KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất lẫn tinh thần, kinh nghiệm kiến thức chuyên môn thầy cô, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Đoàn Long ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình bảo giúp tơi thực đề tài khóa luận, tơi xin cảm ơn ThS Đỗ Thị Lệ Hằng hướng dẫn giúp đỡ kỹ thực hành thí nghiệm Các thầy, khơng trang bị cho tơi kiến thức, mà cịn truyền cho tơi niềm đam mê, lịng nhiệt huyết với nghề ln sẵn sàng giúp đỡ tơi gặp khó khăn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Y dược học sở hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn cán Viện dược liệu (Bộ Y Tế) không quản ngại khó khăn thu thập cung cấp mẫu vật giúp đỡ thực đề tài cách thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, tồn thể thầy giáo Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập nhà trường Chúng tơi trân trọng cảm ơn tài trợ kinh phí Bộ Khoa học Công nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 PGS.TS Đinh Đồn Long chủ trì để thực nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Tác giả DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GBSSI Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch Synthase) H.nepalensis Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) H.helix Hedera helix L CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide Mini CTAB Sanghai-Maroof cộng sự, 1984 CTAB cải tiến Elias cộng sự, 2004 Kit Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) DNA Axit deoxyribo Nucleic (Deoxyribonucleic acid) dNTP Deoxyribonucleotit 5’ triphosphate ITS Vùng chép nội (Internal transcribed spacer) Genbank Ngân hàng liệu gen quốc tế bp Cặp bazơ (base pair) OD Mật độ quang học (Optical Density) NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng nghiên cứu Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số mẫu nghiên cứu Bảng 3.2 Chỉ số OD260/280 mẫu nghiên cứu Bảng 3.3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu sử dụng nghiên cứu Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền số lượng nucleotit sai khác trình tự GBSSI mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis H.helix DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae .8 Hình 1.2 Hình ảnh cho mẫu Dây Thường Xuân Hình 1.3 Phân bố địa lý Dây Thường Xuân phía Bắc Việt Nam Hình 1.4 Cấu trúc hóa học hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside pulsatilla saponin A 10 Hình 1.7 Giải trình tự theo phương pháp Sanger 15 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA theo kit 22 Hình 2.3 Nguyên lí hoạt động màng silica .22 Hình 2.4 Kết giải trình tự đoạn gen phần mềm Bioedit .24 Hình 3.1 Kết DNA tổng điện di gel agarose 1,2% 25 Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI 28 Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI 28 Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI .28 Hình 3.5 Kết PCR nhân dòng gen GBSSI gel agarose 1,5% 30 Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI H.nepalensis với lồi có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera .32 Hình 3.7 Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood 35 Hình 3.8 Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Parsimony .35 MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đa dạng di truyền 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại học sinh vật 1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học Việt Nam 1.1.4 Mã vạch DNA 1.1.5 Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt 1.2 Tổng quan loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung lồi Dây Thường Xuân 1.2.2 Đặc điểm phân bố địa lý 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng dược lý 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 1.3.2 Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích PCR 1.3.3 Giải trình tự gen 1.3.4 Phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.3 