Trong nghiên cứu này, bốn phương pháp tách chiết DNA khác nhau từ mẫu lá khô Dây thường xuân đã được sử dụng để tìm ra phương pháp hiệu quả nhất. Các phương pháp tách chiết khác nhau cho DNA tổng số có nồng độ dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μl, độ tinh sạch đánh giá thông qua chỉ số hấp thụ quang đo ở bước sóng 260 và 280 nm dao động từ 1,8 đến 2,2.
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 Original Article Comparative Analysis of Different DNA Extraction Methods and Preliminary Analysis of Genetic Diversity of Hedera nepalensis K Koch in Vietnam Based on GBSSI Marker Dinh Doan Long1,*, Nguyen Xuan Bach1, Nguyen Thi Thu Thao1, Pham Thi Hong Nhung1, Do Thi Le Hang1, Vu Thi Thom1, Pham Thanh Huyen2 VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam National Institute of Medicinal Materials, 3B Quang Trung, Hoan Kiem, Hanoi, Vietnam Received 03 May 2019 Revised 09 May 2019; Accepted 21 June 2019 Abstract: Though the ivy (Hedera nepalensis K Koch.) has long been utilized in traditional medicine, its genome information is very limited For plants, an effective method of DNA extraction is a very important step which greatly affects subsequent genetic analyses In this study, four different methods of DNA extraction from dry leaves were used A comparison of different protocols resulted in the yield of extracted DNA that ranged from 10.5 to 437.4 ng/μl and with a purity ranged from 1.8 to 2.2 Based on the PCR results of GBSSI gene, Gene JET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit is the most optimal extraction method for Vietnam ivy’s dry leaves A preliminary analysis of the phylogenetic tree based on the GBSSI marker showed that ivy growing in a number of northern mountainous provinces of Vietnam belonged to the H nepalensis K Koch species The high - quality total DNA will allow us to amplify different DNA markers, providing valuable genetic information to preserve and develop medicinal resources in Vietnam Keywords: GBSSI, Hedera nepalensis K Koch, DNA extraction _ Corresponding author Email address: longdd.ksh@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4165 88 VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 Đánh giá hiệu tách chiết DNA tổng số từ số quy trình phân tích khác bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K Koch.) dựa vào thị GBSSI Đinh Đoàn Long1,*, Nguyễn Xuân Bách1, Nguyễn Thị Thu Thảo1, Phạm Thị Hồng Nhung1, Đỗ Thị Lệ Hằng1, Vũ Thị Thơm1, Phạm Thanh Huyền2, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Viện Dược liệu, 3B Quang Trung, Hoàn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 03 tháng năm 2019 Chỉnh sửa ngày 09 tháng năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 21 tháng năm 2019 Tóm tắt: Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch.) thuốc từ lâu sử dụng y học cổ truyền thơng tin hệ gen chúng hạn chế Ở thực vật, lựa chọn phương pháp tách chiết DNA hiệu bước quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến phân tích di truyền Trong nghiên cứu này, bốn phương pháp tách chiết DNA khác từ mẫu khô Dây thường xuân sử dụng để tìm phương pháp hiệu Các phương pháp tách chiết khác cho DNA tổng số có nồng độ dao động từ 10,5 đến 437,4 ng/μl; độ tinh đánh giá thông qua số hấp thụ quang đo bước sóng 260 280 nm dao động từ 1,8 đến 2,2 Dựa kết khuếch