Phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống lúa kháng rầy bằng chỉ thị rapd (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY BẰNG CHỈ THỊ RAPD Hà Nội – 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY BẰNG CHỈ THỊ RAPD Sinh viên thực :VŨ THỊ MAI Mã sinh viên: :620402 Lớp: :K62 - CNSHA Ngành: :Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: :Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: :TS Đinh Trường Sơn Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Phân tích đa dạng di truyền số mẫu giống lúa kháng rầy thị RAPD” cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Đinh Trường Sơn Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài hoàn toàn trung thực, khách quan Các phần tham khảo, trích dẫn ghi rõ phần tài liệu tham khảo Nếu phát có gian lận tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên Vũ Thị Mai i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận tốt nghiệp, lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS Đinh Trường Sơn người thầy tận tình hướng dẫn bảo em suốt trình nghiên cứu thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quý thầy, giáo Khoa Cơng nghệ sinh học nói riêng giảng viên trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam nói chung tận tình giảng dạy, trang bị cho em kiến thức quý giá suốt quãng thời gian học tập Học viện Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân ln bên cạnh, ủng hộ, khích lệ tinh thần giúp em hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên Vũ Thị Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT .viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung lúa 2.1.1 Đặc điểm lúa 2.1.2 Giá trị lúa gạo 2.2 Giới thiệu chung rầy nâu 2.3 Tình hình nghiên cứu phát triển giống lúa kháng rầy nâu giới Việt Nam 2.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển giống lúa kháng rầy nâu giới 2.3.2 Tình hình nghiên cứu phát triển giống lúa kháng rầy nâu Việt Nam 2.4 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị RAPD phân tích đa dạng di truyền 2.4.1 Khái niệm thị phân tử 2.4.2 Chỉ thị RAPD 11 iii 2.4.3 Một số nghiên cứu áp dụng thị RAPD vào đánh giá đa dạng di truyền giống lúa kháng rầy 12 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng 15 3.2 Hóa Chất 15 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 17 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số 21 4.2 Sử dụng thị phân tử RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 22 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid CTAB Cetyl trimethylammonium bromide EtOH Ethanol IRRI International Rice Research Institute NTSYS Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris-acetate buffer PIC Polymorphic Information Content Rp Resolving power v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách ký hiệu mẫu giống lúa 15 Bảng 3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.3 Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 4.1 Kết số OD260/280 nồng độ mẫu nghiên cứu 22 Bảng 4.2 Kết nhân mồi RAPD giống lúa 23 Bảng 4.3 Tỷ lệ phần trăm băng đa hình giống lúa 25 Bảng 4.4 Tỷ lệ đa hình locus với 21 mồi RAPD 26 Bảng 4.5 Giá trị PIC Rp 28 Bảng 4.6 Hệ số tương đồng di truyền mẫu giống lúa thị RAPD 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 DNA tổng số 21 Hình 4.2 Hình ảnh điện điện di sản phẩm PCR mồi OPO-01 36 Hình 4.3 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa kháng rầy nâu 38 vii TÓM TẮT Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống lúa bao gồm: giống lúa kháng rầy nâu giống lúa nhiễm rầy chuẩn (TN1) thị phân tử RAPD Tách chiết DNA tổng số mẫu có độ tinh DNA cao nồng độ DNA cao Sau khảo sát 38 mồi RAPD, 21 mồi RAPD chọn có sản phẩm PCR rõ ràng Kết phát 935 băng có 371 băng đa hình, chiếm 39,68% Tỷ lệ băng đa hình mẫu thay đổi từ 34,26% - 43,55% Tổng số 157 locus phát 86 locus đa hình Chỉ số đa hình PIC 21 mồi RAPD dao động từ 0,08 - 0,37 Chỉ số trung bình Rp 21 mồi RAPD 11,3 (dao động từ – 15,28) Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu giống lúa dao động từ 0,682 đến 0,898 Ở hệ số