 Đặng Ngọc Hùng, Hoàng Thị Phong (2013) Nghiên cứu nhân giống Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia) hom củ huyện Bảo Lâm, tỉnh Cao Bằng 10 Hoàng Đăng Hiếu, Chu Thị Thu Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà (2016)  Sử dụng thị ISSR việc đánh giá đa dạng di truyền quẩn thể Ba Kích Quảng Ninh Tạp chí sinh học: 38(1): 89-95 Tiếng Anh 11 Acharya K.P and M.B Rokaya (2009) Ethnobotanical survey of medicinal plants traded in the streets of Kathmandu valley Sci World 3: 44-48 12 Thomas S.C.Li (2006) Taiwanese Native Medicinal Plants, Taylor & Francis 13 Winkel, G.V(2006), Finding plant Nepal, The plant Rev.11:188-191 14 Pengenlly Andrew (2004), The Constituents of Medicinal Plants, Medical Herbalist   35   PHỤ LỤC UBC-808 UBC-813 UBC-814 UBC-815   36   UBC- 824 UBC-827 UBC-834 UBC-841   37   UBC-848 UBC-852 UBC-856 UBC-857   38   UBC-858 UBC-860 UBC-873 UBC-889   39   ISSR-T3     40