đại gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI kỹ thuật PCR, GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit đánh giá có hiệu thu hồi DNA tổng số có chất lượng tốt với mẫu khô Dây thường xuân Bước đầu phân tích thị GBSSI, phát sinh chủng loại xây dựng từ mẫu Dây thường xuân cho thấy mẫu thuộc loài H nepalensis K Koch Nghiên cứu cho thấy nguồn DNA tổng số chất lượng cao cho phép nhân dòng thị DNA khác với hiệu cao, qua cung cấp thơng tin di truyền có giá trị cho phân loại, bảo tồn phát triển nguồn dược liệu Việt Nam Từ khóa: GBSSI, Dây thường xuân, Hedera nepalensis, tách chiết DNA tổng số. _ Tác giả liên hệ Địa email: longdd.ksh@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4165 89 90 D.D Long et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 Đặt vấn đề Chi Hedera hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), ghi nhận tổng cộng có 15 lồi với đặc điểm hình thái chung dạng dây leo [1] Trong đó, hai loài nghiên cứu sử dụng làm thuốc phổ biến Thường xuân (Hedera helix L.) Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch.) Thường xuân địa Việt Nam Dây thường xuân có phân bố tương đối hẹp Châu Á ghi nhận xuất số tỉnh vùng núi cao Việt Nam [2] Trong H nepalensis có chứa hợp chất n-hexan ethyl acetate chứng minh có tác dụng chống ung thư, ngồi chứa lupeol, triterpenoid có hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 với tiềm chữa bệnh đái tháo đường [3-5] Không vậỵ, nhiều nghiên cứu chứng minh H nepalensis K Koch có tác dụng bảo vệ thần kinh, chống viêm, giảm đau, chống đông máu chống trầm cảm [5, 6] Với tiềm vậy, song đến Thế giới nghiên cứu H nepalensis K Koch nhìn chung tương đối Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân nhu cầu phát triển thuốc dược liệu ngày tăng cao Phân tích đa dạng di truyền xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguồn gen góp phần giải nhu cầu khai thác hiệu quản lý bền vững nguồn tài nguyên dược liệu Với Dây thường xn, phân loại dựa vào đặc điểm hình thái nhầm lẫn mức độ phân hóa lớn (phần hay thu hái làm thuốc) Ngày nay, ứng dụng sinh học phân tử phương pháp tiếp cận hiệu giúp phân loại thực vật dựa thị DNA Gen GBSSI (Granule-bound starch synthase) hay gọi gen waxy gen nằm nhân có số lượng thấp, mã hóa cho enzym tạo liên kết hạt Đây thị DNA sử dụng thành công để xây dựng phát sinh chủng loại họ Araliaceae châu Á [7] Nhưng thị GBSSI có phải thị tốt để đánh giá đa đạng di truyền loài Dây thường xuân Việt Nam câu hỏi chưa có lời giải Để có thêm thơng tin di truyền Dây thường xuân, bước quan trọng tách chiết DNA tổng số từ tế bào thực vật cách hiệu Có nhiều phương pháp tách chiết kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật lưu hành chưa có nghiên cứu đánh giá phương pháp hiệu mẫu khô Dây thường xn Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu với hai mục tiêu đánh giá hiệu tách chiết DNA tổng số sử dụng quy trình khác bước đầu xây dựng phát sinh chủng loại Dây thường xuân dựa thị GBSSI Bảng Danh sách mẫu thực vật sử dụng nghiên cứu TT Ký hiệu mẫu H1 H2 H3 H4 H5 H6 H15 H16 Địa điểm lấy mẫu Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai Trạm thuốc Sapa, Lào Cai Hồ Thầu, Hoàng Su Phì, Hà Giang Thị trấn Sa Pa, Lào Cai Thị trấn Sa Pa, Lào Cai Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang Tọa độ địa lý 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E 