tương đồng di truyền 0,79 giống lúa chia thành nhóm sơ đồ quan hệ di truyền viii Bảng 4.6 Hệ số tương đồng di truyền mẫu giống lúa thị RAPD TN1 TN1 Hangangchal Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1,000 Hangangchal 0,783 1,000 Pokkali 0,720 0,720 1,000 IRBB10 0,803 0,815 0,777 1,000 ISC3 0,752 0,726 0,688 0,783 1,000 KR8 0,809 0,732 0,720 0,803 0,777 1,000 KR1 0,745 0,758 0,682 0,803 0,803 0,898 1,000 IRBB8 0,777 0,752 0,688 0,822 0,771 0,803 0,841 1,000 Hệ số tương đồng di truyền thể mối quan hệ di truyền mẫu, hệ số tương đồng di truyền cao chứng tỏ hai mẫu gần mặt di truyền ngược lại, hai mẫu có hệ số tương đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng xa Từ bảng 4.6 cho ta thấy hệ số tương đồng mẫu dao động khoảng 0,682 – 0,898 Hệ số tương đồng di truyền cao 0,898 mẫu KR1 KR8, hệ số tương đồng di truyền thấp 0,682 mẫu KR1 Pokkali Trong mẫu giống lúa TN1 giống đối chứng (nhiễm rầy chuẩn), giống lại kháng rầy nâu vậy, số mẫu giống lúa kháng rầy nâu hai mẫu KR1 KR8 có mối quan hệ gần mặt di truyền, hai mẫu KR1 Pokkali có mối quan hệ xa Từ hệ số tương đồng, sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, ta vẽ sơ đồ thể mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa thể hình 4.3 37 Hình 4.3 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa kháng rầy nâu Kết phân tích hệ số tương đồng di truyền 0,79, giống lúa chia thành nhóm Trong đó, có nhóm có cá thể bao gồm: nhánh (TN1), nhánh (Hanangchal), nhánh (ISC3), Nhánh (Pokkali) Nhóm gồm mẫu IRBB10, IRBB8, KR8, KR1 38 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân tích đa dạng di truyền mẫu giống lúa bao gồm: giống lúa kháng rầy nâu giống lúa nhiễm rầy chuẩn (TN1) thị phân tử RAPD Tách chiết DNA tổng số mẫu có độ tinh DNA cao nồng độ DNA cao Sau khảo sát 38 mồi RAPD, 21 mồi RAPD chọn có sản phẩm PCR rõ ràng Kết phát 935 băng có 371 băng đa hình, chiếm 39,68% Tỷ lệ băng đa hình mẫu thay đổi từ 34,26% - 43,55% Tổng số 157 locus phát 86 locus đa hình Chỉ số đa hình PIC 21 mồi RAPD dao động từ 0,08 - 0,37 Chỉ số trung bình Rp 21 mồi RAPD 11,3 (dao động từ – 15,28) Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu giống lúa dao động từ 0,682 đến 0,898 Ở hệ số tương đồng di truyền 0,79 giống lúa chia thành nhóm sơ đồ quan hệ di truyền 5.2 Kiến nghị Tăng số lượng mồi RAPD để khảo sát chọn số lượng mồi có sản phẩm PCR rõ ràng, đa dạng Sử dụng thêm thị SSR, ISSR để phân tích đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống lúa 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Bá Bổng, Nguyễn Văn Huỳnh, Nguyễn Hữu Huân, Hồ Văn Chiến, Ngô Vĩnh Viễn, Mai Thành Phụng, Phạm Văn Dư, Rogelio Cabunagan (2006) Sổ tay hướng dẫn phòng trừ rầy nâu truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Hà Nội Báo Hải Dương (2012) Giống lúa kháng rầy mang lại hiệu cao Truy cập ngày 16/9/2020 https://www.m.2lua.vn/article/giong-lua-khang-ray-manglai-hieu-qua-cao-6124.html?hl=en Lưu Thị Ngọc Huyền, Lưu Minh Cúc (2017) Kết khảo nghiệm sản xuất giống lúa kháng rầy nâu KR1 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 10(83)/2017 Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí sinh học: 36(3): 265- 294 Nguyễn Hoan (2018) Xuất gạo Việt Nam đứng thứ giới Tạp chí Hội Dầu khí Việt Nam Truy cập ngày 16/9/2020 https://petrotimes.vn/xuat-khau-gao-viet-nam-dung-thu-3-the-gioi517376.html Nguyễn Ngọc Đệ (2009) Giáo trình lúa NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Kim Hồng, Nguyễn Đình Cường, Phạm Thị Thanh Mai (2011) Đánh giá phẩm chất gạo số giống lúa kháng rầy nâu trồng Thừa Thiên Huế Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 64, 2011 Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Lê Bắc Việt, Phan Thị Bích Thu, Nguyễn Huy Chung (2016) Xác định nguồn gen kháng rầy nâu số giống lúa thị phân tử Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 261-269, 2016 40 Vietnamplus.vn (2020) Các thị trường xuất gạo Việt Nam năm 2019 Tạp chí tài Truy cập ngày 16/9/2020 http://tapchitaichinh.vn/infomedia/infographics-cac-thi-truong-xuat-khau-gao-cua-viet-nam-nam-2019319334.html