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 19 2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích kỹ thuật PCR 23 2.4.3 Tinh giải trình tự 24 2.4.4 Xây dựng phát sinh chủng loại phân tích đa dạng di truyền nguồn gen 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Tách chiết DNA tổng số 25 3.2 Kết tối ưu hóa quy trình nhân dịng đoạn gen GBSSI kỹ thuật PCR27 3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 27 3.2.2 So sánh khả nhân dòng đoạn gen GBSSI quy trình .29 3.3 Độ tương đồng trình tự gen GBSSI khuếch đại 31 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị GBSSI 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng nhiệt đới với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, địa hình núi chiếm phần lớn giúp hình thành thảm thực vật đa dạng phong phú Từ xa xưa, y học cổ truyền Việt Nam biết sử dụng nguồn dược liệu công cụ để chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe nâng cao chất lượng sống Do vậy, nguồn dược liệu quý tài sản vô giá dùng để sản xuất thành sản phẩm thuốc, dược liệu có giá trị kinh tế cao [7] Chi Hedera hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), ghi nhận tổng cộng có 16 lồi với đặc điểm hình thái chung dạng dây leo Lồi Dây Thường Xn có tên khoa học Hedera nepalensis K.Koch báo cáo xuất số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất có tác dụng chống ung thư hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside pulsatilla saponin A [36] Ngoài ra, H.nepalensis nghiên cứu tác dụng dược lý, cụ thể có khả chống lại số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn, ung thư, [27, 50] Với tiềm vậy, song đến nghiên cứu H.nepalensis tương đối Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân Việt Nam tiến hành, nhu cầu phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu giới Việt Nam nói chung ngày tăng cao Cơng tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen trồng bước nghiên cứu quan trọng định tới thành công chọn tạo giống Những hiểu biết đầy đủ đa dạng di truyền cấu trúc quần thể nguồn gen Dây Thường Xuân thực cần thiết công tác bảo tồn phát triển nguồn dược liệu quý Sự nghèo nàn mô tả đánh giá nguồn gen cản trở cơng tác chọn tạo giống Hiện nay, tiến di truyền phân tử hỗ trợ đắc lực cho cơng tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phương pháp phân tích sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền như: giải trình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites phân tích đa hình hệ gen ty thể, hệ gen nhân,…[12] Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI) thị DNA sử dụng thành công để xây dựng phát sinh chủng loại họ Araliaceae châu Á [39] Nhưng thị GBSSI có phải thị tốt để đánh giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam câu hỏi chưa có lời giải Để có thêm thơng tin di truyền loài này, bước quan trọng tách chiết DNA tổng số từ tế bào cách hiệu Có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật cơng bố chưa có nghiên cứu đánh giá phương pháp hiệu mẫu khơ Dây Thường Xn Vì vậy, vấn đề đặt cần nghiên cứu quy trình tách chiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứng PCR, cung cấp thông tin trạng di truyền lồi góp phần vào chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, thực đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) Việt Nam dựa thị GBSSI” với mục tiêu sau: Xác định quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu từ mẫu khơ lồi Dây Thường Xn Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước đầu xác định tính đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân thu nhập tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn dược liệu Hình 3.6 Khoảng cách di truyền số lượng nucleotit sai khác trình tự GBSSI mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis H.helix thể Bảng 3.5 Kết phân tích cho thấy mẫu nghiên cứu tương đồng 99.7%, sai khác 8/618 nucleotit.Phân làm nhóm, nhóm I gồm H1, H2, H4, H5, H6 100% giống nhau; nhóm II gồm H3 HH với nucletit khác biệt với nhóm I vị trí 13, 421 603 nhóm III gồm H16, H21 với vị trí nucleotit khác với nhóm I vị trí 243 263 and Pharmacy, Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI H.nepalensis với lồi có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía bên trái) số lượng nucleotit sai khác (phía bên phải) trình tự GBSSI mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis H.helix [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] - 1 268 268 [2] H3,HH 0.017 - 3 267 267 [3] H16 0.000 0.017 - 268 268 [4] H21 0.000 0.017 0.000 - 268 268 [5] H.nepalensis.AY204084.1 0.006 0.013 0.006 0.006 - 268 268 [6] H.helix.HQ234541.1 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 - [7] H.sinensis.HQ234572.1 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 1.91 - [1] H1, H2, H4, H5, H6 mẫu thu thập Việt Nam có trình tự tương đồng với so với H.nepalensis (AY204084.1) sai khác thấp 2/565 nucleotit với mẫu H1, H2, H4, H5, H6 đến 5/565 nucleotit với mẫu H3, HH Trình tự H.helix H.sinensis có khác biệt lớn với mẫu nghiên cứu (khác 268/618 với mẫu H1) H.nepalensis (268/565 nucleotit) Kết hợp với kết khoảng cách di truyền Bảng 3.5 nhận thấy: khoảng cách di truyền mẫu H.nepalensis Việt Nam cho gen GBSSI không cao Sự khác biệt di truyền lớn nằm mẫu H.helix H.sinensis với giá trị khoảng cách di truyền 1,91 Hầu khơng có khác biệt di truyền mẫu H1, H2, H4, H5, H6, H16, H21, H.nepalensis Chín mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH nhân dịng giải trình tự gen GBSSI thành cơng Phân tích gen cho thấy có nucleotit sai khác mẫu đoạn gen dài 618 bp 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị GBSSI Trước tiến hành xây dựng phát sinh chủng loại, mơ hình tiến hóa đặc trưng cho GBSSI tính tốn phần mềm Mega X Mơ hình tối ưu xác định mơ hình tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma thích hợp (BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1.45), phân tích boostrap với 1000 lần lấy lại mẫu Mức độ tin cậy đánh giá theo giá trị bootstrap sau: mức độ tin cậy cao: >85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: C), vị trí 369 (A=>T) vị trí 368 (A=>C); lồi H21 khác vị trí vị trí nucleotit số 263 (T=>C), vị trí 368 (A=>T) vị trí 269 (A=>C) Đặc biệt lồi H3 có vị trí khác biệt nucleotit thứ 13, 368, 369, 420, 603 Như vậy, vị trí vị trí đặc trưng riêng cho lồi H.nepalensis Việt Nam vị trí có liên quan đến việc hình thành thứ lồi Việt Nam Nghiên cứu chúng tơi góp phần bổ sung số liệu phân loại số loài thuộc chi Hedera Cụ thể, phân loại loài H.nepalensis số tỉnh vùng núi phía Bắc, Việt Nam với loài H.algeriensis, H.maroccana, H.caucasigena, H.cypria, H.maderansis, H.pastuchovii, H.azorica, H.canariensis, H.Hibernica Từ đó, bước đầu kết luận rằng, GBSSI thị hữu ích giúp phân loại loài H.nepalensis với loài khác chi Hedera Loài Dây thường xuân với tên khoa học Hedera nepalensis K Koch mô tả đặt tên theo hệ thống phân loại lần tác giả K Koch vào năm 1853 Năm 1929, tác giả Wien gộp loài khác Hedera sinensis vào loài H.nepalensis, cho loài Hedera nepalensis K Koch tên đồng danh Hedera sinensis Tuy nhiên đến năm 2002, Jun Wen nghiên cứu đặc điểm hình thái di truyền chi Hedera giới cho lồi Hedera nepalensis có thứ H.nepalensis var.sinensis H.nepalensis var.nepalensis Theo hình thái, thứ H.nepalensis var.nepalensis thứ var.sinensis phân biệt dựa hai đặc điểm bao gồm số lượng thùy (5 var.nepalensis var.sinensis) số lượng thùy bên (nhiều var.nepalensis khơng có var.sinensis) Tuy nhiên, số mẫu H nepalensis var.sinensis cho thấy thay đổi số lượng thùy (từ đến 5) Sự trùng lặp xảy H.nepalensis var.nepalensis var.sinensis đặc điểm sử dụng để phân biệt chúng không quán [14] Để giải khó khăn phân loại hình thái, phân tích dựa thị di truyền cơng cụ hữu ích có độ xác cao Trong phân tích đa dạng di truyền, hai thứ lồi phân biệt khác biệt mức độ đa dạng Và theo phát sinh chủng loại xây dựng thị GBSSI, nhận thấy H.nepalensis H.sinensis tách làm nhánh với mức độ tin cậy cao nhánh H.nepalensis (99%) Qua đó, kết luận sơ thị phân tử GBSSI có khả giải khó khăn phân loại hình thái lồi Để cung cấp thêm thông tin đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân, thị phân tử khác thị ITS (gen nhân) hay matK (gen lục lạp),…cũng cần khảo sát Cho đến nay, có nhiều kỹ thuật sử dụng để phát triển thị DNA khác phục vụ cho nghiên cứu chọn lọc thực vật Mỗi kỹ thuật có ưu nhược điểm Đối với nghiên cứu đa dạng di truyền, thị cần có số đặc điểm như: phải thị đơn giản nhanh mặt kỹ thuật, giá thành rẻ, cần lượng mẫu DNA ít, cho nhiều thơng tin, lặp lại nghiên cứu, mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ xác, có nhiều allen (hàm lượng thông tin cao), không cần biết trước thông tin genome thể [12] Dữ liệu trình tự từ GBSSI sử dụng để suy luận phát sinh chủng loại cho họ Nhân sâm (Araliaceae) Vùng khuếch đại bao gồm exon 10 11 với intron Mức độ biến đổi loài thấp (-2%) so với mức độ chi (4-5%) họ Araliaceae châu Á Phân tích phát sinh loài với gen GBSSI phần lớn phù hợp với phân tích trước dựa thị ITS (DNA ribosom) liệu ndhF (DNA lục lạp) [23] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: DNA phân lập GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) có hiệu cao so với phương pháp Mini-CTAB (Sanghai-Maroof cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias cộng sự, 2004) DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) Gen GBSSI nhân dòng thành công phát sinh chủng loại xây dựng dựa thị bước đầu cho thấy mẫu Dây tường xuân thu thập số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam thuộc lồi H.nepalensis Kiến nghị Hướng đến chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu Việt Nam, giúp đưa nguồn dược liệu chất lượng tốt tạo thành thành phẩm thuốc phục vụ cộng đồng phòng điều trị bệnh hiệu quả, tơi có số kiến nghị sau: - Mở rộng nghiên cứu phân tích đa dạng nguồn gen dựa số thị khác thị DNA lục lạp, thị DNA ribosom để cung cấp thêm thông tin quan hệ di truyền tiến hóa nguồn gen - Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học để tìm hoạt chất có hoạt tính dược lý kết hợp với nghiên cứu đa dạng nguồn gen để lựa chọn giống có chất lượng tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 11 12 Nguyễn Tiến Bân(2003),Danh lục loài thực vật Việt Nam tập 2,NXB Nông nghiệp,Hà Nội, Đỗ Huy Bích(2007),Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam,660-661 Võ Văn Chi(1999),Cây cỏ có ích Việt Nam,Nhà xuất Giáo Dục,711 Nguyễn Anh Diệp, Ninh Trần, Nguyễn Xuân Quỳnh(2007),Nguyên tắc phân loại sinh vật,NXB Khoa học Kĩ thuật, Hoàng Đăng Hiếu(2012),"Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh",12-14 Nguyễn Hiếu(2017),"Đa dạng sinh học Việt Nam, thực trạng thách thức",4-17 Lê Thị Thanh Hương(2016),"Nghiên cứu tri thức kinh nghiệm sử dụng thuốc dân tộc thiểu số tỉnh thái nguyên để bảo tồn phát triển bền vững",VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology,32(1),55-64 Phạm Thanh Huyền,Đoàn Đinh Long(2017),"Sử dụng thị ADN (RAPDPCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam",Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,33(1),32-39 Võ Thị Thương Lan(2007),Một số vấn đề sinh học phân tử,NXB Đại học Quốc gia Hà Nội,86-88 Đinh Đoàn Long,Đỗ Lê Thăng(2009),Cơ sở di truyền học phân tử tế bào,NXB Đại học Quốc gia Hà Nội,Hà Nội,325-355 Trần Đức Lương,Đặng Thanh Ngọc(2018),"Thực trạng xu hướng phát triển phân loại học sinh vật",KH&CN nước ngoài,2(62-64 NguyễnĐức Thành(2014),"Các kĩ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật",Tạp chí sinh học,36( 265-294 Tiếng Anh 13 14 15 Abdel-Dayem, Rasool M S, Elgharbawy I, Nagel A A , Aldhafer P(2018),"Faunistic inventory and zoogeographical analysis of the ground beetles (Coleoptera, Carabidae) of Garf Raydah Nature Reserve, Southwestern of Saudi Arabia, and description of a new species of Paussinae",Zootaxa,4514(3),341-371 Ackerfield J,Wen J(2002),"A morphometric analysis of Hedera L.(the ivy genus, Araliaceae) and its taxonomic implications",Adansonia,24(2),197212 Adamowicz SJ, Chain FJ, L Clare E., DeinerK., al et(2016),"From Barcodes to Biomes: Special Issues from the 6th International Barcode of Life Conference",Genome,59(11),5-9 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Barisik Murat(2014)," Size Dependent Surface Charge Properties of Silica Nanoparticles",J Phys Chem C,118(4),1836–1842 Carlos,Herrera M(1987),"Vertebrate‐dispersed plants of the Iberian Peninsula: a study of fruit characteristics",Ecological monographs,57(4),305-331 Cota-Sánchez, Remarchuk K, Ubayasena K(2006),"Ready-to-use DNA extracted with a CTAB method adapted for herbarium specimens and mucilaginous plant tissue Plant Molecular Biology Reporter",24(161-167 Cowan RS, Chase M W, Kress WJ, Savolainen(2006),"300,000 Species to Identify: Problems, Progress, and Prospects in DNA Barcoding of Land Plants",Taxon,55(3),611 Elizabeth,Czarapata J(2005),"Invasive plants of the upper Midwest: an illustrated guide to their identification and control,"Univ of Wisconsin Press,43 - 45 Feike, Richard G V, Anne S P, Evert, J Will(1991),"Sequence of the structural gene for granule-bound starch synthase of potato (Solarium tuberosum L.) and evidence for a single point deletion in the amf allele",Molecular and General Genetics MGG,228(2-2),240-248 Ghias Uddin Ashfaq Ahmad Khan, Muhammad Alamzeb, Saqib Ali, Mamoon-Ur-Rashid Anwar Sadat, Muhammad Alam, Abdul Rauf, Wali Ullah (2012),"Biological screening of ethyl acetate extract of Hedera nepalensis stem",African Journal of Pharmacy and Pharmacology,6(42),2934-2937 Green A F, Ramsey Tara S, Justin Ramsey(2011),"Phylogeny and biogeography of ivies (Hedera spp., Araliaceae), a polyploid complex of woody vines",Systematic Botany,36(4),1114-1127 Guetat A,Mirza B(2009),"A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from Allium roseum L (Alliaceae)",8(17),40204024 Hammad I, Ammara R, Haq Ihsan-ul, Jafri Laila, Ullah Nazif, Dilshad Erum, et al.(2017),"Five Indigenous Plants of Pakistan with Antinociceptive, AntiInflammatory, Antidepressant, and Anticoagulant Properties in Sprague Dawley Rats",Evid Based Complement Alternat Med ,2017(1-10 Hashmi W, Ismail H, Mehmood F, Bushra Mirza(2018),"Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ+ AlCl induced rats model",DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,26(2),179-190 Hashmi Waleed Javed, Ismail Hammad, Mehmood Furrukh, Mirza Bushra(2018),"Neuroprotective, antidiabetic and antioxidant effect of Hedera nepalensis and lupeol against STZ+ AlCl induced rats model",DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,26(2),179-190 Hebert P D, ACywinska, Ball S L, deWaard J R(2003),"Biological identifications through DNA barcodes",Proc Biol Sci,270(1512),313-321 Jafri L, Saleem S, Kondrytuk T P, Haq I U, Ullah N, Pezzuto J M, et al.(2016),"Hedera nepalensis K Koch: A Novel Source of Natural Cancer 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Chemopreventive and Anticancerous Compounds",Phytother Res,30(3),447453 Jafri Laila,Saleem Samreen(2017),"In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch",Arabian Journal of Chemistry,10(2),3699-3706 Jia Min Xiang,A Hickey Donal(2007),"Assessing the effect of varying sequence length on DNA barcoding of fungi",Molecular Ecology Notes,7(3),365-373 Jian G, Liangb Dong, Wanga Yunfei, Luc Charles, Wua Xifeng(2004),"Effects of N-acetyl transferase and polymorphisms on bladder cancer risk in Caucasians",Genetic Toxicology and Evironmental Mutagenesis, 97-104 Kress W J,Erickson L D(2007),"A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region",PLoS one,2(6),508 Kress W J, Kenneth J Wurdack, Elizabeth A Zimmer, Weigt A L, Janzen H(2005),"Use of DNA barcodes to identify flowering plants",Proceedings of the National Academy of Sciences,102(23),8369-8374 Laila J, Samreen S, Ihsan-ul-Haq, Ullah Nazif, Mirza Bushra(2017),"In vitro assessment of antioxidant potential and determination of polyphenolic compounds of Hedera nepalensis K Koch",Arabian Journal of Chemistry,10(2),3699-3706 Li T, Pan H, Feng Y, Li H, Zhao Y(2015),"Bioactivity-guided isolation of anticancer constituents from Hedera nepalensis K Koch",South African Journal of Botany,100(87-93 Liu Lingling, Guo Zilong, Huang Zhenzhen, Zhuang Jiaqi, Yang Wensheng(2016),"Size-selective separation of DNA fragments by using lysine-functionalized silica particles",Scientific Reports,6(22029 Merlo D J,Kemp J D(1976),"Effect of polysaccharides on kinetics of DNA",Plant Physiol,58(1522-1526 Mitchell A,Wen J(2004),"Phylogenetic Utility and Evidence for Multiple Copies of Granule-Bound Starch Synthase I (GBSSI) in Araliaceae",Taxon,53( 29-41 Murray M G,William W F Thompson(1980),"Rapid isolation of high molecular weight plant DNA",Nucleic acids research,8(19),4321-4326 Nida M B A, Shumaila B, Sadiq A(2012),"Biological screening of Hedera nepalensis",Medicinal Plants Research,6(39),5250-5257 Paul D, Prenzler S L, Hassan K O(2012),"Bioprospecting traditional Pakistani medicinal plants for potent antioxidants",Food Chemistry,132(222229 Ralf,Dahm(2008),"Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research",Human genetics,122(6),565-581 S Saleem, L Jafri, I ul Haq, al et(2014),"Plants Fagonia cretica L and Hedera nepalensis K Koch contain natural compounds with potent 45 46 47 48 49 50 51 52 dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitory activity",J Ethnopharmacol,156(26-32 Sang T(2002),"Utility of low-copy nuclear gene sequences in plant phylogenetics",Crit Rev Biochem Mol Biol,37(3),121-47 Scott O R,Bendich A J(1985),"Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues",Plant molecular biology,5(2),69-76 Steven G N,Subramanyam R(2009),"Testing plant barcoding in a sister species complex of pantropical Acacia (Mimosoideae, Fabaceae)",Molecular ecology resources,9(172-180 Treu R, Holmes D S, Smithn B M(2001),"Allium ampeloprasum var babingtonii (Alliaceae): an isoclonal plant found across a range of habitats in SW England",Plant ecology,155(2),229-235 Waters D L,Shapter F M(2014),"The polymerase chain reaction (PCR): general methods",Methods Mol Biol,1099(65-75 Jian Gua Dong Liangb , Yunfei Wanga, Charles Luc, Xifeng Wua(2004),"Effects of N-acetyl transferase and polymorphisms on bladder cancer risk in Caucasians",Genetic Toxicology and Evironmental Mutagenesis, 97-104 Bashir Amad Nida Munir, Shumaila Bashir, Sadiq Azam, Ibrar Khan, Mohammad Ayub(2012),"Biological screening of Hedera nepalensis",Medicinal Plants Research,6(39),5250-5257 Hill D M, Bull J J (1993) “An empirica test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phy ogentic ana ysis”Systematic Biology, 42 (2), 182-192 WEB 53 http://www.botanicayjardines.com/hedera-nepalensis/ 01/05/2019 Ngày truy cập ... khai thác bền vững nguồn dược liệu Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, thực đề tài: ? ?Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera... nguyên liệu di truyền lồi hệ sinh thái vơ phức tạp tồn môi trường Do vậy, đa dạng sinh học bao gồm cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài đa dạng hệ sinh thái Đa dạng di truyền đa dạng cấp độ phân tử,... NGHIÊN CỨU 3.1 Tách chiết DNA tổng số Kết điện di DNA tổng số từ 10 mẫu nghiên cứu (Hình 3.1) cho thấy tất mẫu thu hồi DNA tổng số thành cơng với quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu hình