10 H21 HH Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang Vườn Thực vật Hoa Nam, Trung Quốc 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E D.D Long et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu: Mẫu nghiên cứu cung cấp Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Trong đó, 09 mẫu non phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc H nepalensis K Koch 01 mẫu thuộc lồi H helix L (kí hiệu HH) có thơng tin chi tiết Bảng Tách chiết ADN tổng số: DNA phân lập phương pháp Mini-CTAB (SanghaiMaroof cộng sự, 1984) [8], phương pháp CTAB cải tiến (Elias cộng sự, 2004) [9], DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) Chất lượng DNA tổng số đánh giá dựa vào nồng độ DNA thu được, độ tinh thể qua số quang phổ hấp thụ đo bước sóng 260 nm 280 nm khả khuếch đại gen đích thành cơng thơng qua PCR Nhân dòng gen đoạn gen GBSSI PCR: Cặp mồi GBSSI-10F (5’ CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’); GBSSI-11R (5’ CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’) đặt tổng hợp công ty PHUSA Biochem (Việt Nam) sử dụng để nhân đoạn trình tự gen GBSSI [7] Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 91 sau: biến tính 98 ˚C 30 giây; 35 chu kì phản ứng bao gồm 98 ˚C 10 giây, 55,1 ˚C 30 giây, 72 ˚C 30 giây; thời gian kéo dài cuối 72 ˚C 10 phút Sau đó, sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1,5% Các mẫu PCR nhân thành công gen GBSSI tinh gửi giải trình tự Công ty First base (Malaysia) Xử lý phân tích số liệu: Các trình tự DNA kiểm tra, tinh chỉnh xếp (alignment) phần mềm BioEdit version 7.2.6.1 Các trình tự DNA nghiên cứu so sánh phân tích với 13 trình tự thuộc chi Hedera công bố NCBI bao gồm H algeriensis (HQ234505.1), H caucasigena (HQ234539.1), H azorica (HQ234513.1), H canariensis (HQ234518.1), H nepalensis (AY204084.1), H colchica (HQ234524.1), H pastuchovii (HQ234576.1), H rhombea (AY204072.1), H hibernica (HQ234549.1),H cypria (HQ234526.1), H helix (HQ234541.1), H maroccana (HQ234567.1), H sinensis (HQ234572.1) loài thuộc chi Merrilliopanax M chinensis (AY204086.1) M listeri (AY204085.1) Xây dựng phát sinh chủng loại phân tích đa dạng di truyền nguồn gen phần mềm Mega 7.0 theo phương pháp Maximum Likehood Hình Kết PCR nhân dòng gen GBSSI gel agarose 1,5% Làn M: O Gene Ruler Ladder DNA marker, Làn (-): đối chứng âm, kí hiệu H01-H21và HH tên mẫu phân tích 92 D.D Long et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 Kết nghiên cứu Hiệu tách chiết DNA tổng số từ quy trình khác Đánh giá độ tinh nồng độ DNA: Độ tinh DNA tổng số đánh giá thông qua số hấp thụ quang OD260/280 dao động từ 1,8 đến 2,2 (Bảng 2) Kết cho thấy DNA thu phương pháp tách chiết nhiễm protein RNA Phương pháp Mini-CTAB thu hồi lượng DNA nhiều nhất, trung bình 437,4 ng/μL Nồng độ DNA thu từ kit thấp so với quy trình Mini-CTAB CTAB cải tiến khoảng 10 lần thành rẻ DNeasy Plant Mini Kit lần Chính vậy, nghiên cứu GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit kit tách chiết hiệu kinh tế với mẫu khô Dây thường xuân Bảng So sánh kết tách chiết DNA tổng số từ quy trình khác Phương pháp OD260/280 Mini-CTAB (SanghaiMaroof cộng sự, 1984) CTAB cải tiến (Elias cộng sự, 2004) DNeasy Plant Mini Kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit 1,86 ± 0,24 Nồng độ DNA (ng/μl) 437,4 ± 165,8 1,84 ± 0,09 273,6 ± 100,8 1,97 ± 