Tiếng Anh Catindig J L A., Arida G S., Baehak i S E., Bentur J S., Cuong L Q., Norowi M., Rattanakarn W., Sriratanasak W., Xia J., Lu Z (2009) Situation of planthoppers in Asia Planthoppers: new threats to the sustainability of intensive rice production systems in Asia, IRRI, pp 191-220 Ha P., Lang N and Buu C (2018) Study on Rice Breeding Resistant to Brown Planthoper (Nilaparvata Lugens Stal) in Mekong Delta, Vietnam J Adv Plant Sci 1:105 IRRI (2002) Standard evaluation system for rice Genetic Resources Centre, Manila, Philippine, IRRI (International Rice Research Institute) K Renganayaki, Allan K Fritz, S Sadasivam, Sujata Pammi, Sandra E Harrington, Susan R McCouch, S Mohan Kumar, and Avutu Sam Reddy (2002) Mapping and Progress toward Map-Based Cloning of Brown Planthopper Biotype-4 Resistance Gene Introgressed from Oryza officinalis into Cultivated Rice, O sativa Published November, 2002 pp 2112-2117 Kim S M., Sohn J K (2005) Identification of a rice gene (bph1) conferring resistance to brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) using STS markers Molecules and Cells, 20 (1) pp 30-34 Loka Reddy K., Pasalu I C., Sreenivasa Raju A., Reddy D D R (2004) Biochemical basis of resistance in rice cultivars to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stal) Journal of Entomological Research, 28 pp 79-85 41 M.S Alam, S.N Begum, R Gupta and S.N Islam (2014) Genetic diversity analysis of rice (Oryza sativa L.) landraces through RAPD markers ISSN: 2224-0616 Int J Agril Res Innov & Tech (1): 77-87, June, 2014 Sharma P N., Mori N., Takumi S., Nakamura C (2014) Conventional and Molecular Studies of Brown Planthopper (Nilaparvata lugens Stal) Resistance Genes in Rice: A Basis for Future Study of Natural Insect Resistance Genes Using Molecular Markers in Nepal Nepal Journal of Science and Technology 15 (1) pp 145-156 Sharma P N., Torii A., Takumi S., Mori N., Nakamura C (2004) Markerassisted pyramiding of brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance genes bph1 and bph2 on rice chromosome 12 Hereditas, 140 (1) pp 61-69 10 Timsina J., Buresh R J., Dobermann A., Dixon J (2011) Rice-maize systems in Asia: current situation and potential IRRI (International Rice Research Institute) 11 Venkateswarlu YADAVALLI, Gajendra P NARWANE, M S R KRISHNA, Nagarajan POTHI, Bharathi MUTHUSAMY (2012) Tagging of Brown Planthopper Resistance Genes in F2s of IR50 × Ptb33 of Rice by Using Bulked Segregant Analysis Rice Science, 2012, 19(1): 70-74 12 Wang Y., Wang X., Yuan H., Chen R., Zhu L., He R., He G (2008) Responses of two contrasting genotypes of rice to brown planthopper Molecular PlantMicrobe Interactions, 21 (1) pp 122-132 13 Yong-Hee Jeon, Sang-Nag Ahn, Hae-Chune Choi, Tae-Ryong Hahn & HuhnPal Moon (1999) Identification of a RAPD marker linked to a brown planthopper resistance gene in rice Euphytica 107: 23–28, 1999 14 Zhang F T., Zhu L L., He G C (2004) Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice Journal of Plant Physiology, 161 pp.53-62 42 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR CỦA CHỈ THỊ RAPD OPS-03 OPS-05 OPS-08 OPS-09 OPS-10 OPO-01 43 OPO-02 OPO-03 OPN-01 OPN-03 OPA-01 OPA-02 44 OPA-04 OPA-05 OPB-02 OPB-03 OPB-05 OPC-01 45 OPC-03 OPC-04 OPD-01 46 PHỤ LỤC 2: MA TRẬN DỮ LIỆU NHỊ PHÂN OPS-03 OPS-05 OPS-08 OPS-09 OPS-10 TN1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Hangangchal 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 47 OPN-01 OPO-02 OPO-03 OPN-01 TN1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 Hangangchal 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 48 OPN-03 OPA-01 OPA-02 OPA-04 TN1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 Hangangchal 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 49 OPA-05 OPB-02 OPB-03 OPB-05 OPC-01 TN1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 Hangangchal 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 50 TN1 1 OPC-03 0 1 1 OPC-04 1 0 OPD-01 1 1 Hangangchal 1 0 1 1 1 0 1 1 Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 51