Phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống hoàng tinh hoa trắng (disporopsis longifolia craib) bằng chỉ thị rapd

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU GIỐNG HOÀNG TINH HOA TRẮNG (DISPOROPSIS LONGIFOLIA CRAIB) BẰNG CHỈ THỊ RAPD Họ tên sinh viên : Nguyễn Thị Hoa Mỹ Mã sinh viên : 620602 Lớp : K62CNSHC Khoa : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Trường Sơn HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp đại học: “Phân tích đa dạng di truyền số mẫu giống hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) thị RAPD” hoàn thành hướng dẫn TS Đinh Trường Sơn khơng trùng với khóa luận khác Các số liệu, kết nêu luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan, theo nhận thức vấn đề riêng tác giả Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Trong q trình nghiên cứu thực khóa luận, tơi kế thừa thành tựu nhà khoa học với trân trọng biết ơn Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa Mỹ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Trường Sơn tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài, suốt thời gian hồn chỉnh khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Công nghệ sinh học Thực vật tạo điều kiện tốt giúp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn q thầy giáo, gia đình, bạn bè ln khích lệ tinh thần giúp đỡ tơi để tơi có điều kiện tốt suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Do thời gian kiến thức có hạn nên khóa luận khơng tránh khỏi hạn chế thiếu sót định Tơi xin cảm ơn tiếp thu ý kiến, đóng góp thầy giáo, cô giáo bạn sinh viên Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa Mỹ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Mục đích nghiên cứu 1.1.2 Yêu cầu đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Hoàng tinh hoa trắng 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố 2.1.3 Thành phần hóa học 2.1.4 Công dụng 2.2 Tình hình nghiên cứu giống Hồng tinh hoa trắng 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giống Hoàng tinh hoa trắng nước 2.2.2 Tình hình nghiên cứu giống trắng Hoàng tinh hoa giới 2.3 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị RAPD phân tích đa dạng di truyền 2.3.1 Khái niệm thị phân tử 2.3.2 Chỉ thị phân tử RADP PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Đối tượng nghiên cứu 11 3.2 Hóa chất 12 iii 3.3.1 Dụng cụ 12 3.3.2 Hóa chất 13 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Nội dung nghiêng cứu 15 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 15 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Tách chiết DNA tổng số 19 4.2 Kết phân tích đa dạng di truyền với thị RAPD 21 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 5.1 Kết luận 28 5.2 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTPs : Deoxynucleotide Solution Mix EDTA : Etylen Diamine Tetra Acetic acid ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats RAPD : Random Amplified Phlymorphic DNA PCR : Polymerase chain reactin TAE : Tris base, acetic acid and EDTA PVPP : Poly Vinyl Poly Pyrrolidone v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib.) thu thập số địa phương 11 Bảng 3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 3.3 Trình tự nucleotide mồi cho phản ứng RADP- PCR 14 Bảng 3.4 Thành phân cho phản ứng PCR 16 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 17 Bảng 4.1: Kết đo OD 20 Bảng 4.2 Khả nhân 17 mồi RAPD 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng 21 Bảng 4.3: Giá trị PIC Rp mồi RAPD nghiên cứu 22 Bảng 4.4: Bảng hệ số tương đồng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng thi RAPD 24 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Hình ảnh mơ tả phân Hoàng tinh hoa trắng Hình 4.1 Hình ảnh điện di kết DNA tổng số 19 Hình 4.2 Mồi OPB-03 23 Hình 4.3 Sơ đồ quan hệ di truyền 21 mẫu Hoàng tinh hoa trắng phân tích thị RAPD 26 Hình 4.4 Phân tích thành phần (PCA) mối liên hệ di truyền 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng 27 vii TÓM TẮT Phân tích đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hồng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) thị phân tử RAPD Tách chiết DNA tổng số mẫu có độ tinh DNA cao nồng độ DNA cao Sau khảo sát 35 mồi RAPD, 17 mồi RAPD chọn có sản phẩm PCR rõ ràng Kết phát 2310 băng, tỷ lệ băng đa hình mồi thay đổi từ 40% - 100% Chỉ số đa hình PIC 17 mồi RAPD dao động từ 0,11 - 0,33 Chỉ số trung bình Rp 17 mồi RAPD 13,92 (dao động từ 7,9 – 25,71) Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu 21 giống Hoàng tinh hoa trắng dao động từ 0,623 đến 0,895 Ở hệ số tương đồng di truyền 0,759 giống Hoàng tinh hoa trắng chia thành nhóm sơ đồ quan hệ di truyền viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nhu cầu sử dụng loại dược liệu làm thuốc ngày tăng Tuy nhiên, khai thác liên tục không ý tới bảo vệ tái sinh làm cho nguồn dược liệu ngày q có lồi Hồng tinh hoa trắng Hồng tinh nói chung Hồng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) nói riêng loại dược liệu quý biết đến vị thuốc với nhiều tác dung bổ âm ích khí, nhuận phế kiện tỳ, cường kiện gân cốt nên đông y sử dụng nhiều thuốc chữa ho máu, tiểu đường, ăn uống không ngon…Củ Hồng tinh vị thuốc ghi Danh y biệt lục với nhiều công tác dụng chữa bệnh hay hữu ích Hồng tinh có phân bố tự nhiên Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Hịa Bình… chủ yếu tỉnh miền núi bắc nước ta Vì loại dược liệu có tác dụng lớn thêm vào việc khai thác trộm lâm sản nước ta diễn nhiều dẫn tới việc lượng lớn hoàng tinh bị khai thác Hiện số lượng Hồng tinh hoa trắng cịn lại tình trạng cạn kiệt đưa vào sách đỏ Việt Nam với mục đích bảo tồn cao Hiện khu bảo tồn thiên nhiên Tát Kẻ - Bản Bung (Nà Hang - Tuyên Quang) Vườn Quốc gia Ba Bể gặp lớn Nạn phá rừng làm nương rẫy trực tiếp làm thu hẹp vùng phân bố (Văn Bàn Mường Khương - Lào Cai; Tràng Định - Lạng Sơn) Loài ghi Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý (nhóm 2) Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng mục đích thương mại Bảo vệ quần thể có Vườn quốc gia (Ba Vì, Tam Đảo, Ba Bể, Cúc Phương) PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA công việc cần thiết cho q trình nghiên cứu cơng nghệ gen Tách chiết DNA cần đảm bảo độ tinh nguyên vẹn để thực bước q trình nghiên cứu cơng nghệ gen Ngày nhờ tiến cơng nghệ đổi có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số thực vật trở nên đơn giản Tuy nhiên đối tượng định có phương pháp tách chiết riêng Do việc lựa chọn tiến hành phương pháp cho phù hợp với đối tượng điều cần thiết DNA 21 giống Hoàng tinh hoa trắng tách chiết theo quy trình Farhad Masoomi – Aladizgeh, Leila Jabbari, Reza Khayam Nekouei & Ali Aalami, Protocol Exchange (2016), có cải tiến Đinh Trường Sơn Kết tách chiết DNA tổng số 21 mẫu Hoàng tinh hoa trắng kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1% Hình 4.1 Hình ảnh điện di kết DNA tổng số 19 Kết cho thấy băng vạch DNA mẫu Hồng tinh hoa trắng thu khơng bị đứt gãy nhiều, băng vạch có kích thước lớn 1kb Vậy nên DNA tách chiết chấp nhận để tiến hành phản ứng PCR Tiếp tục kiểm tra chất lượng DNA qua việc đo OD 21 mẫu DNA tổng số Kết thể Bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết đo OD Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Nồng độ(ng/µl) 242 341 234 223 110 74 144 229 227 49 227 191 250 134 138 134 85 76 127 754 253 OD 260/280 1,81 1,69 1,57 1,66 1,78 1,76 1,74 1,80 1,71 1,69 1,65 1,80 1,77 1,65 1,89 1,95 1,94 1,88 1,93 1,74 1,9 OD 260/230 1,70 1,21 1,08 1,00 1,26 1,31 1,28 1,23 1,04 0,95 1,25 1,25 1,56 1,12 1,32 1,77 1,81 1,65 2,12 1,98 1,82 Từ số liệu bảng cho ta thấy độ tinh nồng độ mẫu độ DNA cao DNA tổng số sau pha lỗng nồng độ 5ng/μl để thực phản ứng PCR 20 4.2 Kết phân tích đa dạng di truyền với thị RAPD DNA tổng số 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng sử dụng làm mạch khuôn cho 35 mồi RAPD ngẫu nhiên để đánh giá đa dạng di truyền Kết điện di cho thấy có 17 mồi có băng vạch đa hình rõ ràng, nhân với tổng số 2310 băng vạch, trung bình 135,88 băng/mồi (dao động từ 83 băng 270 băng) 110 băng/mẫu giống Trong giống, số lượng băng đa hình trung bình mồi dao động từ 3,95 đến 12,86 (băng/mẫu) Chỉ thị OPB03 nhân số băng DNA lớn (270 băng), thị OPB-05 nhân số băng lớn (267 băng) Chỉ thị OPA-02 mồi nhân số băng (83 băng) Bảng 4.2 Khả nhân 17 mồi RAPD 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng STT Tên mồi Trình tự mồi OPA-02 TGCCGAGCTG OPA-04 AATCGGGCTG OPC-02 GTGAGGCGTC OPC-03 GGGGGTCTTT OPC-08 TGGACCGGTG OPC-13 AAGCCTCGTC OPC-15 GACGGATCAG OPD-01 ACCGCGAAGG OPS-08 TTCAGGGTGG 10 OPS-10 ACCGTTCCAG 11 OPB-03 CATCCCCCTG 12 OPB-05 TGCGCCCTTC 13 OPV-03 CTCCCTGCAA 14 OPN-03 GGTACTCCCC 15 API-07 CAGCGACAAG 16 OPG-05 CTGAGACGGA 17 APG-05 CTGAGACGGA Tổng số (RAPD) Trung bình/mồi (RAPD) Giá trị trung bình /mẫu giống (RAPD) Tm Tổng số locus phát Tỷ lệ đa hình locus 8 12 8 12 12 19 16 7 11 162 9,53 7,71 75,00 62,50 66,67 66,67 62,5 66,67 62,5 58,33 40 83,33 73,68 62,5 71,43 57,14 100 62,5 50 1121,42 65,97 53,40 34 32 34 32 34 32 32 34 32 32 34 34 32 34 32 32 32 21 Tổng số băng nhân 83 120 127 115 124 88 119 156 85 173 270 267 99 116 148 129 91 2310 135,88 110,00 Số băng/mẫu giống 3,95 6,00 8,43 5,48 5,9 4,19 5,67 7,43 4,05 8,24 12,86 12,71 4,71 5,52 7,05 6,14 4,33 112,66 6,63 5,36 Số liệu bảng 4.2 cho ta thấy số locus trung bình mồi RAPD phát 9,53 dao động từ đến 19 (locus/mồi), mồi phát số locus cao OPB-03 (19 locus/mồi), mồi phát số locus thấp OPS-08(5 locus/mồi) 17 mồi RAPD nhân tổng số 162 locus trung bình 9,53 (locus/mồi) hay 7,71 (locus/ mẫu giống) Mồi có số locus đa hình cao API-07 (11/11 locus đa hình) chiếm tỷ lệ 100%, mồi có số locus đa hình thấp OPS-08 (2/5 locus đa hình) chiếm tỷ lệ 40% Bảng 4.3: Giá trị PIC Rp mồi RAPD nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự mồi Tm PIC of primer (0-1) Rp=∑Ib OPA-02 TGCCGAGCTG 34 0,28 7,90 OPA-04 AATCGGGCTG 32 0,26 12,00 OPC-02 GTGAGGCGTC 34 0,27 16,86 OPC-03 GGGGGTCTTT 32 0,30 10,95 OPC-08 TGGACCGGTG 34 0,25 11,81 OPC-13 AAGCCTCGTC 32 0,32 8,38 OPC-15 GACGGATCAG 32 0,31 11,33 OPD-01 ACCGCGAAGG 34 0,19 14,86 OPS-08 TTCAGGGTGG 32 0,17 8,1 10 OPS-10 ACCGTTCCAG 32 0,26 16,48 11 OPB-03 CATCCCCCTG 34 0,27 25,71 12 OPB-05 TGCGCCCTTC 34 0,22 25,43 13 OPV-03 CTCCCTGCAA 32 0,25 9,43 14 OPN-03 GGTACTCCCC 34 0,22 11,05 15 API-07 CAGCGACAAG 32 0,33 14,1 16 OPG-05 CTGAGACGGA 32 0,22 12,29 17 APG-05 CTGAGACGGA 32 0,11 8,67 Trung bình/mồi (RAPD) 0,25 13,92 Giá trị trung bình /mẫu giống (RAPD) 0,20 9,94 22 Trong bảng số đa hình PIC 17 mồi RAPD dao động từ 0,11 đến 0,33, mồi có số PIC nhỏ APG-05 (0,11), mồi có số đa hình PIC cao API-07 (0,33) Chỉ số PIC trung bình 17 mồi RAPD 0,25 cho thấy mồi có mức độ đa hình trung bình Có mồi RAPD cho số đa hình mức trung bình bao gồm: mồi OPS-10 (0,26), mồi OPC-08 (0,25), mồi OPV-03 (0,25) Các mồi OPN-01 (0,33), mồi OPC-13 (0,32), mồi OPC-15 (0,31), mồi API-07 (0,33) có hệ số PIC mức Theo Prevost and Wilkinson (1999), số Rp tương quan kiểu gen với thị phân tử DNA, số Rp cao chứng tỏ thị phân tử hữu hiệu việc phân nhóm kiểu gen Từ bảng 4.5 số sai khác mồi Rp nhỏ 7,9 (mồi OPA-02) lớn 25,71 (mồi OPB-03) Chỉ số trung bình Rp 17 mồi RAPD 13,92 Hình 4.2 Mồi OPB-03 23 Bảng 4.4: Bảng hệ số tương đồng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng thi RAPD Mẫu Cay1 Cay1 1.000 cay2 0.821 1.000 cay3 0.833 0.852 1.000 Cay4 0.815 0.735 0.821 1.000 Cay5 0.765 0.747 0.772 0.815 1.000 Cay6 0.778 0.772 0.809 0.778 0.889 1.000 Cay7 0.784 0.827 0.852 0.772 0.858 0.883 1.000 Cay8 0.772 0.728 0.802 0.784 0.735 0.759 0.790 1.000 Cay9 0.790 0.821 0.846 0.753 0.815 0.815 0.883 0.821 1.000 Cay10 0.790 0.747 0.784 0.765 0.765 0.790 0.796 0.747 0.790 1.000 Cay11 0.759 0.741 0.741 0.784 0.809 0.784 0.790 0.716 0.747 0.883 1.000 Cay12 0.710 0.716 0.704 0.735 0.698 0.685 0.704 0.691 0.660 0.673 0.704 1.000 Cay13 0.741 0.759 0.735 0.691 0.741 0.753 0.735 0.660 0.716 0.691 0.710 0.809 1.000 Cay14 0.716 0.722 0.722 0.704 0.716 0.716 0.735 0.735 0.716 0.691 0.698 0.772 0.802 1.000 Cay15 0.636 0.667 0.667 0.636 0.673 0.673 0.691 0.704 0.660 0.710 0.704 0.778 0.735 0.821 1.000 Cay16 0.691 0.710 0.685 0.679 0.654 0.704 0.735 0.673 0.691 0.728 0.685 0.759 0.741 0.753 0.821 1.000 Cay17 0.710 0.679 0.654 0.673 0.673 0.660 0.679 0.654 0.673 0.698 0.691 0.728 0.759 0.784 0.840 0.821 1.000 Cay18 0.648 0.679 0.667 0.636 0.623 0.636 0.667 0.667 0.648 0.698 0.691 0.716 0.735 0.784 0.840 0.796 0.852 1.000 Cay19 0.642 0.660 0.685 0.642 0.679 0.679 0.698 0.722 0.691 0.667 0.685 0.735 0.716 0.802 0.833 0.778 0.796 0.858 1.000 Cay20 0.630 0.623 0.623 0.630 0.642 0.667 0.636 0.698 0.654 0.691 0.685 0.722 0.704 0.765 0.821 0.778 0.821 0.821 0.889 1.000 Cay21 0.685 0.704 0.691 0.710 0.660 0.685 0.679 0.691 0.673 0.685 0.679 0.778 0.772 0.796 0.790 0.784 0.790 0.827 0.858 0.895 cay2 cay3 Cay4 Cay5 Cay6 Cay7 Cay8 Cay9 Cay10 Cay11 24 Cay12 Cay13 Cay14 Cay15 Cay16 Cay17 Cay18 Cay19 Cay20 Cay21 1.000 Sự đa hình mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng thể qua số locus, tỷ lệ đa hình, số băng nhân sau phân tích RAPD cao Điều chứng tỏ đa dạng giống Hoàng tinh hoa trắng dẫn đến khác biệt mặt di truyền Sử dụng hệ số tương đồng Sokal Michener (1958) phương pháp UPGMA phần mềm NTSYS 2.1 để đánh giá mức độ đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng, thu kết thể (Bảng 4.4) Hệ số tương đồng di truyền phản ánh mối quan hệ đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng nghiên cứu Hai mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng gần thơng tin di truyền hệ số tương đồng chúng lớn ngược lại, hai mẫu có hệ số tương đồng di truyền thấp mối quan hệ di truyền chúng lại xa Bảng 4.4 thể hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu Kết cho thấy, hệ số tương đồng 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng biến động từ 0,623 – 0,895 Trong đó, hai mẫu 20 21 có hệ số tương đồng lớn 0,895, hai mẫu 20, 20, 18 có hệ số tương đồng thấp 0,623 Trong 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng hai mẫu có mối quan hệ gần mẫu 20 21, mẫu 2, mẫu 20 có mối quan hệ xa Theo nghiên cứu Ge etha CM EA Siril (2019), sử dụng 20 mồi RAPD đánh giá tính đa dạng di truyền 22 lồi Măng tây racemosus willd có hệ số tương đồng dao động từ 0,118 đến 0,556 Tương tự với kết nghiên cứu M Kumar cộng (2016) A racemosus giống măng tây họ với giống Hồng tinh hoa trắng có hệ số Jaccard từ 0,48 đến 0,97 Kết cho thấy khác rõ rệt hệ số tương đồng mẫu giống có khác Từ hệ số tương đồng, sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, ta vẽ sơ đồ thể mối quan hệ di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng thể hình 4.3 25 Hình 4.3 Sơ đồ quan hệ di truyền 21 mẫu Hoàng tinh hoa trắng phân tích thị RAPD Kết phân tích hệ số tương đồng 0,759, giống Hồng tinh chia làm nhóm Trong nhóm gồm mẫu giống 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11; nhóm thứ gồm mẫu 12, 13, 14 nhóm cịn lại Để nhìn rõ khác biệt đa dạng di truyền cá thể, tiến hành phân tích thành phần (Principal Component Analysis) Đây thuật toán sử dụng phổ biến phân tích đa dạng di truyền thuật tốn làm giảm số chiều liệu nguyên làm bật lên liệu, giúp người đọc nhận biết số liệu cách trực quan Kết biểu thị Hình 4.4 Kết hình 4.4 cho thấy, tương tự kết phân tích thể sơ đồ quan hệ di truyền 21 mẫu Hồng tinh hoa trắng phân tích thị RAPD, phân tích PCR nhóm với số cá thể giống sơ đồ hình 4.3 Điểm rõ ràng phân tích PCA cho thấy mẫu giống hoàng tinh hoa trắng phân tán góc phần tư trục tọa độ khoảng cách hai nhóm xa Kết lần khẳng định đa dạng di truyền mẫu giống hoàng tinh hoa trắng cao 26 Observations (axes F1 and F2: 71.52 %) 0.25 Cay 13 Cay 12 0.2 Cay 0.15 F2 (7.15 %) 0.1 0.05 Cay 14 Cay Cay Cay Cay 16 Cay 17 Cay Cay Cay -0.05 Cay -0.15 -0.2 Cay 15 Cay 18 Cay -0.1 Cay 21 Cay 19 Cay 20 Cay 11 Cay 10 -0.4 -0.2 0.2 0.4 0.6 F1 (64.37 %) Hình 4.4 Phân tích thành phần (PCA) mối liên hệ di truyền 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng 27 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân tích đa dạng di truyền 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng thị phân tử RAPD DNA tổng số tách chiết có độ tinh DNA cao nồng độ DNA cao Từ 35 mồi RAPD khảo sát, chúng tơi lựa chọn 17 mồi có sản phẩm PCR rõ ràng Kết phát 2310 sản phẩm PCR, tỷ lệ băng đa hình mồi dao động từ 40% - 100% Chỉ số đa hình PIC 17 mồi RAPD dao động từ 0,11 - 0,33 Chỉ số trung bình Rp 17 mồi RAPD 13,92 (dao động từ 7,9 – 25,71) Hệ số tương đồng di truyền cặp mẫu 21 giống Hoàng tinh hoa trắng cao, dao động từ 0,623 đến 0,895 Ở hệ số tương đồng di truyền trung bình 0,759 giống Hồng tinh hoa trắng chia thành nhóm sơ đồ quan hệ di truyền 5.2 Kiến nghị Cần kết hợp với phân tích đa dạng di truyền với thị khác thị ISSR, AFLP để tăng tính xác Thêm vào đó, giải trình tự để có thêm thơng tin di truyền mẫu hồng tinh hoa trắng nghiên cứu 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Khoa Học Công Nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, NXB khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội Dương Thị Hoạt (2020), Nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc số hợp chất phân lập từ Hoàng tinh hoa trắng phương pháp hóa lí đại Đặng Ngọc Hùng, Hoàng Thị Phong (2013) Nghiên cứu nhân giống Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia) hom củ huyện Bảo Lâm, tỉnh Cao Bằng Đỗ Tất Lợi (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB y học, Hà Xuân Kỳ (2019) Nghiên cứu đặc điểm sinh vật học kĩ thuật nhân giống loài Hoàng tinh hoa trắng tỉnh Hà Nam Hoàng Thị Sản (2009) Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật Tạp chí sinh học: 36(3): 265- 294 Nguyễn Thị Phương Dung (2002) “ Góp phần nghiên cứu chế biến vị thuốc Hồng tinh” , Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại Học dược Hà Nội Nguyễn Đắc Triển, Nguyễn Tài Luyện, Nguyễn Thị Xuân Viên, Ngô Thế Long (2020) Nghiên cứu nhân giống c Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) hòm củ Phú Thọ Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Trường đại học Hùng Vương, tập 20 số (2020) : 85-94 Tiếng Anh 10 Akopyanz N., Bukanov N O., Westblom T U., Berg D E., 1992 PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori Nucleic Acid Res., 20: 6221-6225 11 Baird E., Cooper-Bland S., Waugh R., DeMaine M., Powell W., 1992 Molecular characterisation of inter and intra-specific somatic hybrids of potato using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers Mol Gen Genet (MGG), 233(3): 469475 12 J., Vos P., Kuiper M., Salamini F.,Heun M., 1995 Combined mapping of AFLP and RFLP markers Becker in barley Mol Gen Genet., 249: 65-73 13 Bostein et al (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms pp 314 - 331 14 Geetha C M and E A Siril (2019): Assessment of genetic diversity of Asparagus racemosus willd from different agro-ecological zones of Kerala using RAPD markers- Genetika, Vol 51, No.2, 479-494 15 Kumar , M., P.K., Naik, Sarala ,V., Chhokar (2016) Genetic variations in Asparagus racemosus, an endangered medicinal herb endemic to India Using RAPD markers Br Biotechnol J., 10(2):1-11 16 Thomas S.C.Li (2006) Taiwanese Native Medicinal Plants, Taylor & Francis 17 Winkel, G.V(2006), Finding plant Nepal, The plant Rev.11:188-191 29 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR CỦA CHỈ THỊ RAPD APG-05 OPA-04 APH-07 OPC-03 30 OPC-08 OPC-15 OPD-01 OPB-05 31 OPG-05 OPN-03 OPS-10 OPV-03 32 OPS-08 OPA-02 OPC-02 OPC-13 33