0,23 10,6 ± 7,1 2,23 ± 0,15 13,7 ± 3,9 Đánh giá khả nhân dòng gen đích PCR: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen đích GBSSI với 10 mẫu sử dụng DNA khuôn thu từ phương pháp tách chiết DNA khác thể Hình Có 9/10 mẫu DNA tách từ kit nhân dòng gen đích thành cơng, sản phẩm nhân dòng đồng với băng hình sáng rõ có kích thước khoảng 700 bp Đối với phương pháp CTAB cải tiến, có 5/10 mẫu nhân dòng thành công Mini-CTAB 3/10 mẫu Như vậy, hiệu nhân dòng gen từ mẫu DNA thu từ kit cao 2-3 lần so với mẫu DNA thu từ quy trình CTAB cải tiến mini-CTAB Bên cạnh đó, GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit có giá Hình Cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood đoạn gen GBSSI Đầu nút số bootstrap thể độ tin cậy nhánh Xây dựng phát sinh chủng loại dựa thị GBSSI: 09 mẫu bao gồm H1, H2, H3, H4, H5, H6, H16, H21, HH nhân dòng giải trình tự gen GBSSI thành cơng Phân tích gen cho thấy có 26 nucleotit sai khác mẫu đoạn gen dài 618 bp Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp Maximum Likelihood thể Hình Phương pháp sử dụng mơ hình tham số Tamura (T92) với phân phối Gamma (BIC = 7042,115; AICc = 6657,293; -lnL = 3277,457; R = 1,45), phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu Bàn luận Khơng có phương pháp tách chiết cho tối ưu với tất loài thực vật Các loài thực vật khác cho kết thu hồi DNA khác với phương pháp tách chiết Tế bào thực vật khó thu hồi DNA so với D.D Long et al / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol 35, No (2019) 88-95 tế bào động vật có lớp thành cellulose bao quanh Các polysacharit khó để tách khỏi DNA q trình tách chiết, gây trở ngại cho hoạt động polymerase q trình PCR [10] Chính vậy, phân lập DNA từ mơ thực vật đòi hỏi tham gia carbohydrat enzym giúp cho ly giải thành tế bào Bên cạnh đó, diện polysacharit, polyphenol khác hợp chất thứ cấp khác tế bào đặc biệt tế bào trưởng thành gây trở ngại lớn cho q trình khuếch đại gen PCR [11] Chính vậy, mẫu non tươi thường khuyến cáo sử dụng để thu hồi DNA từ tế bào [12] Nhiều nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu thân H nepalensis saponin Trong đó, hai hợp chất có tác dụng chống ung thư hederagenin 3-O-α-Larabinopyranoside pulsatilla saponin A phân lập phương pháp sắc ký hóa học phương pháp quang phổ vào năm 2015 [13] Ngồi ra, phân tích hóa sinh chứng minh Dây thường xn có chứa nhóm chất khác như: carbohydrat, protein, alkaloid, tanin, flavonoid, terpenoid, hợp chất phenolic phytosterol [14, 15] Trong đó, nhiều hợp chất polysacharit polyphenol chất ức chế phản ứng PCR cắt bẳng enzym giới hạn Do đó, bước quy trình phân tích di truyền chọn phương pháp tách chiết thích hợp với lồi nghiên cứu Trong phân tích thực vật, nồng độ DNA cao khơng phải tiêu chí ưu tiên hàng đầu mà độ tinh DNA Trong đó, số OD260/280 khơng phản ánh đầy đủ nhiễm hợp chất thứ cấp mẫu DNA thu Mẫu DNA phục vụ cho phản ứng PCR yêu cầu độ tinh cao, tạp nhiễm protein, polyphenol Các kit thương mại có ưu điểm nồng độ DNA thu hồi khơng cao có khả loại bỏ hiệu tạp chất polysacharit, protein… Điều giải thích hiệu nhân dòng gen PCR DNA thu từ kit cao hẳn quy trình MiniCTAB CTAB cải tiến Với quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood, mức độ tin cậy đánh 93 giá theo giá trị bootstrap sau: mức độ tin cậy cao: >85%; mức độ tin cậy trung bình: 65-85%; mức độ tin cậy thấp: